核移植胚胎干细胞的鉴定及诱导分化研究

目的 观察胚胎后肾细胞微环境诱导核移植胚胎干细胞( ntESCs)分化为肾系细胞的作用.方法 分离小鼠ntESCs样集落,对ntESCs进行鉴定.将核移植拟胚体(ntEBs)与胚胎后肾细胞通过间接共培养以诱导其分化.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测诱导后ntEBs与对照组中肾组织Wilms瘤抑癌因子1(WT-1)、Wnt-4、同源盒基因2(pax-2)、c-Ret、足细胞标记蛋白( podocalyxin)和Nephrin的mRNA表达;免疫荧光染色法检测诱导后ntEBs与对照组的Pax-2、WT-1蛋白表达.结果 mESCs集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性.ntEBs共培养组WT-1、Wnt-4、pax-2、c-Ret、podocalyxin和Nephrin均有表达,而对照组则为阴性;免疫荧光结果显示ntEBs细胞诱导分化后Pax-2荧光强度为(++);而实验组WT-1荧光强度(+)也优于对照组的(±).结论 后肾细胞微环境可促进核移植胚胎来源ntESCs分化为肾系细胞.     

胚胎肝细胞移植治疗小鼠肝纤维化

目的 观察移植胚胎肝细胞减轻小鼠肝纤维化的作用.方法 孕14 d的BALB/C小鼠胚胎肝细胞移植到雌性BALB/C小鼠肝脏,二乙基亚硝胺诱导肝纤维化.60只雌性小鼠随机分为对照组,模型组及治疗组.3个月后测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)浓度及肝脏羟基脯氨酸(Hyp)含量.免疫组织化学检测肝脏α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及Y染色体性别决定区域蛋白(SRY)表达来确定移植的胚胎肝细胞在肝内的增殖分化.结果 移植胚胎肝细胞能显著降低血清ALT、AST、HA和LN的水平(P＜0.01).胚胎肝细胞移植组肝脏Hyp含量也明显低于模型组(P＜0.01).移植组肝脏α-SMA的表达明显低于模型组.胚胎肝细胞移植及诱导肝纤维化3个月后,胚胎肝细胞能增殖分化为肝细胞和胆管细胞,占肝脏的30%～50%.结论 在诱导肝纤维化过程中,移植胚胎肝细胞有向肝细胞和胆管细胞高增殖分化的能力,并有效地减轻肝损害和肝纤维化.     

改进传代诱导法高效诱导人胚胎干细胞定向分化为内胚层细胞

目的 比较不同诱导方法将人类胚胎干细胞(hESCs)诱导分化为纯度较高的人类内胚层细胞的分化效率,探寻最佳的分化体系.方法 用两种不同诱导方法培养人类胚胎干细胞(hESCs)H9细胞株,第1组采用最新改进的体外传代诱导方法,用IV型胶原酶消化成团的hESCs为单个hESC细胞后,使用含有100 ng/ml的胚胎干细胞诱...     

小鼠致密化前胚胎卵裂球体外培养体系的研究

目的探索改善小鼠致密化前胚胎卵裂球体外发育能力。方法用酶消化与机械法结合分离小鼠2-、4-、8-细胞胚胎卵裂球为单个卵裂球及2/4、4/8多卵裂球胚胎,并将其装入空透明带后于兽用人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射后138 h,观察透明带包裹、胚胎密度及胰岛素(Ins)、葡萄糖(Glu)添加对各卵裂球、囊胚形成率及囊胚细胞数目的影响。结果透明带包裹提高了2-细胞胚胎卵裂球来源的单腔囊胚的发育率。25/50μl胚胎密度及培养基添加Ins、Glu能显著提高2-细胞胚胎卵裂球囊胚发育率和囊胚细胞数;且对4-和8-细胞胚胎卵裂球发育具有同样的促进作用。结论采用透明带包裹、卵裂球密集培养、培养基添加Ins、Glu的方法成功建立了一种维持致密化前胚胎卵裂球体外高效发育的培养体系。其中,透明带在卵裂球发育中具维持囊胚正常形态作用,避免了多腔囊胚的形成;卵裂球密集培养和培养基添加Ins、Glu均提高囊胚形成率和(或)囊胚细胞数目。该体系有效改善了致密化前胚胎卵裂球体外发育质量。     

一步法和二步法培养系统对小鼠核移植胚胎体外发育的影响

目的 比较一步法和二步法两种培养系统对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响,确立一种有效的培养系统.方法 构建小鼠核移植胚胎,在一步法和二步法2种培养系统中培养,观察核移植胚胎体外发育情况.结果 GlyGln-KSOMg~(AA)/GlyGln-KSOMg~(AA)组核移植胚胎发育的囊胚率(3.9%)和囊胚细胞计数(34.00±2.29)与GlyGln-KSOMg~(AA)组差异无统计学意义(P＞0.05).卵裂培养基(9.8%;46.05 ±2.62)组和卵裂培养基/囊胚培养基(10.3%;51.15±2.37)组核移植胚胎的囊胚率和囊胚细胞计数差异也无统计学意义(P＞0.05);牛磺酸加入GlyGln-KSOM-g~(AA)后能有效改善早期核移植胚胎体外发育能力.结论 一步法和两步法培养体系均符合小鼠体细胞核移植胚胎不同发育阶段的代谢特征和营养需求,是适宜的小鼠体细胞核移植胚胎培养方法 .     

胚胎干细胞的增殖分化及应用研究

胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)是从早期胚胎中发现的可在体外培养并无限增殖的一种高度未分化细胞,具有正常核型,表达干细胞典型标记物及高端粒酶活性。Oct3/4基因及许多细胞因子对ESC自我更新、多向分化潜能的维持具有重要作用,一定条件下ESC在体内、体外都可诱导分化为几乎机体所有类型细胞,在人类组织器官移植和基因治疗、人类胚胎发育机制研究、新药研制与开发等领域有着广阔的应用前景。本文就胚胎干细胞生物学特性、细胞标记物、增殖分化的可能机制及应用研究等进行综述。     

非接触状态下小鼠胚胎干细胞在小鼠肝癌细胞H22诱导下分化的动态观察

目的 观察小鼠源性肿瘤细胞分泌的细胞因子对小鼠胚胎干细胞(ES cells)的诱导分化.方法 将 ES细胞形成的拟胚体分为诱导组和对照组.诱导组在加入小鼠肝癌细胞H22上清液制成的条件培养基中生长,对照组在去除白血病抑制因子(LIF)的ES细胞培养液中生长.于诱导分化的第7、9、12、15天在倒置显微镜下动态观察两组分化情况,并分别测量上清液中AFP的含量.结果 诱导分化的第7天观察到诱导组拟胚体细胞群落的中心和周边有较为典型的小鼠肝癌样细胞形成,第9、12、15天肝癌样细胞数量逐渐增加.对照组拟胚体向三胚层细胞分化,未见肝癌细胞形成.第9,12,15天诱导组和对照组AFP含量经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05).结论 小鼠胚胎干细胞在小鼠肝癌细胞H22分泌的细胞因子的诱导下可以分化为肝癌细胞.     

胚胎干细胞培养体系对早期胚胎发育的影响

目的利用胚胎干细胞(ES)培养体系(饲养细胞+添加条件培养基的胚胎干细胞培养液)培养早期胚胎,建立并优化移植前早期胚胎培养系统,为提高胚胎的着床率与临床妊娠率及植入前遗传学诊断奠定基础。方法将获取的521枚胚胎根据培养液及饲养细胞的不同分为10组,分别比较各组胚胎的体外发育率。结果ES培养体系显著优于传统的胚胎培养体系(P<0.05)。ES培养体系中用SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苷亚系(STO)作饲养细胞培养效果优于小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养细胞,两种饲养细胞效果均显著优于用输卵管上皮细胞(OEC)作为饲养细胞(P<0.05)。结论ES培养体系可以显著提高早期胚胎的发育率,培养体系中STO饲养细胞较MEF饲养细胞有更好的效果。     

sonic hedgehog信号通路蛋白在人胚胎前列腺发育不同阶段的表达及意义

目的:探明son ic hedgehog信号通路中几个关键的效应蛋白son ic hedgehog(SHH)、Patched1(PTC1)、Smoothened(SMO)及GLI1在人胚胎前列腺组织中的定位表达及变化。方法:应用免疫组织化学方法研究SHH、PTC1、SMO及GLI1在不同胎龄(10~39周)人胚胎前列腺组织中的表达变化情况。结果:随胎龄增大,SHH、PTC1、SMO及GLI1在前列腺组织中的表达水平呈由弱变强,由强渐弱,又由弱转强的双峰变化趋势。SHH和SMO仅表达在胚胎前列腺上皮细胞中;而PTC1和GLI1主要表达在上皮细胞外,也可表达在腺体周围的间质中。结论:SHH信号通路参与了人胚胎前列腺发育的调控过程,可能对于腺体发育初期的诱导发生,以及后期的增殖、分化都具有重要的调控作用。     

重组人钙调素对小鼠胚胎发育及凋亡的影响

目的探讨外源重组人钙调素(rhCAM)对小鼠早期胚胎体外发育及凋亡的影响。方法小鼠超促排卵,收集2-细胞胚胎置于含不同浓度rhCAM的IVF-30培养液中,观察并记录胚胎形态,TUNEL法检测囊胚细胞数及囊胚细胞凋亡情况。结果20μg/ml rhCAM组的胚胎体外培养48、72 h的囊胚形成率和孵化囊胚率均高于对照组,该组体外培养72 h囊胚细胞凋亡指数显著低于对照组。200μg/ml rhCAM组的胚胎囊胚形成率低于对照组,凋亡指数显著高于对照组。结论一定浓度的rhCAM可促进胚胎体外发育并可抑制胚胎细胞的凋亡。     

胚胎干细胞在转化生长因子-β1诱导下表达vWF、CD34的研究

目的　探讨胚胎干 (ES)细胞在转化生长因子 β1(TGF β1)诱导条件下的分化表现 ,为组织工程种子细胞来源提供诱导方法。方法　小鼠ES细胞 ,以 1× 10 - 9mol L维甲酸 (RA)和 3μg LTGF β1进行诱导分化。应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)及免疫组织化学验证细胞性质。结果　证实ES细胞经RA和TGF β1的诱导 ,3～ 4d出现圆形前体细胞 ,6d形成管状血管样结构。分化细胞可表达内皮细胞的标志vWF、CD34。结论　ES细胞在特定的条件下可分化为血管内皮细胞 ,有可能为构建组织工程化血管及其他人工血管的内皮化提供种子细胞来源。     

胚胎干细胞源性肝细胞的获得及体内移植研究

目的 探讨体外定向诱导小鼠胚胎干细胞(ES细胞)分化为肝细胞的方法及肝损伤模型肝内移植的可行性.方法 常规培养ES细胞后,继续悬浮培养4 d以形成拟胚体(EBs),转移EBs到铺有明胶的6孔板中贴壁培养,并添加3 mmol/L丁酸钠开始诱导分化,7 d后加入淤胆血清筛选、纯化ES源性肝细胞,分化过程中用光学显微镜和电子显微镜观察细胞形态及超微结构的改变;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肝细胞特异性标志基因:白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、甲状腺素运载蛋白(TTR)、α1抗胰蛋白酶(AAT)、葡萄糖6磷酸酶(G6P)、酪氨酸转氨酶(TAT)mRNA水平的表达;以荧光示踪剂CFDA-SE标记诱导获得的肝细胞,并移植到肝损伤小鼠肝内,观察移植细胞在肝内的定居、增殖情况.结果 诱导分化过程中,ES细胞形态逐渐出现肝细胞样改变,其超微结构与小鼠肝细胞超微结构十分相似;RT-PCR结果显示,随着诱导时间的推进,标志肝细胞发育过程的ALB、AFP、TTR、AAT、G6P、TAT mRNA顺序表达;肝内移植实验结果显示:ES源性肝细胞可在肝损伤小鼠肝内定居并增殖.结论 丁酸钠联合淤胆血清可以诱导ES细胞分化为肝细胞,ES源性肝细胞肝损伤模型体内移植是可行的,这有可能为细胞移植治疗难治性肝病提供一种新的细胞来源.     

多聚赖氨酸影响大鼠胚胎肢芽细胞软骨分化的研究

多聚左旋赖氨酸 (Poly- L- L ysine,PL)为多价阳离子物质 ,其良好的细胞吸附性和粘附作用已得到广泛应用 ,在组织工程学研究中 ,有报道用其包埋软骨细胞培养支架[1 ] 。本文采用胚胎肢芽细胞培养技术研究 PL对大鼠胚胎肢芽细胞软骨分化的促进作用 ,并为其机制的探讨提供初步实验依据。材料和方法一、材料来源1.试剂 :PL (Sigma,Mr=10 0 0 0 0～ 30 0 0 0 0 ) ,Ham F1 2 培养基 (Gibco) ,N- cadherin多抗 (Boster) ,Collagen 单抗(Boster)。2 .实验动物及准备 :选用健康成年 SD大白鼠 ,雌鼠体重2 0 0～ 2 30 g,雄鼠体重 2 30～ 2 80…     

胰岛素对小鼠早期胚胎体外发育的影响

目的　探讨胰岛素对小鼠体内外来源早期胚胎体外发育的影响。　方法　用添加不同浓度胰岛素和胰岛素+葡萄糖的CZB培养液对小鼠体内外来源胚胎进行体外培养 ,观察囊胚发育率和囊胚细胞数的变化。　结果　小鼠 2 细胞胚胎体外培养 10 2h后 ,0 .0 5 μg/ml胰岛素添加组扩张囊胚率、孵化囊胚率和囊胚细胞数均显著高于其他各浓度添加组。葡萄糖加入显著提高了这一效应。添加 0 .0 5 μg/ml胰岛素和葡萄糖的CZB培养液同样显著提高体外受精 (IVF)胚胎的孵化囊胚率和囊胚细胞数。　结论　添加胰岛素和葡萄糖培养液对体内或IVF小鼠胚胎发育具有相同的促进作用。     

不同形态及发育结局D3胚胎培养液中HCG水平比较

目的 探讨胚胎培养液中HCG水平与胚胎发育的关系，评估胚胎源性HCG在胚胎质量评估中的应用价值。方法 采用电化学发光法检测IVF-ET患者D3胚胎培养液中的HCG(D3-HCG)浓度，记录D3胚胎细胞数、是否均匀、碎片率、胞浆颗粒和空泡、融合情况及囊胚培养结局，比较不同形态及囊胚培养结局胚胎的D3-HCG水平差异。结果 D3-HCG水平在4～6细胞组与7～9细胞组间(F=3.331,P=0.038)、D5囊胚组与D6囊胚组间(t=-2.710,P=0.008)、D3胚胎融合组与非融合组间(t=2.659,P=0.008)差异均有统计学意义；D3-HCG水平在其他胚胎形态及囊胚培养结局分组间的差异无统计学意义。结论 是否形成囊胚及囊胚质量与D3-HCG水平不存在相关性，胚胎的发育速度与D3-HCG水平有一定关联，D3-HCG浓度检测应用于胚胎优选的价值有待进一步验证。     

孤雌生殖的胚胎干细胞研究进展

人类胚胎干细胞可以在体外诱导分化成为人体的各种细胞 ,用于医学临床和科学研究。由于胚胎干细胞来源于胚胎 ,在某些国家和地区受到宗教、道德和伦理的制约。孤雌生殖的胚胎干细胞具有与胚胎干细胞相同的全能性和增殖性 ,可以在体外诱导分化成为体内的各种细胞。本文就孤雌生殖的胚胎干细胞的体外建系、定向分化的研究进展作一综述     

E16.5小鼠胚胎胰腺组织移植治疗实验性糖尿病

目的 以小鼠E16.5胚胎胰腺组织移植为例,探索早期胚胎胰腺组织移植对糖尿病的治疗效果.方法 STZ诱导建立雄性C57BL/6小鼠糖尿病模型,随机分成移植组(TX组)、糖尿病假手术组(SO组).TX组(n=9):C57 BL/6小鼠肾被膜下移植5～7个E16.5 d胚胎胰腺组织,SO组(n=6):肾被膜下注入50μl RPMI1640培养液.每日记录小鼠的体重,每周两次检测小鼠血糖水平.TX组小鼠血糖水平≤11.2 mmol/L后,IPGTT和IPITT方法观察移植的胚胎胰腺组织内分泌功能,摘除移植物后观察小鼠的血糖变化.ELISA方法检测胚胎血清、移植前后E16.5胚胎胰腺组织(3.3 mmol/L和16.7 mmol/L)糖刺激胰岛素分泌量.观察移植前后E16.5胚胎胰腺组织胰岛素和胰高血糖素表达情况.结果 TX组移植后4～6周,受体血糖较移植前降低(13.4 ±6.5比28.9±2.5,P＜0.05),体重增加(P＜0.05);与SO组相比较,TX组高血糖症状明显得到控制(P＜0.001).IPGTT和IPITT结果表明移植的胚胎胰腺组织可根据血糖水平变化调节胰岛素分泌.ELISA结果示E16.5小鼠胚胎组织已有胰岛素分泌,移植后受体的胚胎胰腺组织较移植前胰岛素分泌量显著增加.免疫组织化学示移植后E16.5胚胎胰腺组织胰岛素和胰高血糖素的表达水平显著高于移植前.结论 早期胚胎胰腺组织移植能有效表达分泌胰岛素,调控受体血糖,使受体的体重和血糖达到正常水平.     

胚胎DNA检测用于骨髓移植

该技术是从体外受精的胚胎中取DNA来检测性别、染色体异常和组织类型等特征，或是将其同其他的DNA样本“配型”。操作程序要求从发育中的胚胎取出一个细胞，有可能给胚胎带来一定程度的风险。当胚胎带有移植所需的配型DNA或是没有可疑的异常，就可以将其植入，顺利的话就能成功妊娠并健康分娩。     

多因子联合诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞

目的 建立有效的体外诱导人胚胎干细胞(hESCs)分化为肝细胞样细胞的培养体系.方法 将H9 hESC细胞株接种到基底膜提取物包被的培养板上,序贯加入含有下列诱导因子的分化培养基诱导分化:100μg/L细胞因子活化素A( activin A)诱导3d,20 μg/L骨形成蛋白4(BMP-4)和10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导4d,10μg/L肝细胞生长因子(HGF)诱导5d,最后以含10 μg/L制瘤素M(OSM)及1×10-7 mol/L地塞米松(Dex)的培养液继续诱导4d.于细胞诱导分化第16天,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫荧光检测分化细胞肝脏特异性基因和蛋白表达水平;过碘酸-雪夫反应(PAS)试验和吲哚氰绿(ICG)摄取试验检测分化细胞是否具备肝细胞功能.结果 activin A、BMP-4、bFGF、HGF、OSM和Dex联合诱导的分化细胞具有类似肝细胞的形态结构,呈多角形或卵圆形;RT-PCR结果显示分化第16天的细胞表达甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白7(CK7)、细胞角蛋白19(CK19)、肝细胞核因子-4α(HNF4-α)、1-抗胰蛋白酶(AAT)等肝脏特异性基因;免疫荧光化学检测结果显示分化第16天的细胞表达AFP、ALB、CK19、CYP7A1等肝脏特异性蛋白;PAS试验及ICG试验显示分化细胞具备糖原合成和ICG摄取释放等肝细胞功能.结论 体外联合多种诱导因子可诱导hESCs定向分化为肝细胞样细胞.     

鼠胚胎干细胞诱导分化内皮样细胞

目的 采用简单贴壁培养方法诱导胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)分化为内皮样细胞,为组织工程血管及细胞替代治疗提供新的种子细胞.方法 小鼠ESC株SV129按2×104个/cm2密度传代培养,采用ESC培养基添加1 000 U/mL白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)维持其未分化状态.撤除LIF,ESC悬浮培养形成拟胚体(embryoid body,EB),将培养第4天的EB置于含VEGF的培养基中贴壁培养,诱导分化.采用免疫组织化学染色、流式细胞仪分析、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine-labeledacetylated low density lipoprotein,DiI-Ac-LDL)摄取实验以及透射电镜检查鉴定分化细胞的性质.结果 分化产生的内皮样细胞具有内皮细胞形态特征,能摄取DiI-Ac-LDL.ESC诱导分化培养产生的第15代细胞免疫组织化学染色呈Flk-1和CD31阳性;流式细胞仪检测ESC传至9代后CD31阳性细胞>90%;透射电镜可见怀布尔-帕拉德体及内皮细胞间紧密连接.结论 采用简单贴壁培养的方法,单独使用VEGF即可诱导ESC分化为内皮样细胞.诱导培养方法操作简便,经济实用,可为组织工程血管及细胞替代治疗提供所需内皮样细胞.