RNA干扰抑制高迁移率族蛋白1表达对子宫内膜癌细胞株HEC-1A的增殖抑制作用及对细胞周期和细胞凋亡的影响

目的探讨通过RNA干扰阻滞高迁移率族蛋白1(HMGB1)的表达水平对子宫内膜癌(EC)细胞株HEC-1A中的细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法将细胞分为以下三组:空白对照组(HEC-1A细胞未感染)、阴性对照组(HEC-1A细胞感染无关序列)、干预组(慢病毒转染HEC-1A细胞)。通过Western blot法对三组HEC-1A细胞中的HMGB1蛋白表达水平进行检测,并采用实时荧光定量PCR对HMGB1 mRNA相对表达量进行检测。采用MTT法对HEC-1A细胞增殖情况进行检测,用流式细胞术对HEC-1A细胞周期变化进行检测,同时用Annexin VFITC/PI法对HEC-1A细胞凋亡情况进行检测。采用Western blot法对转染HMGB1-siRNA后细胞cyclin D1、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)及磷酸化Akt(p Akt)蛋白表达进行检测。结果相比空白对照组与阴性对照组,干预组HEC-1A细胞中HMGB1蛋白表达水平显著下降(P 0. 01)。经实时荧光定量PCR检测结果可知相比空白对照组与阴性对照组,干预组HEC-1A细胞中HMGB1 mRNA相对表达量显著下降(P 0. 01)。相比空白对照组、阴性对照组,干预组cyclin D1和p Akt蛋白表达显著下降(P 0. 01);而三组Akt蛋白表达水平的比较,并无显著差异(P 0. 05)。相比空白对照组、阴性对照组,干预组HEC-1A细胞在570 nm波长处的吸光度值显著下降(P 0. 01)。干预组HEC-1A细胞G0/G1期比率在整个细胞周期分布中的比率最高,其较空白对照组、阴性对照组显著升高(P 0. 01);干预组HEC-1A细胞S期比率、G2/M期比率较空白对照组、阴性对照组显著下降(P 0. 01)。干预组HEC-1A细胞凋亡比率较空白对照组、阴性对照组显著升高(P 0. 01)。结论 HMGB1表达降低可有效阻滞EC细胞株HEC-1A的增殖,使得细胞于G0/G1期受阻,同时可有效促进细胞凋亡,其作用机制可能在于降低cyclin D1蛋白表达和干扰磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路。     

lncRNA结肠癌相关转录本2在结肠癌细胞系中的表达水平及对细胞增殖和凋亡的影响研究

目的研究长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录本2(CCAT2)在结肠癌细胞系中的表达水平及对细胞增殖和凋亡的影响。方法标本取自2016年1月至2018年12月南通市中医院收治的55例结肠癌门诊患者。通过体外实验研究,采集结肠癌细胞系HT29、LOVO、SW620、HCT116和正常结肠上皮细胞系NCM460,采用实时荧光定量聚合酶链式反应测定lncRNA-CCAT2的表达情况。取lncRNA-CCAT2在结肠癌中相对表达量最高的细胞系,将其分为空白对照组(磷酸盐吐温缓冲液)、阴性对照组(经Lipofectamine~(TM)2000转染NC-siRNA序列)、CCAT2-siRNA组(经Lipofectamine~(TM)2000转染CCAT2-siRNA序列)。采用MTT实验检测三组细胞增殖能力,用流式细胞术检测CCAT2-siRNA组与阴性对照组细胞凋亡能力。通过蛋白印迹法检测CCAT2-siRNA组与阴性对照组细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、裂解型聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)及p53蛋白的表达水平。结果相比正常结肠上皮细胞系NCM460,结肠癌细胞系HT29、LOVO、SW620、HCT116中lncRNA-CCAT2相对表达量均明显上调(P 0. 05),其中SW620的表达量最高。经MTT实验显示,转染后0、1、2 d,CCAT2-siRNA组与阴性对照组、空白对照组于490 nm波长处的吸光度值(OD_(490nm))比较,均无显著差异(P 0. 05);转染后3、4 d,CCAT2-siRNA组OD_(490nm)较阴性对照组、空白对照组明显下降(P 0. 01);阴性对照组与空白对照组不同时间点OD_(490nm)值的比较,均无显著差异(P 0. 05)。流式细胞术检测显示,相比阴性对照组,CCAT2-siRNA组细胞凋亡率明显升高(P 0. 01)。CCAT2-siRNA组Bcl-2蛋白的表达水平明显低于阴性对照组,裂解型PARP和p53蛋白的表达水平明显高于阴性对照组(P 0. 01)。结论 lncRNA-CCAT2高表达于结肠癌细胞系,而通过敲低lncRNA-CCAT2的表达可起到阻滞结肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡的作用,并且其作用机制与Bcl-2蛋白表达降低、裂解型PARP和p53蛋白表达升高可能存在密切关系。     

下调STC2基因表达对前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响研究

目的探讨抑制斯钙素-2(stanniocalcin-2,STC2)基因表达对前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响。方法通过Lipofectamine TM2000脂质体介导法将siRNA阴性对照组和STC2-siRNA组转染人前列腺癌PC-3细胞,未转染的细胞作为空白对照组,48 h后收集细胞,Western bloting检测各组细胞中STC2的蛋白表达;CCK8及流式细胞仪分别检测细胞的增殖及凋亡情况;Western bloting检测增殖相关蛋白ki67、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)家族Bcl-2和Bcl-2相关X蛋白(Bax)及PI3K/AKT信号通路磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(pAKT)的蛋白表达。结果 STC2-siRNA转染PC-3细胞后STC2的蛋白表达显著低于空白对照组(P0.05);阴性对照组细胞OD值及细胞凋亡率与空白对照组差异无统计学意义(P0.05),而STC2-siRNA组细胞OD值显著低于空白对照组,凋亡率显著高于空白对照组(P0.05);阴性对照组ki67、Bcl-2、Bax、PI3K和p-AKT蛋白表达与空白对照组差异无统计学意义(P0.05),STC2-siRNA组ki67、Bcl-2、PI3K和p-AKT蛋白表达均显著低于空白对照组,Bax蛋白表达显著高于空白对照组(P0.05)。结论 STC2基因表达的抑制可降低前列腺癌细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,其机制与调节ki67、Bcl-2、Bax及PI3K/AKT信号通路表达有关。     

Gadd45α mRNA和蛋白在子痫前期胎盘组织中表达及转染siRNA对滋养细胞侵袭能力及侵袭相关分子的影响

目的分析生长阻滞和DNA损伤45α(Gadd45α)蛋白和mRNA在子痫前期(PE)胎盘组织中的表达情况及转染siRNA对滋养细胞侵袭能力及侵袭相关分子的影响。方法回顾性选取咸宁市中心医院收治的40例PE胎盘组织为病例组,30例正常胎盘组织为对照组。通过免疫印迹法对两组Gadd45α蛋白表达水平进行检测,并用实时荧光定量PCR法对两组Gadd45α mRNA的相对表达量进行检测。对滋养细胞HTR8/Svneo进行培养,以转染阴性对照的siRNA为对照siRNA组,转染Gadd45α的siRNA为Gadd45α-siRNA组。在转染Gadd45α的siRNA后对滋养细胞侵袭数量和侵袭相关分子基质金属蛋白酶(MMPs)的表达水平进行检测。结果相比对照组,病例组Gadd45α蛋白表达水平明显升高(P 0. 01),Gadd45α mRNA的相对表达量明显上调(P 0. 01)。相比对照siRNA组,Gadd45α-siRNA组滋养细胞HTR8/Svneo中Gadd45α蛋白表达水平显著下降(P 0. 01),Gadd45α mRNA的相对表达量亦显著下调(P 0. 01)。随着转染siRNA时间的增加,对照siRNA组与Gadd45α-siRNA组细胞侵袭数量明显增多(P 0. 05);相比对照siRNA组,Gadd45α-siRNA组同时间点滋养细胞HTR8/Svneo侵袭数量明显增多(P 0. 01)。相比对照siRNA组,Gadd45α-siRNA组滋养细胞HTR8/Svneo侵袭相关分子MMP-1、MMP-2、MMP-3及MMP-9的表达水平均显著升高(P 0. 05)。结论 Gadd45α高表达于PE胎盘组织,而通过阻滞滋养细胞HTR8/Svneo中Gadd45α的表达水平可诱导细胞侵袭,提高侵袭相关分子MMPs的表达量。     

Six1基因对As_2O_3诱导的口腔鳞癌细胞凋亡和ROS水平的影响研究

目的探讨Six1 siRNA或三氧化二砷(As_2O_3)对口腔鳞癌细胞活力、凋亡及活性氧(ROS)水平的影响。方法实验分为空白对照组(无需处理)、Six1-siRNA组(细胞转染Six1的特异性siRNA)、As_2O_3组(终浓度为5μmol/L As_2O_3处理细胞)和Six1-siRNA+As_2O_3组(Six1-siRNA及As_2O_3共同处理细胞) 4个组,siRNA转染参照Lipofectamine TM 2000说明。人口腔鳞癌CAL-27细胞处理48 h,Western blotting检测Six1及Wnt/β-catenin信号相关的β-catenin、Cyclin Dl和Survivin的蛋白表达。CCK8及流式细胞术分别检测细胞活力、凋亡率及ROS含量。结果 Six1siRNA的转染可明显降低CAL-27细胞Six1的蛋白表达,与空白对照组比较差异具有统计学意义(P 0. 05)。与空白对照组比较,Six1-siRNA组和As_2O_3组细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,ROS含量明显升高,β-catenin、Cyclin Dl和Survivin的蛋白表达明显降低(P 0. 05),而联合使用的细胞活力及β-catenin、Cyclin Dl和Survivin的蛋白表达均显著低于Six1-siRNA组和As_2O_3组,凋亡率及ROS含量高于Six1-siRNA组和As_2O_3组(P 0. 05)。结论 Six1-siRNA可增加As_2O_3对口腔鳞癌细胞凋亡的诱导,机制与增加细胞ROS水平及下调Wnt/β-catenin信号有关。     

槲皮素与FSCN1基因siRNA联合对卵巢癌生长抑制及免疫功能的影响研究

目的探讨槲皮素与FSCN1基因siRNA对卵巢癌细胞活力、凋亡及免疫功能的影响及机制。方法人卵巢癌SKOV3细胞分为空白对照组、NC组(转染阴性对照siRNA)、槲皮素组(50μmol/L的槲皮素处理细胞后瞬时转染阴性对照siRNA)、si-FSCN1组(细胞转染靶向抑制FSCN1的siRNA)和槲皮素+si-FSCN1组(50μmol/L的槲皮素处理细胞后瞬时转染靶向抑制FSCN1的siRNA),siRNA转染参照Lipofectamine TM 2000说明。各组细胞处理48 h,Western blotting检测FSCN1、β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、Bax和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达;MTT检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 SKOV3细胞转染si-FSCN1后FSCN1蛋白表达明显降低,与空白对照组比较差异显著(P0.05)。槲皮素组和si-FSCN1组细胞活力及β-catenin、cyclin D1和VEGF的蛋白表达均显著低于NC组,高于槲皮素+si-FSCN1组,细胞凋亡率及Bax蛋白表达显著高于NC组,低于槲皮素+si-FSCN1组(P0.05)。结论槲皮素或FSCN1基因siRNA均能抑制卵巢癌细胞活力,诱导细胞凋亡,抑制免疫抑制因子VEGF表达,联合使用效果更强,机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

大鼠缺血下肢血管新生过程中人血管内皮细胞生长因子165和人血管形成素的协同效应

目的：观察肌肉转染腺病毒(adenovirus，Ad-)携带的人血管内皮细胞生长因子-165（vascular endothelial grow factor，Ad-VEGF165)和人血管形成素-1(angiopoietin-1，Ad-Ang-1)基因对大鼠缺血下肢的生血管效应。方法：用SD雄性大鼠84只，分为7个组，每组12只，分别为正常组、假手术组、结扎组、绿色荧光蛋白(given fluorescence protein，GFP)组(作为病毒对照组)、Angl组、VEGF165组、Angl+VEGF165组。制作大鼠下肢血管闭塞模型，肌肉内注射Ad-VEGFm或／和Ad-Ang-1，以Western法检测生长因子蛋白表达、免疫组化检测基因导入后在缺血肌肉引起的效应。结果：①肌肉经注射Ad-VEGF165和Ad-Angl后高表达人VEGF165蛋白和人Angl蛋白。②术后7d处理组与对照组新生毛细血管数目无明显差别。但术后14d和21dAngl和VEGF165组的毛细血管／骨骼肌纤维数目比明显高于对照组(F=24．53，P&;lt;0．01)，VEGF165+Angl两因子合用组明显高于单用组(F=12．22，P&;lt;0．01)。③VEGF165组及VEGF165+Angl合用组出现大量包围着一厚层平滑肌肌动蛋白a(smooth muscle actin，a-SMA)阳性平滑肌细胞的血管，其数量与肌肉数比值明显高于对照组(F=9．73，P&;lt;0．01)。④因子单用组和合用组肌肉内出现大量BrdU阳性细胞浸润，部分细胞表面呈现C-Kit阳性，新生血管内皮细胞中也有C-Kit阳性标记(F=9．73～35．10，P&;lt;0．01)。结论：①Ad-VEGF165和Ad-Angl能促进缺血肢体血管新生，两者合用的生血管效应更为显著。②VEGF165，能促进包被平滑肌细胞的形似微小动脉的血管数量增多。③肌肉血管新生增加除了血管生成作用外，可能还有血管发生的参与。     

KLF8基因对胃癌细胞增殖凋亡的影响及机制研究

目的探讨Krüppel样转录因子8(KLF8)基因对胃癌细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 Western blot检测胃癌组织及相应的癌旁组织中KLF8基因的蛋白表达;将NC-siRNA(阴性对照组)和KLF8-siRNA(RNA干扰组)转染至人胃癌SGC-7901细胞,未经任何处理的细胞作为空白对照组,转染48 h后,Western blot检测KLF8的蛋白表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测Ki67、PCNA、Cleaved caspase3、Notch1、Hes1蛋白表达。结果与癌旁组织比较,胃癌组织中KLF8的蛋白表达显著升高(P0.01);与对照组比较,NC-siRNA组KLF8的蛋白表达无明显变化(P0.05),KLF8-siRNA组KLF8蛋白表达显著降低(P0.01);与对照组及NC-siRNA组比较,KLF8-siRNA组细胞存活率及Ki67、PCNA、Notch1、Hes1蛋白表达显著降低,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著升高(P0.01)。结论 RNA干扰抑制KLF8的表达可显著降低SGC-7901细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制与Notch1信号通路的调控有关。     

血管内皮细胞生长因子基因体外转染小鼠NIH3T3细胞的生物活性

目的：用基因工程方法改造成纤维细胞，使其分泌血管内皮细胞生长因子，观察成纤维细胞作为基因转染的靶细胞的可行性。 方法：实验于2005-11在解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒的扩增、提取、纯化和鉴定后，将培养14d细胞融合约80％的小鼠NIH3T3细胞在24孔板中进行转染，细胞随机分为3组，每组10孔，分别为PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组．空质粒转染组和不转染质粒组。采用免疫组织化学化学检测血管内皮细胞生长因子表达。ELISA方法检测血管内皮细胞生长因子外分泌。四甲基偶氮唑盐法检测小鼠NIH3T3细胞对PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染的敏感性。 结果：①PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒的基因测序结果显示序列正确。②免疫组织化学染色显示：小鼠NIH3T3细胞转染4d后胞浆内可观察到阳性表达产物，对照组呈阴性结果。③ELISA检测结果：小鼠NIH3T3细胞转染14d后，PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组3组培养上清中血管内皮细胞生长因子浓度分别346&;#177;23，0，0ng／L（P〈0．05）。④四甲基偶氮唑盐法检测结果：PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组所测的490nm的A值比较差异均无显著性（依次为0．96&;#177;0.11，0．91&;#177;0．10，0．98&;#177;0．16，P〉0．05）。PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染对小鼠NIH3T3细胞增殖无影响。 结论：小鼠NIH3T3细胞可作为血管内皮细胞生长因子基因转染的靶细胞，用于基因治疗。     

CD、VEGFR-1基因对恶性胶质瘤细胞和血管内皮细胞共培养体系中VEGF表达及细胞增殖的影响

目的研究胞嘧啶脱氨酶(CD)、血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1)基因共表达质粒对恶性胶质瘤细胞和血管内皮细胞共培养体系血管内皮生长因子(VEGF)表达及细胞增殖的抑制作用。方法转染组:CD基因、VEGFR-1基因共表达质粒p EGFP-C1-CD-VEGFR-1转染人血管内皮细胞共培养体系中的人恶性胶质瘤细胞,未转染组:未做细胞转染,对照组:转染空载体。酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测培养液上清中VEGF含量,原位杂交及免疫组化检测细胞VEGFmRNA及VEGF的表达,通过流式细胞术观察其对细胞活性的影响。结果转染后转染组细胞VEGFmRNA为0. 62±0. 06,VEGF为0. 42±0. 04,较未转染组及对照组显著降低,培养液中VEGF含量为60. 34±31. 22,较未转染组及对照组显著降低,细胞活性受到抑制,流式细胞术发现转染组细胞的G1期细胞比率明显高于未转染组及对照组,细胞出现凋亡。结论 CD、VEGFR-1基因共表达质粒可抑制恶性胶质瘤细胞和血管内皮细胞共培养体系中VEGFmRNA及VEGF的表达,抑制细胞活性、诱导细胞凋亡。     

以RNAi慢病毒为载体下调CD59对急性T系白血病Jurkat细胞株的表达影响

目的:分析以RNAi慢病毒为载体下调CD59基因表达对急性T系白血病Jurkat细胞株的表达影响。方法:通过RNAi慢病毒作为载体,诱导急性T系白血病Jurkat细胞株中的CD59表达降低;采用激光共聚焦技术分析RNAi慢病毒转染情况和CD59分子的定位情况;应用实时荧光定量PCR法检测空白对照组、阴性对照组和RNAi慢病毒转染组中CD59 mRNA的相对表达量;用酶联免疫吸附试验法测定3组细胞培养上清中肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和白介素-3(IL-3)的表达,用免疫印迹法(Western blot)测定3组细胞中凋亡相关分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、生存素(Survivin)、B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)及BCL-2相关X蛋白(BAX)蛋白表达水平。结果:Jurkat细胞转染效率高于90%,CD59主要定位于细胞膜中。相比空白对照组和阴性对照组,RNAi慢病毒转染组中CD59 mRNA表达明显下调(P 0. 05)。RNAi慢病毒转染组中CD59蛋白表达水平较空白对照组和阴性对照组明显降低(P 0. 05)。相比空白对照组和阴性对照组,RNAi慢病毒转染组中TNF-β表达水平明显升高,IL-3表达水平明显降低(P 0. 05)。RNAi慢病毒转染组Survivin和BCL-2表达水平较空白对照组和阴性对照组明显降低,Caspase-3和BAX蛋白表达较空白对照组和阴性对照组明显升高(P 0. 05)。结论:通过转染RNAi慢病毒载体促使CD59基因表达下调可降低急性T系白血病Jurkat细胞株中促增殖分化相关分子IL-3的表达,提高肿瘤坏死相关因子TNF-β的表达,同时可提高细胞中促凋亡相关蛋白Caspase-3和BAX的表达,降低抗凋亡蛋白Survivin和BCL-2的表达。     

过表达DACT1通过调节凋亡相关蛋白对人白血病细胞增殖的抑制作用研究

目的研究过表达DACT1通过调节凋亡相关蛋白对人白血病细胞增殖的抑制作用。方法在人白血病K562细胞中,通过基因转染试剂对空载质粒vector与DACT1质粒分别进行转染,分别作为阴性对照组与观察组,并使DACT1呈现过表达。另设置一组未经任何处理的细胞为空白对照组。通过流式细胞术、CCK-8法对DACT1过表达后K562细胞周期、增殖、凋亡的影响进行检测。并采用Western blot法对DACT1过表达后调节凋亡相关蛋白的表达进行检测。结果观察组克隆形成率为(6. 33±0. 98)%,较空白对照组(20. 74±3. 12)%、阴性对照组(20. 43±3. 32)%均明显降低(P 0. 05)。细胞增殖实验结果发现,观察组细胞增殖活性较空白对照组、阴性对照组均显著降低。观察组细胞凋亡率为(28. 97±3. 04)%,较空白对照组(0. 85±0. 12)%、阴性对照组(0. 83±0. 09)%均显著升高(P 0. 05)。观察组细胞G0/G1期比例较空白对照组、阴性对照组显著增加(P 0. 05)。观察组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)等促凋亡蛋白表达较空白对照组和阴性对照组均显著上调,而B淋巴细胞癌-2(Bcl-2)等抗凋亡蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组均显著降低。结论在人白血病K562细胞中,DACT1过表达可阻滞细胞增殖,促使细胞凋亡,亦会影响细胞周期,使得细胞出现G0/G1期阻滞。分析其原因,可能与DACT1过表达具有潜在的抗肿瘤作用,其作用机制可能与上调促凋亡蛋白(caspase-3、caspase-9、Bcl-2)表达和抑制抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达密切相关。     

多发性骨髓瘤细胞和正常浆细胞miR-373表达水平及其对肿瘤生长的影响

目的分析多发性骨髓瘤细胞和正常浆细胞microRNA-373(miR-373)表达水平及其对肿瘤生长的影响。方法回顾性收集江苏大学附属句容医院收治的36例多发性骨髓瘤患者为病例组,另同期选取30例于该院健康体检者为对照组。采用实时荧光定量PCR法测定病例组细胞与对照组正常浆细胞中miR-373的表达量。通过Lipofectamine-2000将miR-373模拟物(转染miR-373组)或相应的阴性对照(阴性对照组)转染为H929细胞。分析H929细胞中细胞增殖、细胞周期和凋亡及肿瘤生长的情况。结果实时荧光定量PCR法检测结果显示,病例组细胞中miR-373的相对表达量(0. 40±0. 04)较对照组正常浆细胞的水平(1. 02±0. 05)显著下降(P 0. 01)。细胞增殖实验表明,相比阴性对照转染的H929细胞,经转染miR-373模拟物的H929细胞中miR-373表达明显升高(P 0. 01)。细胞周期实验结果发现,相比阴性对照组,转染miR-373组的H929细胞在S期的细胞百分比较低,而在G0/G1期的细胞百分比较高(P 0. 01)。细胞凋亡实验结果发现,相比阴性对照组,转染miR-373组的H929细胞凋亡率明显增高(P 0. 01)。小鼠成瘤实验表明,miR-373的过表达可通过下调叉头框蛋白M1(FOXM1)表达以明显阻滞肿瘤生长(P 0. 01)。结论 miR-373可通过调节FOXM1表达以发挥有效阻滞多发性骨髓瘤肿瘤生长的作用,提示其对多发性骨髓瘤的临床治疗具有重要意义。     

DNMT1基因沉默对前列腺癌细胞增殖、 凋亡及GSTP1、SHOX2、DAPK甲基化状态的影响

目的探讨siRNA技术沉默DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因表达对前列腺癌细胞(LNCap)增殖、凋亡的影响,初步分析其对谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)、矮小同源盒基因2(SHOX2)、凋亡相关蛋白激酶(DAPK)甲基化状态的影响。方法体外培养人前列腺癌细胞LNCap、正常前列腺上皮细胞RWPE-1,采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)及蛋白印迹(WB)检测细胞中DNMT1 mRNA及蛋白表达水平。实验分为3组:空白对照组(未经任何处理LNCap细胞); si-NC组(转染DNMT1阴性对照质粒的LNCap细胞); si-SH2B1组(转染si-DNMT1的LNCap细胞)。采用CCK-8法检测三组细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡水平。采用甲基化特异性PCR (MSP)检测GSTP1、SHOX2、DAPK基因甲基化状态; qRT-PCR与WB法分别检测各组LNCap细胞DNMT1、GSTP1、SHOX2、DAPK mRNA及蛋白表达情况。结果与正常组细胞相比,前列腺癌组细胞中DNMT1 mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P 0. 05);si-DNMT1组DNMT1 mRNA及蛋白表达水平均显著低于空白对照组、si-NC组(P 0. 05);与空白对照组、si-NC组相比,si-DNMT1组LNCap细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、GSTP1、SHOX2、DAPK mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P0. 05);与空白对照组、si-NC组相比,si-DNMT1组GSTP1、DAPK、SHOX2基因甲基化水平均显著降低(P 0. 05)。结论沉默DNMT1基因后可明显抑制LNCap细胞增殖并促使其凋亡,其可能通过逆转GSTP1、DAPK、SHOX2甲基化状态并上调其表达而发挥作用。     

miR-543调控肾透明细胞癌细胞增殖和侵袭的机制分析

目的探讨与分析miR-543调控肾透明细胞癌(CCRCC)细胞增殖和侵袭的机制。方法 CCRCC细胞系ACHN随机分为三组:空白组、阴性对照(NC)组与miR-543组,NC组与miR-543组分别转染照NC与miR-543模拟剂,空白组不进行转染。MTT检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Transwell检测细胞转移与侵袭比率,Western blot检测蛋白表达水平。结果转染后24 h与48 h,与NC组与空白组相比,miR-543组的细胞增殖抑制率显著增加(P0. 05),细胞凋亡率显著增加(P 0. 05),细胞转移与侵袭相对数显著降低(P 0. 05),SDF-1、CXCR7蛋白相对表达量显著降低(P 0. 05),NC组与空白组比较差异无统计学意义(P 0. 05)。且miR-543对细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、细胞转移与侵袭、SDF-1和CXCR7蛋白相对表达量的影响均不具有时间依赖性。结论 miR-543能抑制调控肾透明细胞癌细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡,且不具有时间依赖性,其作用机制可能与抑制SDF-1/CXCR7表达有关。     

hVEGF165基因转染后骨髓间充质干细胞蛋白分泌功能及成骨活性的检测

目的：血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管再生和骨组织再生过程中起着重要的调节作用。观察hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能及转染后细胞的成骨活性。 方法：实验于2004—07／2005—12在江苏省血液研究所国家重点实验室完成。①体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞，传代培养后以1μg PcDNA3．1-hVEGF165：3μL阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染，通过免疫组织化学SP方法检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。②体外分离、培养大鼠肾微血管内皮细胞，分别加入hVEGF165基因转染48h及1周后细胞上清、空载体转染及未转染组细胞上清，MTT法观察细胞增殖情况，以了解转染后细胞培养上清中VEGF的生物学活性。③测定在正常条件培养和成骨条件培养下，转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。 结果：①hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF蛋白。②hVEGF165基因转染48h组大鼠肾微血管内皮细胞A值高于空载体转染及未转染组（P〈0．05），但低于hVEGF165基因转染1周组。③成骨条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组（P〈0．05）；而在正常条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。 结论：①采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF，且这种生物学活性呈剂量依赖性。②在成骨条件培养下，转染hVEGF165基因后骨髓间充质干细胞的成骨能力增强。     

血管内皮细胞生长因子基因体外转染小鼠NIH3T3细胞的生物活性

目的:用基因工程方法改造成纤维细胞,使其分泌血管内皮细胞生长因子,观察成纤维细胞作为基因转染的靶细胞的可行性。方法:实验于2005-11在解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒的扩增、提取、纯化和鉴定后,将培养14d细胞融合约80%的小鼠NIH3T3细胞在24孔板中进行转染,细胞随机分为3组,每组10孔,分别为PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组。采用免疫组织化学化学检测血管内皮细胞生长因子表达。ELISA方法检测血管内皮细胞生长因子外分泌。四甲基偶氮唑盐法检测小鼠NIH3T3细胞对PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染的敏感性。结果:①PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒的基因测序结果显示序列正确。②免疫组织化学染色显示:小鼠NIH3T3细胞转染4d后胞浆内可观察到阳性表达产物,对照组呈阴性结果。③ELISA检测结果:小鼠NIH3T3细胞转染14d后,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组3组培养上清中血管内皮细胞生长因子浓度分别346±23,0,0ng/L(P<0.05)。④四甲基偶氮唑盐法检测结果:PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组所测的490nm的A值比较差异均无显著性(依次为0.96±0.11,0.91±0.10,0.98±0.16,P>0.05)。PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染对小鼠NIH3T3细胞增殖无影响。结论:小鼠NIH3T3细胞可作为血管内皮细胞生长因子基因转染的靶细胞,用于基因治疗。     

真核表达载体血管内皮生长因子转染血管内皮细胞及对新生血管形成的影响

背景:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)能与存在内皮细胞表面的特异性受体结合,刺激体内新生血管形成,但在体内半衰期极短,在移植局部难以维持足够的浓度,限制了其临床应用.目的:观察VEGF与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent,EGFP)共表达载体转染对大鼠血管内皮细胞形成新生血管的影响.设计、时间及地点:随机分组设计、对照动物实验,于2004-09/2005-01在中国医科大学附属第一医院器官移植实验室完成.材料:30只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为3组,每组10只.质粒pIRES2-EGFP/VEGF165由第四军医大学提供.方法:采用层析法大量提取pIRES2-EGFPNEGF165质粒,采用阳性脂质体法进行转染,计数1×106血管内皮细胞植入雄性Wiser大鼠肾被膜下.实验组:植入转染质粒pIRES2-EGFP/VEGF165的内皮细胞:空白转染组:植入转染质粒pIRES2-EGFP的内皮细胞:对照组:植入正常大鼠血管内皮细胞.主要观察指标:①转染72 h后观察EGFP及VEGF表达情况.②流式细胞仪检测转染效率.③植入后14 d苏木精-伊红染色观察植入血管内皮细胞处组织形态学变化.结果:30只大鼠均进入结果分析.①荧光显微镜下实验组内皮细胞有特异性的EGFP表达.②流式细胞仪分析转染效率为13.06%.③实验组血管内皮细胞胞核和胞浆中均有VEGF表达.反转录-聚合酶链反应显示实验组大鼠血管内皮细胞中有人源化VEGF165基因在mRNA水平表达.④移植后14 d.实验组大鼠肾被膜下可见成团的新生毛细血管网形成,而对照组及空白转染组虽血管内皮细胞仍存活,但未形成明显血窦.结论:转染VEGF基因是促进内皮细胞早期(14d内)形成新生血管的有效途径.     

MiR-543对人白血病细胞株K562增殖与凋亡的调控及其机制研究

目的:探讨miR-543对人白血病细胞株K562增殖与凋亡的调控作用及其机制。方法:选择2018年2月-2018年9月在本院接受治疗的CML患者46例(男性27例,女性19例)作为CML组,同时选择30例同期体检健康者作为对照组。利用Lipofectamine 2000脂质体将miR-543模拟物(mimic)及阴性对照mimic转染至K562细胞后,应用CCK8方法检测miR-543对K562细胞增殖的影响,荧光素酶报告法分析miR-543对Wnt基因的靶向关系,流式细胞术检测miR-543对白血病细胞凋亡影响,Western blot方法检测Wnt、β-catenin、BCL-2、C-Myc及BAX表达水平。结果:慢性髓系白血病患者的miR-543水平显著低于健康对照组(P 0.05);miR-543 mimic组的miR-543的表达水平显著高于空白对照组(P 0.05);miR-543 mimic组的Wnt基因mRNA水平显著低于空白对照组(P 0.05)。miR-543 mimic可降低Wnt野生质粒的荧光素酶表达水平(P 0.05);miR-543 mimic对Wnt突变质粒的荧光素酶表达水平无抑制作用(P 0. 05)。miR-543 mimic组K562细胞增殖水平显著低于空白对照组及阴性对照scramble mimic组(P 0. 05)。miR-543 mimic组K562细胞凋亡水平显著高于空白对照组及阴性对照scramble mimic组(P 0. 05)。miR-543 mimic组细胞的Wnt、β-catenin、BCL-2及C-Myc蛋白水平均显著低于空白对照组及阴性对照(scramble mimic)组(P 0.05);miR-543 mimic组的BAX蛋白水平高于空白对照组及阴性对照(scramble mimic)组(P 0.05)。结论:miR-543可靶向Wnt蛋白,抑制Wnt信号通路活性,从而抑制白血病细胞的增殖能力,提高细胞凋亡水平。     

血管内皮生长因子对心肌细胞移植治疗心肌梗死有改善血供作用

目的：探讨腺病毒介导血管内皮生长因子165基因（AdVEGF165）转染的乳鼠心肌细胞移植对慢性心梗（MI）大鼠一心功能的影响。方法：体外培养新生大鼠心室肌细胞、标记BrdU、转染AdVEGF165基因；收集培养液上清，ELISA法检测转染细胞VEGF的表达。结扎同种大鼠前降支建立心梗模型，4周后将心梗大鼠随机分为3组。分别注射移植转染心肌细胞（组Ⅰ）、单纯心肌细胞（组Ⅱ）、和DMEM培养基（组Ⅲ）。超声心动图检测移植前厦移植4周后的心功能。处死大鼠，留取心脏标本作HE病理染色厦免疫组化检测，并计数血管密度。结果：AdVEGF165基因转染的心肌细胞表达VEGF升高，较对照组有显著差异（P〈0．01）；超声检测心功提示转染细胞组（组Ⅰ）心功能较其他2组显著改善（P〈0．01）；免疫组化检测显示，移植细胞在移植区存活；HE染色血管计数显示转染组（组Ⅰ）有更多的新生血管形成（P〈0．01）。结论：AdVEGF165基因转染心肌细胞后表达分泌VEGF增加，可促进梗死区新生血管形成，改善心肌血供，有利于移植细胞的存活，能更好的改善心功能。