巢式PCR在乙肝病毒X基因检测中的应用

目的:探讨巢式PCR方法在乙肝病毒X基因(HBV X)检测中的意义.方法:随机抽取中国医学科学院肿瘤医院1998年1月至2000年12月的8例HCC标本石蜡切片,提取组织DNA,应用巢式PCR法进行HBV X基因检测.结果:在8例标本中,7例在200 bp～300 bp处出现条带,大小符合引物设计HBV X基因,检出率为87.5%.结论:应用巢式PCR法进行HBV X基因检测具有方法简单、敏感性高等特点,可用于石蜡切片等少量标本的检测.     

半巢式聚合酶链反应在浆膜腔细菌感染诊断中的初步应用

目的观察革兰分型半巢式聚合酶链反应(PCR)在浆膜腔细菌感染诊断中的应用价值。方法对30例浆膜腔积液标本,以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物和一条革兰阴性菌特异性引物,以半巢式PCR方法进行检测,并同时作细菌培养。结果以通用引物对30例标本作第1次PCR,11例扩增出371bp长度的DNA片段,阳性率为36.7%;对阳性PCR产物再以革兰阴性菌特异性引物作第2次PCR,9例扩增出353bp的DNA片段即为革兰阴性菌。对此30例标本作细菌培养,阳性率为16.7%,低于PCR扩增法。5例标本细菌分离结果与半巢式PCR革兰分型结果相同。结论革兰分型半巢式PCR方法能够灵敏地检测细菌并作出革兰阴性、阳性分型,对于浆膜腔感染的早期诊断具有较好的应用价值。     

巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织标本中WIF-1基因启动子异常甲基化

目的:采用一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested-MSP,nMSP),检测外科手术切除新鲜组织、石蜡包埋组织及纤维支气管镜活检组织中WIF-1基因启动子的异常甲基化状态。方法:将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果:在3种类型的原发性非小细胞肺癌标本中都检测出了WIF-1基因启动子的异常甲基化。结论:巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化的分析。     

聚合酶链反应检测复发性口腔溃疡患者石蜡切片中的幽门螺杆菌

目的：建立检测石蜡切片中幽门螺杆菌的PCR方法，明确复发性口腔溃疡患者口腔中是否存在幽门螺杆菌。方法：利用幽门螺杆菌保守的16SrRNA基因设计一对引物，通过PCR方法检测复发性口腔溃疡患者病理石蜡切片中的幽门螺杆菌，其中实验组复发性口腔溃疡者病理标本50例，对照组口腔外科手术标本20例。结果：PCR方法具有较好的特异性和敏感性，复发性口腔溃疡患者病理标本幽门螺杆菌DNA阳性率为42％（21／50），对照组标本阳性率为5％（1／20）。结论：PCR方法能敏感检测口腔石蜡病理切片中的幽门螺杆菌。复发性口腔溃疡患者口腔中存在幽门螺杆菌。     

结节病患者皮肤及淋巴结组织中分枝杆菌基因的检测和鉴定

目的 探讨分枝杆菌在结节病发病中的作用.方法 采用巢式聚合酶链式反应.限制性片段长度多态性和PCR产物测序的方法,对31例福尔马林固定.石蜡包埋的结节病组织标本(皮肤19例,淋巴结12例)、14例正常皮肤石蜡标本和3例皮肤结核石蜡标本进行检测.结果 19例结节病皮肤标本中,有4例(21.1%)扩增出相对分子质量为65 000的分枝杆菌热休克蛋白基因,其中l例为结核分枝杆菌,2例为龟分枝杆菌,1例为戈登分枝杆菌.12例结节病淋巴结组织和14例正常皮肤组织标本中均未检测到分枝杆菌基因.3例皮肤结核标本中检测出结核分枝杆菌基因.结论 分枝杆菌可能与皮肤结节病发病有关.     

P53基因突变在肾母细胞瘤石蜡标本中的检测

野生型P53 基因为一抑癌基因 ,它使细胞停留在G1期 ,也可启动细胞的凋亡程序 ,因而可以阻止机体中有遗传损伤细胞的繁殖 ,防止肿瘤的发生。一旦野生型P53 基因发生突变 ,则这些细胞就有产生恶变的可能。我们利用PCR SSCP方法检出一例于 1999年 4月存档的肾母细胞瘤石蜡标本存在P53 基因第 7外显子基因突变 ,并对该病例进行分析、追踪 ,观察P53 基因突变对肿瘤愈合的影响。1　研究对象肾母细胞瘤石蜡标本 2例 ,肝母细胞瘤石蜡标本 2例 ,正常肝组织石蜡标本 1例。2　研究方法1)　石蜡标本的DNA提取 :将 3～ 4片厚度为 6 μm石蜡切片放入…     

聚合酶链反应阵列同时定量检测37种白血病融合基因

目的建立一种同时定量检测多种白血病染色体易位形成的融合基因的荧光实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）方法,了解阵列式PCR的应用可行性。方法组合使用82条引物,设立66个PCR平行管,同时定量检测37种白血病常见融合基因形成的125种剪切体和4种白血病常见的原癌基因活化。实时定量PCR采用Eva Green荧光染料法,用ABL基因做内参,用比较Ct法进行相对定量。用此方案对31例白血病患者标本进行检测,其中6例慢性粒细胞白血病（CML）患者做治疗前后或治疗过程中不同时间的对比检测,28人次与多重巢式PCR方案的检测结果进行对照。结果我们建立的PCR阵列方案有较大的线性检测范围（10^2～10^8拷贝／μl）,有较高的检测灵敏度（232拷贝／μl）和精确性;在31例患者标本的检测中,共检测到14种融合基因类型和所有4种原癌基因活化;检测到一例同时有5种融合基因阳性和两种原癌基因活化的患者;和多重巢式PCR检测结果的对比显示本方案灵敏度略低于巢式PCR,但差异没有统计学意义（P=0．009）;6例CML患者标本的检测显示治疗后患者标本中BCR／ABL融合基因及WT1和EVI1原癌基因表达量均呈现不同程度的降低,与临床治疗情况符合;基因定量分析的结果表明本方案能够对常见白血病融合基因和癌基因活化情况进行定量分析,在白血病的诊断及疗效监测中有应用价值。结论PCR阵列法同时定量检测多种白血病融合基因适于白血病初诊患者融合基因的筛查及微小残留病（MRD）的检测,对于检测同时有多种融合基因存在的病例及治疗过程中融合基因的变异情况更为有用。     

用显微切割-PCR检测石蜡标本微小病灶DNA异常

目的 :探讨在石蜡切片中行显微切割 PCR检测微小病灶基因突变和微卫星不稳定的方法及意义。方法 :选取本室实验性大鼠肺鳞癌浸润癌伴有支气管粘膜上皮增生、鳞状化生和 或不典型增生的蜡块标本 19例 ,分别切割各病变阶段组织并提取DNA用作PCR模板 ;SSCP检测P5 3基因第 5～ 8外显子突变及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测微卫星点ADRB2 的不稳定现象。结果 :7例支气管粘膜上皮增生 ,1例鳞状化生 ,12例不典型增生 ,19例浸润癌组织都分别成功地显微切割并提取DNA。除 1例上皮增生及 2例不典型增生组织PCR扩增失败外 ,其余切割组织P5 3外显子及微卫星点PCR扩增均获成功。 19例浸润癌组织 10例有P5 3基因突变 ,增生及鳞状化生组织未发现P5 3基因突变 ,10例不典型增生组织有 3例P5 3基因突变 ,这 3例标本中的浸润癌组织也都有相同外显子的突变。所有扩增成功微卫星点均未发现不稳定现象。结论 :在石蜡标本中进行显微切割 PCR检测DNA异常可获得较满意结果。联合应用连续切片 HE染色 显微切割 PCR 银染技术使定点对位分析肿瘤发生发展各阶段微小病灶中基因异常得以实现 ,对于研究癌前病变、不典型增生组织中DNA分子变化有重要应用价值     

细菌16SrDNA基因PCR检测在败血症诊断的临床研究

目的建立细菌16SrDNA基因半巢式PCR检测方法,并与血培养方法比较,评估其在临床败血症的诊断价值。方法针对16SrDNA高度保守区设计半巢式PCR引物,并对92例临床疑为败血症的患者血标本同时进行血培养和16SrDNA基因检测。结果 92例疑为败血症患者16SrDNA基因检测阳性45例,阳性率为48.9%;血培养检测阳性标本24例,阳性率为26.1%。经χ2检验,PCR检测的灵敏性明显高于血培养（P〈0.05）。结论半巢式PCR方法检测细菌16SrDNA基因具有高敏感、高特异及快速的优点,是一种易于推广的早期败血病诊断方法。     

巢式PCR法检测不同类型标本中p16基因启动子过甲基化

目的 介绍一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法，即巢式甲基化特异性。PCR法(nested-MSF，nMSP)，探讨该方法最佳应用条件，并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法 将基因组DNA变性成为单链，用亚硫酸氢盐修饰单链DNA，所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物，进行巢式PCR扩增，最后经凝胶电泳检测目的片段。结果 在3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子的甲基化，比普通的甲基化特异性PCR法具有更高的灵敏度。结论 巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法，可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。     

原发性肝癌患者及慢性乙肝病毒携带者肝组织中乙型肝炎病毒X基因的变异

目的:探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X基因及其变异与原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展的关系。方法:采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,检测22例乙型肝炎表面抗原(hepatitis Bsurface antigen,HBsAg)阳性的HCC患者及15例慢性乙肝病毒携带者(chronic asymptomatic carrier,CAC)患者肝组织中HBVX基因,并对PCR产物进行基因测序,同时检测5例无HBV携带者正常肝脏组织中HBV X基因。结果:22例HCC患者癌组织及15例CAC患者肝组织中HBVX基因检出率分别为68.18%和46.67%,5例正常肝脏组织中均未检测到HBVX基因,差异有统计学意义(P<0.05)。肝癌组织及HBV携带者肝组织中HBV X基因检出率差异无统计学意义(P>0.05)。肝癌组织及携带者肝组织中HBV X基因发生1 762T/1 764A双突变率分别为93.33%和2/7,肝癌组织中双突变率高于携带者肝组织(P=0.004 3),未发现1 762T及1 764A单独发生突变。结论:HCC患者肝组织中HBV X基因检出率高,肝癌组织中发生1762T/1764A双突变的频率高,HBV X基因及1762T/1764A双突变与HCC的发生可能有重要关系。     

两个不同筛选特性的表达HBV X基因肝癌细胞模型的建立

目的：构建两个不同筛选特性的表达HBV X基因肝癌细胞模型。方法：应用脂质体介导转染克隆有HBV X全基因真核表达载体pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X入肝癌细胞HepG2,hygromycin和neomycin筛选单细胞克隆,传代培养一定时期后应用PCR,RT-PCR和Western blot方法鉴定HBV X基因的表达。结果：转染后成功筛选出耐hygromycin或neomycin的单细胞克隆,并能传代培养一定时期。PCR,RT-PCR和Western blot结果显示HBV X基因获得表达。结论:成功构建不同筛选特性的两个HBV X基因表达肝癌细胞模型。     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

Epstein-Barr病毒与肝炎病毒在肝细胞癌发生中的作用

目的EBV作为肿瘤相关病毒已获公认,为探讨EBV与HCC的关系及与肝炎病毒有无协同作用,进行本研究.方法采用PCP、RT-PCR及免疫组化方法检测石蜡包埋HCC标本中EBV、HBV、HCV和HDV.结果PCR测HBVDNA(X基因和(或)S基因)阳性率为56.4%(44例/78例),EBVDNA(BaimH I W和(或)LMP1)阳性率为28.2%(22例/78例).RT-PCR测HCV RNA阳性率为5.6%(1例/18例),HDVRNA阳性率为0(0例/18例).免疫组化测EBVLMP1多定位于肿瘤细胞中.结论EBV在HCC组织中有较高的检出率,值得注意;HBV对HCC发生起重要作用,与EBV无明显关系;本地区HCV发病率不高,但其与EBV在HCC发生中有无协同作用值得进一步研究.HDV与HCC无明显关系.     

血清乙肝病毒X基因的检测方法及意义

目的 探讨血清乙肝病毒（ＨＢＶ）Ｘ基因的检测方法及肝病患者Ｘ基因检测的意义。方法 通过ＰＣＲ扩增法探讨ＨＢＶ Ｘ基因的检测方法,对扩增产物的序列进行测序分析,并对３０例肝癌及３２例肝硬化患者血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ与Ｘ基因进行检测。结果经琼脂糖电泳与序列分析表明,扩增产物与Ｘ基因序列一致。血清学检测显示,２例肝癌与２例肝硬化患者血清中Ｘ基因检测阳性,但ＨＢｓＡｇ检测阴性。结论 应用ＰＣＲ法能在血清中扩增出完整Ｘ基因片段,为研究Ｘ基因的序列变化与肝癌发生的关系提供了一个有效途径。部分肝病患者血清ＨＢｓＡｇ阴性,但在血清中能检出Ｘ基因,提示肝组织中存在Ｘ基因整合。     

肝癌中乙型肝炎病毒整合位点的研究

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）在肝细胞染色体上的整合规律及其在肝癌形成中的作用.方法以蛋白酶消化/酚抽提法,自40例乙肝相关性肝癌标本中抽提组织DNA.以肝癌组织DNA为模板,HBV X基因上游序列和人类基因组Alu重复序列为引物,多聚酶链反应法（PCR）扩增出HBV X基因及其侧翼的人基因组DNA片段.PCR产物割胶回收后以ABI公司3700测序仪进行全自动测序,所获结果经NCBI（national center for biotechnology information）BLAST及MapViewer检索确定HBV整合在染色体上的精确位置.结果在40例乙肝表面抗原阳性的肝癌组织中,有34例（85%）存在HBV整合现象.每份标本中的病毒整合拷贝数为1～5个不等,因此共获得了68个病毒整合位点.从病毒基因分析,整合可发生于X基因的任何长度,并不集中于通常认为的HBV DR1和DR2区,但在96%（65/68）的整合中,X基因均以截短形式插入宿主细胞DNA;从宿主基因分析,HBV偏好插入于基因的内含子和上游调控区,未见外显子中的插入.这些基因80%已被报道与肿瘤有关,它们的产物大多与细胞基本生存和死亡密切相关,可在各个细胞调控环节上促进肿瘤生成.十分有意义的是,在总共26个基因中即有3个基因（myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 4,Gprotein alpha transducing activity polypeptide 1和fibronectin 1）发现被HBV重复整合.结论HBV在肝癌细胞染色体上的整合并不呈均衡分布,病毒对宿主细胞的＂插入诱变＂及整合子中持续表达的＂截短型X蛋白＂可能在病毒的致癌过程中起重要作用.     

乙肝病毒突变体HBx-d382 PCR检测方法的建立及临床应用

目的建立检测乙肝病毒突变体HBx-d382的PCR方法,探讨HBx-d382突变体在诊断HBV相关肝细胞癌中的应用价值。方法运用生物信息学和核苷酸合成的方法,设计和合成检测乙肝病毒突变体HBx-d382的特异性引物。采用PCR方法对82份HBV相关肝细胞癌病人血清、96份慢性HBV感染者血清和20份正常对照者血清中HBx基因进行检测。采用基因测序法对HBx基因进行分析,并与PCR结果进行比较。结果在慢性HBV感染者和肝细胞癌病人血清中,HBx-d382的检出率分别为2.1%与17.1%。与慢性HBV感染者相比,肝细胞癌病人血清中HBx-d382检出率较高(χ2=4.21,P0.05),且PCR检测结果与基因测序结果相符。结论肝细胞癌病人血清中存在乙肝病毒突变体HBx-d382,采用PCR方法检测HBx-d382突变体对早期诊断HBV相关肝细胞癌有一定的价值。     

HBV相关肝细胞癌患者HBV前S/S基因变异的分析

目的:研究肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者体内乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)前S/S基因变异特点.方法:分别对9例乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性肝癌患者及其家族中11例HBsAg阳性者血清乙肝病毒前S/S基因PCR扩增克隆.测序并进行结构分析.找出基因变异活跃位点,再对两组资料作统计学分析.结果:除对照组中1例未能扩增出前S/S基因,仅能扩增出S基因,其它样本均扩增出前S/S基因片段.所有HBV株均为B或C基因型和adrq 或adw2血清型.肝癌患者来源的HBV在包膜蛋白抗体结合区点突变发生率较高,但与对照组相比,没有统计学差异(P＞0.05).肝癌组4例发生HBV前S区删除变异,具有特异性.与对照组(0/10)相比,有统计学差异(P＜0.05).结论:HBV前S/S区点突变可能与肝癌发生没有相关性,而前S区删除变异可能与肝癌发生有密切联系,应当对HBV感染者进行前S区基因变异监测.     

乙型肝炎病毒诱发肝细胞癌分子机制研究进展

乙型肝炎病毒（HBV）诱导肝细胞癌（HCC）的发生是一个多阶段、多因素相互作用的复杂过程。HBV促进HCC发生、发展的途径主要包括HBV DNA整合至宿主肝细胞基因组从而影响整合位点的基因功能、形成致癌作用的截短蛋白、造成宿主基因组的不稳定,HBV基因组S、C、X区基因突变,HBV X基因编码的HBx蛋白激活原癌基因、抑制抑癌基因等。本文综述了近年来HBV诱发HCC分子机制的研究进展,以期为HCC预防、早期预测及术后辅助治疗提供理论指导。     

乙型肝炎病毒感染与肝细胞癌关系的新进展

乙型肝炎病毒(HBV)与肝细胞癌(HCC)关系密切,其中,HBV基因变异会引起自身生物学特性、致病性等改变,并直接影响HCC进程。与HCC发生、发展关系密切的HBV基因变异包括S区变异、前C区变异和X区变异等。此外,核苷类药物治疗中所出现的耐药与PreS/S突变也有一定关联。现对近年来HBV感染与HCC间研究的新进展予以综述,旨在说明HBV感染在HCC的发生、发展中扮演着重要角色。