CDK2、p21和p27在生长激素腺瘤中的表达及CDK2抑制剂的体外应用

目的分析细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期调节因子p21和p27在生长激素腺瘤中的表达水平,观察CDK2抑制剂环O6-己基甲基鸟嘌呤(O6)对GH3细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法构建包含3例垂体和46例腺瘤标本的组织芯片,按Knosp分级将肿瘤分为侵袭组(n=15)和非侵袭组(n=31),免疫组织化学技术分析CDK2、p21和p27的蛋白水平,结合随访信息分析其与临床特性的关系。GH3细胞分为O6组(0. 4μmol/L和4μmol/L)和二甲基亚砜组(DMSO),细胞增殖实验MTS法检测细胞活力; Annexin V实验检测细胞凋亡; Brdu实验检测细胞周期,Western blotting实验检测CDK2、p21和p27变化。结果腺瘤标本中CDK2、p21和p27的H-score评分分别为(104. 8±28. 3)分、(195±39. 2)分、(158. 8±32. 3)分,CDK2在侵袭组表达较非侵袭组明显增高[(140±31. 7)分vs.(87. 8±26. 7)分],p21[(152. 3. 1±35. 2)分vs.(215. 7±41. 2)分]和p27[(118. 1±28. 4)分vs.(173. 7±34. 3)分]则明显降低(P 0. 05)。O6处理GH3细胞后,细胞活力与DMSO组相比,不同剂量O6处理组细胞活力分别为DMSO组的(84. 5±7. 6)%和(76. 2±7. 1)%(24 h)、(75. 7±7. 3)%和(69. 6±6. 2)%(48 h)、(70. 2±6. 4)%和(61. 3±5. 5)%(72 h)。处理24 h后,O6组Annexin V阳性细胞分别为(8. 86±1. 78)%(P 0. 05)和(19. 36±4. 20)%(P 0. 01),而DMSO组为(3. 35±0. 73)%,PI阳性则分别为(3. 82±0. 53)%(P 0. 05)、(10. 14±2. 65)%(P 0. 01)和(1. 34±0. 33)%。Brdu实验显示,O6将GH3细胞阻滞在G1期,分别为(50. 4±4. 1)%和(59. 4±4. 7)%(P 0. 05),DMSO组为(45. 7±3. 7)%。同时,蛋白印迹实验显示,O6处理后p21和p27呈现升高趋势(P 0. 05)。结论 CDK2、p21和p27表达与生长激素腺瘤侵袭密切相关,其抑制剂O6-己基甲基鸟嘌呤诱导GH3细胞凋亡,抑制细胞增殖。     

RNA干扰神经膜蛋白2基因表达对骨肉瘤细胞生物学特性的影响

目的探究神经膜蛋白2(NRSN2)对骨肉瘤U2-OS细胞增殖、侵袭、迁移的影响以及作用机制。方法实验分为对照组、siRNA阴性组、siRNA-NRSN2组。对照组为常规培养的细胞,siRNA阴性组和siRNA-NRSN2组通过siRNA技术干扰骨肉瘤细胞中NRSN2基因的表达,分别将siRNA-NC和siRNA-NRSN2转染入U2-OS细胞。CCK-8实验检测干扰NRSN2基因表达对细胞增殖的影响。Transwell小室法检测干扰NRSN2对骨肉瘤U2-OS细胞侵袭、迁移的影响。采用免疫印迹试验(Western Blot)检测NRSN2、钙黏蛋白E(E-cadherin)、钙黏蛋白N(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)水平。结果与对照组相比,siRNA-NRSN2组U2-OS细胞中NRSN2蛋白的表达量显著降低(P0.05)。干扰NRSN2表达显著抑制U2-OS细胞增殖(P0.05),降低其侵袭、迁移能力(P0.05),显著增加Ecadherin蛋白水平,明显降低N-cadherin、Vimentin蛋白水平(P0.05)。结论干扰NRSN2通过抑制上皮-间质转化(EMT)的发生,阻碍骨肉瘤U2-OS细胞的增殖、侵袭、迁移。     

PRPS2在宫颈癌组织中的表达水平及抑癌机制分析

目的 分析磷酸核糖焦磷酸合成酶2(PRPS2)在宫颈癌中的表达情况及抑癌作用。方法 上海市崇明区第三人民医院采集的66例宫颈癌患者癌组织及20份癌旁组织(距癌组织> 1 cm)标本,免疫组化法检测宫颈癌组织及癌旁组织PRPS2表达;并选择宫颈癌He La细胞,脂质体转染PRPS2小干扰序列(He La-PRPS2组),并设计He La-NC对照组(转染无关siRNA序列)。蛋白印迹法(WB)测定PRPS2干扰效率,四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞增殖情况,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,流式细胞仪测定细胞凋亡情况,总结PRPS2抑癌机制。结果 ①宫颈癌癌组织PRPS2阳性率为75. 76%,高于癌旁组织25. 00%(P <0. 05);②He La-PRPS2组PRPS2蛋白表达量低于He La-NC对照组(P <0. 05);③He La-NC对照组干扰不同时间增殖活性均高于He La-PRPS2组(P <0. 05);④He La-NC对照组穿膜细胞比率高于He La-PRPS2组(P <0. 05);⑤转染后He La-NC对照组G0/G1期细胞比率高于He La-PRPS2组(P <0. 05),G2/M期细胞比率低于He La-PRPS2组(P <0. 05),细胞凋亡率低于He La-PRPS2组(P <0. 05)。结论宫颈癌癌组织PRPS2呈过表达,沉默宫颈癌细胞株He La PRPS2表达后细胞增殖、侵袭能力降低,细胞凋亡率增加,推测沉默PRPS2表达存在抑癌效应。     

黄芪多糖逆转吉非替尼获得性耐药肺腺癌细胞的作用研究

目的探究黄芪多糖逆转吉非替尼获得性耐药肺腺癌细胞的作用。方法采用CCK8实验观察吉非替尼与黄芪多糖单用及联用对获得性耐药肺腺癌细胞PC9/EMT增殖活性的影响; qRT-PCR、Western blotting检测发生上皮间质转化(EMT)后E-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白的变化。结果 TGF-β1(10 ng/ml,120 h)作用于PC9细胞后,形态呈梭形改变,细胞连接疏松,并且表现出了EMT特征:E-cadherin的mRNA及蛋白表达水平降低,同时Vimentin的mRNA及蛋白表达水平升高(P 0. 05)。吉非替尼的IC50值明显升高,说明吉非替尼对PC9/EMT细胞抑制能力明显减弱,证实其产生耐药性(P 0. 01)。黄芪多糖联合吉非替尼组对PC9/EMT细胞增殖抑制效应优于吉非替尼组,协同增效作用明显(P 0. 05);两药联用明显逆转PC9细胞EMT的发生,间质细胞相关蛋白Vimentin表达水平降低(P 0. 05),上皮细胞相关蛋白E-cadherin表达水平升高(P 0. 05)。结论黄芪多糖可显著抑制吉非替尼获得性耐药肺腺癌PC9细胞的增殖,抑制其EMT转化。     

miR-145-3p通过下调CDK1抑制骨肉瘤MG-63细胞系的增殖、侵袭与凋亡

目的研究mircoRNA-145-3p(miR-145-3p)对骨肉瘤细胞系MG-63细胞的增殖、侵袭与凋亡的调控作用。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别测定miR145-3p在MG-63细胞与人成骨细胞系hFOB1.19细胞中的表达水平。将MG-63分成实验组和对照组,通过人工合成miR145-3p-mimic(miR-145-3p类似物),使用慢病毒载体将miR-145-3p-mimics转入实验组MG-63细胞内,同时使用慢病毒载体将空质粒转入对照组细胞内。通过CCK-8方法检测两组细胞增殖能力;流式细胞仪分析两组细胞的细胞周期及凋亡情况; Transwell实验测定细胞侵袭能力; RT-PCR测定两组细胞miR-145-3p和周期素依赖性蛋白激酶1(CDK1)的表达情况;通过Targetscan数据库和荧光素酶实验确定CDK1是否为miR-145-3p的靶基因; Western印迹法检测基因的表达水平。结果 miR-145-3p在骨肉瘤细胞系MG-63细胞中的表达量为(0. 59±0. 24),较人成骨细胞系hFOB1. 19细胞中的表达量(1. 46±0. 21)明显降低,差异具有统计学意义(P 0. 05)。CCK-8结果显示,在48 h、72 h、96 h、120 h时,实验组细胞增殖能力较对照组明显降低,差异具有统计学意义(P 0. 05)。流式细胞周期结果显示,处于G1期细胞数量为(69. 92±0. 13)%,较对照组(49. 43±0. 09)%明显增多(P 0. 05),而处于S期细胞数量(26. 01±0. 08)%,较对照组(40. 67±0. 11)%明显减少,差异具有统计学意义(P 0. 05)。凋亡实验结果显示,实验组细胞的凋亡比率为(31. 3±4. 7)%,较对照组(9. 35±1. 9)%明显增高,差异具有统计学意义(P 0. 05)。转染野生型CDK1后,实验组荧光素酶活性较对照组明显降低,差异有统计学意义(P 0. 05);而转染突变型CDK1后,实验组荧光素酶活性较对照组无明显变化,差异无统计学意义(P 0. 05)。Western印迹实验结果显示,实验组中CDK1的表达量较对照组明显降低,且表达水平较对照组也明显降低(P 0. 05)。结论 miR-145-3p通过下调节CDK1表达,抑制骨肉瘤细胞系MG-63细胞的增殖、侵袭能力,并促进其凋亡。     

高迁移率蛋白A2在垂体腺瘤中的表达及意义

目的 研究高迁移率蛋白A2(HMGA2)在垂体腺瘤中的表达及其与垂体腺瘤侵袭性的相关性.方法 采用免疫组织化学法及RT-PCR 法检测55 例垂体腺瘤组织中HMGA2 蛋白的表达.依据Wilson 改良Hardy 分类系统分级分期标准分组:侵袭性垂体腺瘤组18 例,非侵袭性垂体腺瘤组37 例.依据内分泌学检查分为:无功能性垂体腺瘤5 例,功能性垂体腺瘤50 例.结果 HMGA2在无功能垂体腺瘤中无表达,在功能性垂体腺瘤中表达率82%,差异有统计学意义.在侵袭性组表达阳性率32.43%,与侵袭性垂体腺瘤(100%)相比,差异有统计学意义.侵袭组HMGA2 mRNA 的表达水平较非侵袭组表达水平显著增高(0.891 ±0.172 vs.0.372 ±0.181),功能性垂体瘤较非功能性垂体瘤HMGA2 mRNA 的表达水平显著增高(0.564 ±0.196 vs.0),差异有统计学意义.结论 HMGA2的高表达在功能性垂体瘤的发生及垂体瘤的侵袭性中发挥重要的作用.     

siRNA干扰技术沉默p66SHC对结直肠癌细胞生物学特性的影响

目的探讨干扰p66shc基因表达对结直肠癌HCT116细胞增殖、迁移、迁移的影响。方法实验分为对照组(不做任何处理)、NC-siRNA组和p66SHC-siRNA组,NC-siRNA组、p66SHC-siRNA组通过Lipofectamine 2000将特异性siRNA转染入结直肠癌HCT116细胞中。荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞中p66SHC的表达量;四甲基偶氮唑(MTT)法检测细胞的增殖能力;划痕实验和Transwell法观察细胞迁移、侵袭的变化;Western Blot检测细胞EMT相关蛋白钙黏蛋白E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、钙黏蛋白N(N-cadherin)的水平。结果采用siRNA干扰HCT116细胞中p66SHC蛋白的表达后,细胞的增殖能力显著下降(P0.05),明显抑制细胞侵袭、迁移能力(P0.05),E-cadherin蛋白的水平明显上调(P0.05),Vimentin、N-cadherin蛋白的表达水平显著下调(P0.05)。结论干扰p66SHC基因的表达能阻碍EMT的发生,从而降低结直肠癌细胞的增殖、侵袭以及迁移能力。     

CK19、Vimentin和TLR4在肝胆管结石患者胆管上皮细胞中的表达及与上皮间质转换的相关性

目的 探究CK19、Vimentin、TLR4在肝胆管结石患者胆管上皮细胞中的表达及与上皮间质转换的相关性。方法 回顾性选取2015年1月至2018年12月盐城市第一人民医院收治的86例肝胆管结石患者作为观察组,同期40例因肝血管瘤行部分肝脏切除术患者作为正常对照组。采用免疫法检测CK19、Vimentin、TLR4在两组胆管细胞表达,并分析其与上皮间质转换关系。结果 86例肝胆管结石患者中,CK19阳性表达率75. 58%,Vimentin阳性表达率22. 09%,TLR4阳性表达率34. 88%,N-cadherin阳性表达率15. 12%,E-cadherin阳性表达率72. 09%。观察组CK19阳性细胞率明显低于对照组,而Vimentin、TLR4阳性细胞率高于对照组,差异具有统计学意义(P 0. 05)。CK19表达与Vimentin、N-cadherin表达呈负相关(r=-0. 332,r=-0. 426,P 0. 05)。TLR4表达与CK19、E-cadherin表达呈负相关(r=-0. 564,r=-0. 497,P 0. 05),TLR4表达与Vimentin、N-cadherin表达呈正相关(r=0. 738,r=0. 526,P 0. 05)。结论 肝胆管结石患者胆管上皮细胞中CK19低表达,Vimentin和TLR4高表达。胆管上皮细胞在肝胆管结石的病理改变过程中发生了EMT。TLR4可能参与了肝胆管结石胆管上皮细胞的上皮间质转换过程。     

Notch基因在口腔癌和癌前病变患者癌组织及癌旁组织中的表达

目的研究Notch基因在口腔癌及癌前病变患者癌组织、癌旁组织中的表达情况。方法回顾性选取口腔鳞状细胞癌患者组织标本36例和癌前病变组织标本30例,均取得相对应的癌旁组织标本。检测Notch信号通路受体Notch1、Notch3基因mRNA表达水平,比较不同病变组织Notch1、Notch3基因mRNA表达水平及表达阳性率,分析Notch1、Notch3基因表达阳性率与口腔癌病理特征的关系。结果口腔癌癌组织Notch1、Notch3基因mRNA表达水平均显著高于癌前病变癌组织(P 0. 05);口腔癌癌旁组织Notch1、Notch3基因mRNA表达水平均略高于癌前病变癌旁组织,但差异无统计学意义(P 0. 05)。口腔癌癌组织Notch1、Notch3基因表达阳性率75. 00%、72. 22%均显著高于癌前病变癌组织50. 00%、46. 67%(P 0. 05);口腔癌癌旁组织Notch1、Notch3基因表达阳性率均略高于癌前病变癌旁组织,但差异无统计学意义(P 0. 05)。Notch1基因表达阳性率与口腔癌临床分期、淋巴结转移、病理分级有显著相关性(P 0. 05); Notch3基因表达阳性率与口腔癌临床分期、病理分级有显著相关性(P 0. 05),与淋巴结转移无显著相关(P 0. 05)。结论口腔癌、癌前病变患者癌组织中Notch信号通路受体Notch1、Notch3基因mRNA表达水平较高,Notch基因尤其在口腔癌患者癌组织中表达活跃,且与口腔癌的发生发展具有相关性,但其在癌旁组织中的表达并不活跃。     

急性白血病患儿血清转铁蛋白受体的表达变化及其机制研究

目的:研究急性白血病(AL)患儿血清转铁蛋白受体(serum transferrin receptor,s TFR)的表达变化及其相关作用机制。方法:选取2016年6月至2017年6月在我院接受治疗的46急性白血病患儿纳入AL组,并募集同期体检健康儿童40例纳入对照组。记录患者的相关临床资料,分析血清转铁蛋白受体与患者临床特征的相关性。KG-1a和TCHu147细胞的TFR基因经RNA干扰技术沉默后,采用MTT法、流式细胞术检测TFR基因对KG-1a细胞和TCHu147细胞增殖、细胞周期的作用。采用Western blot法检测白血病细胞经siRNA干扰后相关细胞周期蛋白水平。结果:AL组s TFR水平显著高于对照组(P 0. 05),外周血白血病细胞中TFR的mRNA水平及TFR蛋白表达量均高于对照组(P 0. 05)。s TFR水平与AL患儿的白细胞数、白血病细胞比例、白血病细胞绝对数、铁调素(Hepc)和危险等级等指标密切相关(P 0. 05)。经TFR siRNA干扰后的KG-1a和TCHu147细胞增殖能力则受到明显抑制(P 0. 05)。流式细胞术检测显示,转染TFR siRNA后,KG-1a和TCHu147细胞的G0/G1期比例分别为(62. 51±5. 39)%、(63. 37±4. 27)%,与对照组(空白对照和阴性对照)相比均显著增高(P 0. 05); KG-1a和TCHu147细胞的G2/M期的比例为(5. 74±1. 34)%、(7. 37±1. 56)%,与对照组(空白对照和阴性对照)相比均显著下降(P 0. 05)。TFR siRNA转染后的KG-1a和TCHu147细胞中Cyclin E和CDK2表达水平显著下降(P 0. 05); TFR siRNA转染后的KG-1a和TCHu147细胞中P27表达水平显著上升(P 0. 05)。结论:AL患儿外周血白血病细胞可合成较多的TFR蛋白,转运至细胞外后导致s TFR水平上升,通过下调TFR基因的表达能有效干扰白血病细胞分裂。     

血管内皮生长因子和P53及细胞增殖核抗原蛋白表达与垂体腺瘤复发的关系

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)、P53和细胞增殖核抗原(PCNA)蛋白表达与垂体腺瘤的侵袭性和复发的关系。方法 应用免疫组化染色方法检测VEGF、P53和PCNA蛋白在30例侵袭性垂体腺瘤及30例非侵袭性垂体腺瘤中的表达。结果 侵袭组中VEGF和PCNA蛋白的表达阳性率分别为16/30(53.3％)和13/30(43.3％),非侵袭组中分别为8/30(26.7％)和5/30(16.7％),两种蛋白的表达水平侵袭组明显高于非侵袭组(P<0.05)。P53蛋白表达阳性率在两组中分别为7/30(23.3％)和0/30(0％),两组差异有显著意义(P<0.01)。复发组的VEGF、P53和PCNA蛋白表达阳性率在第一次手术组分别为5/9(55.5％)、2/9(22.2％)、5/9(55.5％),在第二次手术组分别为5/9(55.5％)、5/9(55.5％)和4/9(44.4％);非复发组分别为6/21(28.5％)、0/21(0％)和4/21(19.0％)。复发组VEGF和PCNA蛋白表达与非复发组比较,差异有显著意义(P<0.05),而两次手术组间比较无差异;P53蛋白表达在第一次手术组与非复发组间的差异也无显著意义(P>0.05),但第二次手术组则明显高于非复发组(P<0.01)。结论 VEGF、P53和PCNA蛋白异常表达与垂体腺瘤的发生、侵袭和复发改变有关,检测这3项指标可对肿瘤侵袭和预后进行评价。     

三间隙引流术和传统切开挂线术在治疗肛周脓肿中的应用价值

目的观察和比较三间隙引流术与传统切开挂线术治疗肛周脓肿的临床效果,并评价其应用价值。方法采用前瞻性随机对照研究方法,选取2017年6月至2019年6月盐城市第三人民医院收治的95例肛周脓肿患者,按照简单随机分组法将患者分为两组:对照组患者(n=47)行传统切开挂线术治疗,观察组患者(n=48)行三间隙引流术治疗。观察两组患者的手术相关指标(包括手术时间、术中出血量、创面愈合时间、住院时间),采用Wexner量表评价两组患者治疗前以及治疗后1 d、7 d、30 d的肛门功能,以视觉模拟评分法(VAS)评价两组患者治疗前以及治疗后1 d、7d、30 d的患处疼痛情况,统计两组患者治疗期间的创面感染、肛瘘形成、肛门缺损或畸形等并发症发生率。结果两组患者的手术时间比较差异无统计学意义(26. 93±7. 63 min vs. 25. 49±6. 31 min)(P> 0. 05);观察组患者的术中出血量(24. 69±4. 63 ml vs. 16. 93±3. 27 ml)、创面愈合时间(27. 59±4. 27 d vs. 22. 61±6. 59 d)、住院时间(16. 27±6. 41 d vs. 12. 95±5. 63 d)均少于对照组,差异具有统计学意义(P <0. 05)。观察组患者术后1 d的Wexner量表评分低于对照组(9. 26±1. 58分vs. 7. 88±1. 65分),差异具有统计学意义(P <0. 05),治疗后7 d(4. 69±1. 63分vs. 4. 28±1. 37分)、30 d时(2. 73±0. 67分vs. 2. 51±0. 58分)两组Wexner量表评分比较差异无统计学意义(P>0. 05)。治疗后1 d时两组患者VAS评分比较(6. 75±1. 22分vs. 6. 05±1. 64分),差异无统计学意义(P>0. 05),观察组患者术后7 d、30d的疼痛VAS评分低于对照组(3. 05±0. 41分vs. 2. 33±0. 34分、2. 25±0. 25分vs. 1. 17±0. 24分),差异具有统计学意义(P <0. 05)。两组患者创面感染(4. 26%vs. 2. 08%)、肛门缺损或畸形发生率(2. 13%vs. 0)比较差异无统计学意义(P>0. 05);观察组的肛瘘形成发生率低于对照组(6. 38%vs. 2. 08%),差异具有统计学意义(P <0. 05)。结论相较于传统切开挂线术,三间隙引流术治疗肛周脓肿的疗效确切,术后疼痛缓解快,恢复迅速,肛瘘形成率低,具有较高的临床应用价值。     

甲状腺激素通过调节甲亢大鼠卵巢葡萄糖转运影响黄体增殖和血管生成、凋亡的机制

目的 探究甲状腺激素通过调节甲亢大鼠卵巢葡萄糖转运影响黄体增殖和血管生成、凋亡的机制.方法 将无特定病原体(SPF)级3周龄Sprague-Dawley大鼠根据随机数字表法分为两组:对照组(大鼠每日灌服5 mL蒸馏水,n=5)和甲亢组(L-甲状腺素250μg/kg溶于5 mL蒸馏水后灌胃,诱导大鼠甲亢,n=5).甲亢诱...     

miR-146a靶向调控MIF基因对胶质瘤细胞增殖的影响

目的研究微小RNA-146a(miR-146a)靶向调控巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因对胶质瘤细胞增殖的影响。方法回顾性收集2017年6月至2019年7月济南市人民医院收治的经手术病理证实的胶质瘤患者36例,取胶质瘤组织和癌旁组织。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测miR-146和MIF表达水平。体外培养U87胶质瘤细胞系,检测U87中miR-146a水平,并将U87细胞株分为转染miR-146a模拟物组(miR-146a mimic组)和miR-146阴性对照组(NC组)。采用双荧光素酶检测系统和集落形成实验分析miR-146a与MIF 3’UTR基因靶向关系。采用RT-PCR检测U87细胞转染miR-146a mimic和NC后,MIF mRNA和蛋白表达水平。结果脑胶质瘤组织miR-146a水平为0.30±0.13,显著低于癌旁组织(0.63±0.19),MIF水平为0.54±0.08,显著高于癌旁组织(0.41±0.15),差异均有统计学意义(P <0.05)。miR-146a mimics+pGL3-MIF 3’UTR-Wt共转染组荧光信号为0.43...     

高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Notch受体的影响

目的 检测Notch 1在肺泡Ⅱ型上皮细胞(ACEⅡ)与肺成纤维细胞共培养的高氧损伤模型中表达的变化,初步探讨Notch信号在高氧肺损伤中的作用,为临床防治新生儿急、慢性肺损伤提供理论的依据.方法 Spragne Dawkey雌鼠12只,体质量200～220 g,雄鼠3只,220～250 g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.将共培养的AEC Ⅱ随机分为高氧组和对照组.高氧组按3L/nlin通入950 ml/L O2和250 ml/L CO2,10 min后,立即用封口胶密封培养板,置于37℃、50 ml/L CO2培养箱.于给氧后24、48、72、96 h,收获各组细胞,测氧仪检测培养瓶中的O2体积分数,将低于900mi/L O2的标本弃去.免疫组织化学法鉴定细胞,台盼蓝拒染实验计算细胞纯度,确认共培养造模成功.每24 h更换培养基并给氧.每一时间点同时设对照组,置于37℃、50 ml/L CO2培养箱中培养.NTT法检测AECⅡ增殖活力,绘制生长曲线;免疫组织化学法定位Notch1蛋白;荧光定量PCR检测noteh1 mRNA;流式细胞术双标记法检测AEC Ⅱ、AEC I细胞百分率.结果 免疫组织化学法显示高氧组Notch1活化人核受抑;高氧组各时间点Notch1 mRNA分别下降为对照组的0.43、0.29、0.11、0.03倍(置信限95%),通氧后AECⅡ百分率显著降低[24 h高氧组vs.对照组:(68.92±6.88)%vs.(90.35±4.01)%,P=0.006;48 h高氧组vs.对照组:(38.03±3.27)%、vs.(61.47±4.81)%,P=0.000;72 h高氧组vs.对照组:(20.13±4.45)%vs.(52.05±3.35)%,P=0.000;96 h高氧组vs.对照组:(8.17±1.99)%vs.(52.59±2.93)%,P:0.000].AEC I百分率除96 h外均增高[24 h高氧组vs.对照组:(0.1l±0.03)%vs.(0.01±0.01)%,P=0.006;48 h高氧组vs.对照组:(49.73±3.45)%vs.(16.13±2.13)%,P=0.000;72 h高氧组vs.对照组:(52.43±3.14)%vs.(5.98±0.95)%,P=0.000;96 h高氧组vs.对照组:(19.85±3.26)%vs.(29.03±3.16)%,P=0.0007].结论 高氧可抑制AECⅡNotch1受体的活化,引起AECⅡ增殖减弱,转分化异常.研究如何调控Notch信号通路将为修复肺泡上皮,恢复其正常生理功能打开新思路.     

自噬对肾小管细胞毒性损伤后线粒体功能的影响及相关机制研究

目的研究自噬对肾小管细胞毒性损伤后线粒体功能的影响及相关机制。方法将人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)分为杂化siRNA组(对照无关序列片段siRNA转染细胞)、杂化siRNA+顺铂组(对照无关序列片段siRNA转染细胞+10μmol/L顺铂溶液)、沉默Pink1+顺铂组(Pink1沉默转染细胞+10μmol/L顺铂溶液)和沉默Parkin+顺铂组(Parkin沉默转染细胞+10μmol/L顺铂溶液)。培养12 h后,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测定各组细胞存活率,JC-1法检测线粒体膜电位,荧光法检测各组细胞内三磷酸腺苷(ATP)的含量,Western blotting和免疫荧光探针检测自噬相关蛋白的相对表达。结果杂化siRNA+顺铂组的细胞存活率为(88.2±2.7)%,显著低于杂化siRNA组[(101.3±3.1)%](P<0.05);沉默Pink1+顺铂组和沉默Parkin+顺铂组的存活率为(80.1±2.3)%、(79.4±3.0%),显著低于杂化siRNA+顺铂组(P<0.05)。杂化siRNA+顺铂组的线粒体膜电位和ATP含量为(0.90±0.01)、(0.82±0.01)nmol/mg,显著低于杂化siRNA组[(1.01±0.02)、(1.00±0.04)nmol/mg](P<0.05);沉默Pink1+顺铂组和沉默Parkin+顺铂组的线粒体膜电位(0.79±0.02、0.77±0.02)和ATP[(0.66±0.05)、(0.66±0.02)nmol/mg]含量显著低于杂化siRNA+顺铂组(P<0.05)。杂化siRNA+顺铂组的Pink1、Parkin、Beclin蛋白的相对表达量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值(1.68±0.04、1.80±0.05、1.87±0.05、2.01±0.04)显著高于杂化siRNA组(1.00±0.04、1.00±0.05、1.01±0.01、1.04±0.02)(P<0.05);而沉默Pink1+顺铂组和沉默Parkin+顺铂组的Pink1、Parkin、Beclin蛋白的相对表达量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值(1.17±0.05、0.69±0.05、1.37±0.05、1.43±0.02;1.22±0.04、0.57±0.06、1.39±0.03、1.38±0.10)显著低于杂化siRNA+顺铂组(P<0.05)。杂化siRNA+顺铂组的自噬阳性点数为(12.2±0.7)个,显著多于杂化siRNA组[(2.4±0.3)个](P<0.05);而沉默Pink1+顺铂组和沉默Parkin+顺铂组的荧光点数[(5.3±0.8)、(5.6±0.5)个]显著少于杂化siRNA+顺铂组(P<0.05)。结论顺铂处理可诱导HK-2细胞的线粒体自噬作用,从而改善顺铂引起的肾小管细胞毒性损伤和线粒体功能,其作用机制可能与Pink1/Parkin蛋白的表达情况有关。     

RNA干扰技术抑制急性白血病细胞THP-1中SALL4基因表达的研究

目的 抑制SALL4基因在急性白血病细胞THP-1中的表达,探讨其在白血病发病机制中的作用.方法 将表达SALL4干扰序列的质粒载体转染至急性白血病细胞THP-1中,分为4组:(1)空白对照组:不加处理;(2)转染对照组:加入空pRS质粒载体;(3)转染一组:加入SALL4-shRNA-pRS-1干扰质粒的转染复合体;(4)转染二组:加入SALL4-shRNA-pRS-2干扰质粒的转染复合体.采用实时荧光定量PCR和WB技术观察THP-1细胞中SALL4基因mRNA及蛋白表达的变化,建立抑制SALL4表达的体系.实时荧光定量PCR检测SALL4受抑后Wnt/β-catenin信号通路中C-myc、Cyclin D1、β-catenin基因的表达改变,采用流式细胞术分析THP-1细胞凋亡情况.结果 实时荧光定量PCR结果 显示,转染一组、转染二组、转染对照组、空白对照组SALL4基因的表达水平分别为(36.0±4.3)%、(32.0±2.4)%、(102.0±6.5)%、(100.0±2.6)%,差异有统计学意义(F=226.3,P<0.05);转染一组、转染二组的SALL4基因表达水平显著低于空白对照组,差异有统计学意义(t值分别为19.7、19.1,P<0.05);转染对照组SALL4基因表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(t=1.1,P＞0.05).WB检测结果 显示,转染一组、转染二组SALL4蛋白表达与空白对照组和转染对照组相比明显下降.以上基因和蛋白表达水平均提示SALL4干扰效率良好.SALL4基因抑制表达后,转染一组C-myc基因、β-catenin基因、Cyclin D1基因的表达分别为(44.0±6.2)%、(44.0±5.1)%和(107.0±13.6)%,转染二组为(22.0±4.5)%、(25.0±3.5)%和(48.0±7.6)%,转染对照组为(42.0±3.5)%、(59.0±3.7)%及(79.0±5.6)%.转染一组、转染二组C-myc基因表达水平显著低于空白对照组的(103.0±7.5)%,差异有统计学意义(t值分别为10.1、9.5,P均<0.05);转染一组、转染二组β-catenin基因的表达显著低于空白对照组的(100.0±4.1)%,差异有统计学意义(t值分别为23.3、22.9,P均<0.05);转染一组、转染二组Cyclin D1基因的表达显著低于空白对照组的(102.0±6.0)%,差异有统计学意义(t值分别为17.4、12.4,P均<0.05).SALL4基因被抑制后,转染一组、转染二组、转染对照组及空白对照组的细胞凋亡率分别为(57.2±9.1)%、(34.4±8.6)%、(14.4±3.6)%及(14.8±4.8)%,差异有统计学意义(F=42.5,P<0.05).转染一组、转染二组细胞凋亡率显著高于空白对照组(t值分别为9.7、4.5,P均<0.05).结论 抑制急性白血病细胞THP-1中SALL4基因表达后,Wnt/β-catenin信号通路的C-myc、Cyclin D1及β-catenin基因的表达随之下调,并促进了细胞凋亡.     

高糖诱导人脐静脉内皮细胞衰老过程中活性氧与二甲基精氨酸二甲胺水解酶-非对称性二甲基精氨酸系统的变化

目的 观察高糖加速内皮细胞衰老过程中细胞内活性氧(ROS)水平与二甲基精氨酸二甲胺水解酶-非对称性二甲基精氨酸(DDAH-ADMA)系统的变化.方法 正常糖浓度培养液(5.5 mmol/L)和高糖培养液(11.0、22.0、33.0 mmol/L)作用于人脐静脉内皮细胞48 h后,用β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞,聚合酶链反应-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)检测端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞内ROS水平,液质联用仪检测细胞上清液中ADMA含量及DDAH活性.结果 与正常糖浓度组相比,11.0、22.0、33.0 mmol/L高糖浓度组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率明显增高[(7.00±1.73)%、(12.67±2.03)%、(16.00±2.26)%比(4.00±1.33)%,P＞0.05、P＜0.05、P＜0.05],端粒酶活性显著下降[(91.32±4.01)%、(78.44±3.78)%、(56.04±3.35)%比100%,均P＜0.05];随细胞衰老程度加重,细胞内ROS水平(mfi)显著升高(159.84±27.52、188.99±18.77、244.56±20.96比117.11±18.76,P＜0.05或P＜0.01),ADMA水平(μmol/L)显著升高(0.78±0.14、0.88±0.18、1.08±0.15比0.70±0.12,P＞0.05、P＜0.05、P＜0.05),DDAH活性显著下降[(91.32±4.01)%、(78.44±3.78)%、(56.04±3.35)%比100%,均P＜0.05].结论 高糖可加速内皮细胞衰老进程,其机制可能与氧化应激水平增强、抑制DDAH活性使ADMA含量增加有关.

Abstract：

Objective To investigate the changes in reactive oxygen species (ROS) and dimethylarginine dimethylaminohydrolase-asymmetric dimethylarginine (DDAH-ADMA) system in the process of endothelial cell senescence after exposure to high glucose. Methods The human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were cultured with different concentrations of glucose, e.g. 5. 5 mmol/L (normal level),and high levels as 11. 0, 22. 0 and 33. 0 mmol/L. for 48 hours, respectively. Subsequently, SA-β-gal staining was used to evaluate senescence of cells. Telomerase activity was detected by polymerase chain reactionenzyme linked immunosorbent assay (PCR-ELISA). The intracellular ROS level was measured by flow cytometry. The ADMA concentration and DDAH activity were determined with high-performance liquid chromatography. Results Compared with normal glucose concentration group, after the endothelial cells were treated with high glucose concentration (11. 0 - 33. 0 mmol/L) for 48 hours, the number of SA-β-gal positive cells was increased significantly [(7.00±1. 73)%, (12. 67±2. 03)%, (16. 00±2. 26)% vs. (4. 00±1.33)%, P＞0.05, P＜0.05, P＜0.05] and the telomerase activity was inhibited dramatically [(91. 32±4.01)%, (78. 44±3. 78)%, (56. 04±3. 35)% vs. 100%, all P＜0. 05]. The ROS level (mfi) was increased in all high glucose groups (159. 84±27. 52, 188. 99±18. 77, 244. 56±20. 96 vs. 117.11±18. 76, P＜0. 05 or P＜0. 01). At the same time, the ADMA (μmol/L) production was increased (0. 78±0. 14, 0. 88±0.18,1. 08±0.15 vs. 0. 70±0. 12, P＞0. 05, P＜0. 05, P＜0. 05), and DDAH activity was decreased [(91. 32±4.01)%, (78.44±3.78)%, (56. 04± 3. 35)% vs. 100%, all P＜0.05]. Conclusion High glucose can accelerate endothelial cells senescence in dose-dependent manner and the underlying mechanism may be related to an increased oxidative stress and change in DDAH-ADMA system.     

高渗盐水对脑缺血大鼠Notch信号通路的影响

目的：探讨高渗盐水（ hypertonic saline, HS）对大鼠脑缺血后小胶质细胞Notch信号通路的影响。方法 SPF级-雄性SD大鼠随机（随机数字法）分为假手术组,脑缺血组,生理盐水（ NS）组,10％高渗盐水（10％HS）组。除假手术组外,其他各组采用线栓法复制右侧大脑中动脉栓塞脑缺血模型,缺血2 h后实施再灌注24 h, NS组和10％HS组按0.3 mL／h经尾静脉分别匀速泵入NS和10％HS治疗24 h。然后采用免疫荧光法、 RT-PCR、 Western blot检测各组大鼠脑缺血灶周围Notch1及Notch受体的胞内片段NICD的表达。数据采用单因素方差分析,用LSD法进行组间两两比较,以P＜0.05为差异具有统计学意义。结果免疫荧光表明与假手术组比较,脑缺组和NS组缺血灶周围小胶质细胞Notch1与NICD的表达明显增加;10％HS组与脑缺血组及NS组比较,缺血灶周围小胶质细胞Notch1与NICD的表达明显减少。 RT-PCR表明脑缺血组及NS组与对照组比较, Notch1 mRNA的表达明显增加（对照组：1.000±0.076;脑缺血组：2.203±0.283; NS组：1.616±0.185; P＜0.01）;10％HS组与脑缺血组及NS组比较, Notch1 mRNA的表达均明显减少（脑缺血组：2.203±0.283; NS 组：1.616±0.185; HS 组：1.202±0.177; P ＜0.05）。 Western blot表明脑缺血组和 NS 组与对照组相比,脑缺血灶周围 Notch1蛋白表达明显增加（对照组：0.290±0.079;脑缺血组：0.750±0.029; NS 组：0.765±0.182; P ＜0.01）;10％HS 治疗后, Notch1蛋白表达较脑缺血组和NS组明显减少（脑缺血组：0.750±0.029; NS组：0.765±0.182;HS组：0.390±0.195; P＜0.05）。脑缺血组和NS组与对照组比较,大鼠脑缺血灶周围NICD蛋白表达明显增加（对照组：0.401±0.196;脑缺血组：0.906±0.359; NS组：0.847±0.153; P＜0.01）;10％HS治疗后, NICD蛋白表达较脑缺血组和NS组明显减少（脑缺血组：0.906±0.359;NS组：0.847±0.153; HS组：0.561±0.165; P＜0.05）。结论 HS可抑制大鼠脑缺血后小胶质细胞上Notch信号通路的激活。     

甲基-β-环糊精对Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖与转分化的影响

目的 观察甲基-β-环糊精(MβCD)破坏脂质微区结构对Ⅱ型肺泡上皮细胞(AEC Ⅱ)增殖、转分化及细胞周期的影响.方法 采用MβCD破坏体外培养的AEC Ⅱ细胞膜脂质微区(MβCD干扰组),以必需基本培养基(DMEM)作为对照.用血细胞计数器计数培养细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期,免疫荧光双标和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测AEC Ⅱ特异性肺泡表面活性蛋白C(SP-C)及Ⅰ型肺泡上皮细胞(AEC Ⅰ)特异性水通道蛋白5(AQP5)的表达.结果 与对照组比较,MβCD组干扰后24、48、72 h细胞数及增殖能力显著降低[细胞数(×106/rml):2.74±0.56比8.05±0.92,4.45±0.68比10.52±0.81,7.82±0.59比11.39±0.81;MTT结果(A值):0.25±0.20比0.45±0.02,0.35±0.03比0.54±0.28,0.48±0.04比0.59±0.05,均P＜0.01＝;MβCD组干扰后24h G0/G1期细胞比例显著增多,S期细胞比例显著减少[G0/G1期:(60.06±1.65)%比(43.43±3.59)%;S期:(16.20±2.17)%比(34.07±2.63)%,均P＜0.05＝;MβCD组干扰后48 h、72 h SP-C蛋白表达明显增多(0.54±0.04比0.47±0.03,0.19±0.03比0.06±0.02),AQP5蛋白表达明显减少(0.30±0.04比0.43±0.06,0.39±0.04比0.59±0.04,P＜0.05或P＜0.01＝.结论 MβCD破坏体外培养AEC Ⅱ脂质微区结构后,细胞发生G1期阻滞,细胞增殖和转分化受到抑制.

Abstract：

Objective To study the destructive effects of the membrane lipid microdomain with methyl-β-cyclodextrin (MβCD) on the proliferation, transdifferentiation and cell cycle of type Ⅱ alveolar epithelial cell (AEC Ⅱ ). Methods The membrane lipid microdomain of AEC Ⅱ was destroyed by MβCD (MβCD interference group) in vitro, and then cultured with DMEM as control. Cell number was counted with hernacytometer; the proliferation rate was measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT); flow cytometry was used to assay the cell cycle. The expressions of AEC Ⅱ -specific surfactant protein-C (SP-C)and AEC Ⅰ-specific aquaporin-5 (AQP5) were detected by immunofluorescence and Western blotting analyses. Results Compared with control group, cell number and the cell proliferation was decreased in MβCD interference group at 24, 48 and 72 hours after interaction [cell numbers (× 106/ml) : 2. 74±0. 56 vs.8. 05±0. 92, 4. 45±0. 68 vs. 10. 52±0. 81, 7.82±0. 59 vs. 11.39±0. 81; MTT results (A value) : 0. 25±0. 20 vs. 0. 45±0. 02, 0. 35±0.03 vs. 0. 54±0. 28, 0. 48±0. 04 vs. 0. 59±0. 05, all P＜0. 01]. MβCD could increase the percentage of cells in G0/G1 phases and decreased the percentage in S phases at 24 hours [G0/G1phases: (60. 06±1.65)% vs. (43.43±3. 59)% ; S phases: (16. 20±2.17)% vs. (34. 07±2. 63)%, both P＜0. 05]. Incubation of AEC Ⅱ with MβCD resulted in up-regulation of the expression of SP-C (0. 54±0. 04vs. 0. 47±0. 03, 0. 19±0. 03 vs. 0.06±0. 02) and down-regulation of AQP5 (0. 30±0. 04 vs. 0. 43±0. 06,0. 39±0. 04 vs. 0. 59±0. 04) at 48 hours and 72 hours after interaction (P＜0. 05 or P＜0. 01). Conclusion The destruction of membrane lipid microdomain by the MβCD can inhibi± proliferation and transdifferentiation of AEC Ⅱ , and induce cell cycle arrest in G1 phase.