异常黑胆质成熟剂黄酮类化合物诱导HepG2细胞凋亡机制的研究

目的：观察异常黑胆质成熟剂中黄酮类化合物对人肝癌细胞株(HepG2)体外生长、凋亡及相关基因表达的调控作用,探讨异常黑胆质成熟剂黄酮类化合物诱导癌细胞凋亡及抗癌活性的物质基础及其作用机制。方法：采用四氮甲基唑蓝法(MTT)、琼脂糖凝胶电泳技术、流式细胞术及逆转录-多聚酶链式反应技术(RT-PCR)等,观察异常黑胆质成熟剂黄酮类化合物对HepG2生长、凋亡及凋亡基因调控的影响。结果：异常黑胆质成熟剂黄酮类化合物明显抑制HepG2细胞体外生长,HepG2细胞在sub-G₁期受到阻滞,并能诱导细胞发生凋亡,明显下调Bcl-2 mRNA表达水平,同时可上调p53,p21,Bax基因mRNA表达水平。结论：异常黑胆质成熟剂黄酮类化合物对癌细胞体外生长、凋亡及凋亡基因表达具有明显的调控作用。黄酮类化合物可能是异常黑胆质成熟剂发挥抗癌作用的主要活性成分,而抑制细胞生长、诱导细胞凋亡及调控凋亡基因表达等可能是其发挥抗癌活性的重要途径。     

异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物对HepG2细胞m~5dC及8-OH-dG形成的影响

目的:观察异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物对人肝癌细胞株(HepG2)细胞5-甲基脱氧胞核嘧啶(5-methyldeoxycytosine,m5dC)及8-羟基-2′-鸟嘌呤脱氧核苷酸(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine,8-OH-dG)等表遗传信息的影响,从而探讨异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物抗癌作用的分子生物学机制。方法:采用高效液相色谱联用紫外检测技术(HPLC-UV),分别观察以2.5、5.0及7.5mg/ml浓度的异常黑胆质成熟剂水提物或醇提物作用48h后,对HepG2细胞m5dC及8-OH-dG形成的抑制作用。结果:异常黑胆质成熟剂水提物作用后,HepG2细胞m5dC生成率分别为27.02、4.2及18.6%,而醇提物分别为23.5、20.2及16.8%,与空白对照组(34.0%)比较均具有显著性差别(P<0.05);异常黑胆质成熟剂水提物作用后,HepG2细胞8-OH-dG的生成率分别为0.58、0.45及0.32%,醇提物分别为0.46、0.36及0.23%,与空白对照组(0.69%)比较具有明显差异(P<0.05)。结论:异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物对HepG2细胞m5dC及8-OH-dG等表遗传学信息的产生具有浓度依赖性的抑制作用,而醇提物的作用优于水提物,说明抑制癌细胞m5dC及8-OH-dG等表遗传学信息的产生是异常黑胆质成熟剂抗癌作用的重要分子生物学机制之一。     

异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物对HepG2细胞m5dc及8-OH-cG形成的影响

目的：观察异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物对人肝癌细胞株（HepG2）细胞5-甲基脱氧胞核嘧啶（5-methyldeoxycytosine,m5dC）及8-羟基-2′-鸟嘌呤脱氧核苷酸（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine,8-OH-dG）等表遗传信息的影响,从而探讨异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物抗癌作用的分子生物学机制.方法：采用高效液相色谱联用紫外检测技术（HPLC-UV）,分别观察以2.5、5.0及7.5mg/ml浓度的异常黑胆质成熟剂水提物或醇提物作用48h后,对HepG2细胞m5dC及8-OH-dG形成的抑制作用.结果：异常黑胆质成熟剂水提物作用后,HepG2细胞m5dC生成率分别为27.0、24.2及18.6%,而醇提物分别为23.5、20.2及16.8%,与空白对照组（34.0%）比较均具有显著性差别（P＜0.05）;异常黑胆质成熟剂水提物作用后,HepG2细胞8-OH-dG的生成率分别为0.58、0.45及0.32%,醇提物分别为0.46、0.36及0.23%,与空白对照组（0.69%）比较具有明显差异（P＜0.05）.结论：异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物对HepG2细胞m5dC及8-OH-dG等表遗传学信息的产生具有浓度依赖性的抑制作用,而醇提物的作用优于水提物,说明抑制癌细胞m5dC及8-OH-dG等表遗传学信息的产生是异常黑胆质成熟剂抗癌作用的重要分子生物学机制之一.     

异常黑胆质成熟剂及清除剂对氧化应激诱导的淋巴细胞损伤及基因表达影响的比较研究

目的:以H2O2诱导淋巴细胞的氧化应激模型,观察研究异常黑胆质成熟剂及清除剂对活性氧诱导的细胞损伤和Bcl-2蛋白表达的作用效应的差异。方法:用"彗星实验"(SCGE)和MTT法观察异常黑胆质成熟剂及清除剂对氧化应激的淋巴细胞DNA损伤和细胞生长活性的影响;并采用western-blot研究淋巴细胞Bcl-2蛋白的表达。结果:异常黑胆质成熟剂对氧化应激诱导的淋巴细胞DNA和细胞损伤有保护性作用,而清除剂的作用明显不同;异常黑胆质成熟剂能上调Bcl-2蛋白的表达,而清除剂能下调该蛋白的表达,二者的作用相反。结论:异常黑胆质成熟剂及清除剂对氧化应激的淋巴细胞损伤以及细胞凋亡相关基因表达的作用明显不同。     

垂盆草醇提物抑制HepG2细胞STAT-3信号通路诱导细胞凋亡的研究

目的:研究垂盆草醇提物对STAT-3信号通路的影响,及其诱导细胞凋亡的分子机制。方法:MTT法检测垂盆草醇提物对HepG2细胞增殖的影响;流式细胞术分析结合FITC-Annexin V/PI双标记检测对肝癌细胞凋亡的影响,免疫印迹试验检测细胞凋亡Caspase-3,Caspase-9,PARP,P-STAT-3(Tyr705),STAT-3,Bcl-2,Mcl-1相关蛋白表达水平。结果:垂盆草醇提物可明显抑制HepG2细胞的增殖,诱导HepG2细胞凋亡,且抑制作用呈剂量依赖效应。垂盆草醇提物作用后,抑制STAT-3信号转导通路,下调Mcl-1和Bcl-2的表达,引起凋亡相关蛋白Caspase-3,Caspase-9的降解/活化及PARP的降解,并呈剂量依赖效应。结论:垂盆草醇提物通过抑制STAT-3信号转导通路和Mcl-1和Bcl-2的表达,进而抑制HepG2细胞的增殖,诱导其凋亡。     

白及茎秆抗肿瘤作用的初步研究

目的:初步研究白及茎秆醇提物的化学成分和抗肿瘤作用,更好地开发利用白及药用资源。方法:采用乙醇回流法提取白及茎秆和块茎醇提物,对醇提物进行化学成分分析。不同剂量白及茎秆醇提物处理体外培养的肺腺癌细胞(A549),用MTS法检测A549细胞的增殖情况,划痕法检测A549细胞的迁移率,Hoechst-PI染色法检测白及茎秆醇提物对A549细胞凋亡的影响,RT-PCR法检测白及茎秆醇提物对A549细胞Bcl-2、Bax和ICAM-1基因mRNA表达的影响。结果:白及茎秆醇提物化学成分同块茎类似,并能抑制A549细胞的增殖,且存在剂量依赖关系。随着药物浓度的增加,Bcl-2、ICAM-1 mRNA表达下调,Bax mRNA表达上调。结论:白及茎秆醇提物可通过抑制A549细胞的生长增殖,影响细胞凋亡相关基因的表达发挥抗肿瘤作用。白及茎杆有潜力成为块茎的补充资源。     

维药异常黑胆质成熟剂总黄酮对 Bel/Fu 细胞株多药耐药性及mRNA表达的影响

目的研究异常黑胆质成熟剂总黄酮对肝癌Bel/Fu细胞株多药耐药性(MDR)及mRNA表达的影响。方法逆转录聚合酶链式反应法检测细胞内MDR1、MRP、GST-π、TopoⅡα mRNA的表达。结果异常黑胆质成熟剂总黄酮可抑制人肝癌Bel/Fu细胞株MDR1 mRNA的表达,提高TopoⅡα mRNA水平。结论异常黑胆质成熟剂总黄酮抑制MDR1mRNA的表达、提高TopoⅡα mRNA水平是其逆转肝癌MDR的机制。     

维药异常黑胆质成熟剂总酚对宫颈癌细胞体外生长的影响

目的:探讨维药异常黑胆质成熟剂总酚治疗人宫颈癌的可行性。方法:分别用不同浓度的异常黑胆质成熟剂总酚作用于人宫颈癌Hela细胞及SiHa细胞,于作用后24、48、72、96 h,用倒置显微镜观察细胞形态学变化,MTT比色法测定各组细胞的抑制率和半数抑制浓度(IC50)。结果:在25～125μg/mL浓度区间,总酚对Hela细胞的增殖有明显的抑制作用;在75～175μg/mL浓度区间,总酚对SiHa细胞的增殖有明显的抑制作用,且对2种细胞的抑制作用都呈明显的量效关系和时效关系(P<0.01);总酚作用于Hela细胞后48 h的IC50=(125.26±16.15)μg/mL,而作用于SiHa细胞后48 h的IC50=(134.51±2.55)μg/mL。两者比较差异无统计学意义(P>0.05);两种细胞经总酚作用后均出现明显的凋亡特征,且随着药物浓度增高及作用时间延长细胞形态学变化更明显。结论:异常黑胆质成熟剂总酚能抑制宫颈癌Hela细胞及SiHa细胞体外生长,且对两种宫颈癌细胞的抑制作用基本相同。故异常黑胆质成熟剂总酚可作为临床治疗宫颈癌的药物进一步深入研究。     

壁虎醇提物对人食管癌细胞EC9706增殖及凋亡蛋白表达的影响

目的 研究壁虎醇提物对人食管鳞癌细胞株EC9706的生长抑制作用及其机制.方法 通过MTT法检测不同浓度、不同时间壁虎醇提物对人食管鳞癌细胞的生长抑制作用;倒置显微镜观察不同浓度壁虎醇提物作用细胞24 h后细胞形态的改变;吉姆萨染色后光学显微镜下观察细胞凋亡的形态改变;SP免疫组化法检测细胞内凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达.结果 6～8 mg/ml壁虎醇提物作用于细胞24,48,72 h后能够明显抑制EC9706食管鳞癌细胞株的生长(P<0.01,与阴性对照比较),抑制率分别为13%～76%, 37%～88%, 54%～93%,抑制作用呈剂量和时间依赖性;Geimsa染色可见凋亡细胞;免疫组化结果显示,壁虎醇提物(6,7 mg/ml)处理细胞24 h后,与阴性对照组比较,细胞内Bcl-2蛋白无明显变化,而Bax蛋白表达升高,Bax/Bcl-2比值升高.结论 壁虎醇提物能够抑制EC9706细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值升高有关.     

白桦酯醇对SKOV3肿瘤细胞调亡作用的影响

目的：通过研究白桦酯醇对卵巢SKOV3生长、细胞周期及凋亡相关基因的影响,探讨白桦酯醇抗肿瘤活性及其可能的作用机制。方法：应用MTT法检测白桦酯醇对SKOV3的生长抑制率;荧光染色法检测细胞凋亡;Western blot法检测Caspase-3表达的影响。流式细胞术检测肿瘤细胞周期。结果：MTT法检测白桦酯醇的IC50为143.5μg/mL,且细胞抑制率随白桦酯醇的浓度的增高而增高,呈明显的时间和剂量的依赖性;白桦酯醇处理后的SKOV3细胞凋亡率增加,Caspase-3表达量增加,且可使SKOV3发生G2/M期阻滞。结论：白桦酯醇在体外能抑制肿瘤细胞生长,其可能机制为阻滞细胞周期,并且激活Caspase-3,增加Caspase-3的表达量,从而引起肿瘤细胞的凋亡。     

脂脉宁对香烟提取物诱导血管内皮-304细胞损伤的保护作用

目的观察脂脉宁药物血清对香烟提取物（CSE）诱导的血管内皮（VEC）-304细胞损伤的影响。方法将培养细胞分为CSE组、空白组、脂脉宁大剂量组、脂脉宁小剂量组。采用MTT、免疫组化和TUNEL等方法,观察各组细胞存活率和凋亡率、相关凋亡蛋白表达及氧化反应指标的变化。结果CSE组存活率最低,凋亡率最高,Wp53、p21、Bax、CaspaSe-3表达均明显升高,Bcl-2、mp53表达降低,超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）、总抗氧化能力（T-AOC）活性、谷胱甘肽（GSH）含量均降低,丙二醛（MDA）含量及-氧化氮合酶（NOS）活性升高,与空白组比较差异有统计学意义;脂脉宁大,小剂量组存活率明显升高,凋亡率降低,Wp53、p21,Bax、Caspase-3表达下调,Bcl-2、mp53表达上调;SOD、GSH-Px、T-AOC活性及GSH含量均升高,MDA含量及NOS活性降低,而脂脉宁大剂量组更明显。结论CSE诱导的VEC-304细胞凋亡与其过氧化反应密切相关,脂脉宁有抑制细胞凋亡及抗氧化作用。     

志苓胶囊对人小细胞肺癌细胞系NCI-H446增殖抑制和诱导凋亡的影响

目的研究志苓胶囊（ZLJN）对人小细胞肺癌细胞系NCI-H446增殖影响及诱导凋亡作用。方法将志苓胶囊按其不同的中西药成分配制成不同浓度的中药组、西药组和复方组,与NCI-H446共培养后,采用MTT比色法、集落形成试验,分别检测细胞存活率和集落形成率。通过流式细胞仪进行DNA倍体分析、Bcl-2蛋白表达、线粒体跨膜电位及Caspase-3活性检测;DNA片段化分析法、Annexin V-FITC标记法、TdT酶介导的原位缺口末端标记法（TUNEL）检测凋亡细胞。结果不同浓度的药物组与NCI-H446共培养后,细胞生长明显受抑制,细胞集落形成率明显降低,呈浓度依赖性;各药物组处理后的细胞线粒体跨膜电位和Bcl-2蛋白表达水平下降,Caspase-3活性增强;琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA梯形带;各药物组均检测到明显的亚二倍体G1峰（凋亡峰）;Annexin V-FITC法检测到早期凋亡细胞;TUNEL法检测到晚期凋亡细胞。复方组诱导细胞凋亡作用强于中药组和西药组。结论志苓胶囊可以有效抑制NCI-H446细胞增殖,诱导其凋亡,细胞线粒体跨膜电位水平降低,Caspase-3活性增强和Bcl-2表达下调可能参与了该过程。     

姜黄素抑制人胃癌BGC-823细胞生长并诱导其凋亡的机制研究

目的:探讨姜黄素抑制人胃癌BGC-823细胞生长并促人胃癌BGC-823细胞凋亡的生物学作用及其调控机制。方法:常规体外培养对数生长期胃癌BGC-823细胞,细胞分为对照组,低、中、高姜黄素处理组四组,姜黄素浓度分别为0mg/L5,mg/L1,0mg/L,20mg/L。姜黄素处理24h后,采用甲基噻唑(MTT)比色法及流式细胞仪测定细胞增殖水平及细胞凋亡率;采用免疫组化法测定细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达;采用PCR检测Caspase-3的mRNA表达水平。结果:MTT检测显示姜黄素能抑制人胃癌BGC-823细胞増殖,呈现浓度依赖性;流式细胞仪显示姜黄素能有效诱导细胞的凋亡,呈现浓度依赖性,其中20mg/L姜黄素处理24h后细胞凋亡率为48.3%;免疫组化试验表明姜黄素处理使人胃癌BGC-823细胞中Bax表达水平上调,同时Bcl-2蛋白表达水平下调;且细胞中Caspase-3的mRNA表达水平受姜黄素诱导而增高。结论:姜黄素对人胃癌BGC-823细胞的增殖具有明显抑制作用,呈浓度依赖性促进细胞凋亡,这种生物学效应可能与激活Bax蛋白表达、抑制Bcl-2蛋白表达而活化Caspase-3的信号通路有关。该研究为深入探讨姜黄素诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡的机制提供了重要依据。     

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??OBJECTIVE To investigate the effect of 1-cyclopropyl-6-fluoro-7-(piperazin-1-yl)-3-[5-benzylsulfanyl-4-(3,4,5-trimethoxybenzylidene) amino-4H-1,2,4-triazol-3-yl]-quinolin-4(1H)-one (M27) on apoposis in hepatocarcinoma SMMC-7721 cells in vitro. METHODS SMMC-7721 cells, colon adenocarcinoma cells(HCT-116)and leukemia cell line JURKET were treated by M27 with different concentrations for different time in vitro, the inhibitory effect of M27 and its precursor ciprofloxacin on the cell proliferation were examined by MTT assay. Cell apoptosis was determined by Hoechst 33258 fluorescence staining and TUNEL assay. The effect of M27 on topoisomerase ?? activity was measured using agarose gel electrophoresis by Plasmid pBR322 DNA as the substrate. Mitochondrial membrane potential(????m)was measured by high content screening imaging system. The p53,Caspase-9,Caspase-3,Caspase-8,Bcl-2,Bax and cytochrome C protein expressions were determined by Western blotting analysis. RESULTS The proliferation of the cancer cells was inhibited by M27 at 10-60 ??mol??L^-1 in time-and dose-dependent manner. Ciprofloxacin showed weak cytotoxicity against SMMC-7721 cell. SMMC-7721 cells treated by M27 with different concentrations for 24 h increased the percentage of apoptosis cells obviously (P<0.05) with a decrease in the mitochondrial membrane potential. Compared with control group, M27 influenced obviously DNA topoisomerase ?? activity, stimulated DNA cleavage and inhibited DNA reunion mediated by topoisomerase ??. In addition, M27 increased protein expression of p53, Bax, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-3, as well as the cleaved activated forms of Caspase-9, Caspase-8 and Caspase-3 significantly, whereas the expression of Bcl-2 decreased. There was a significant increase of cytochrome C in the cytosol after 24 h of treatment with M27 and a decrease in the mitochondrial compartment. CONCLUSION M27 as a fluoroquinolone derivative exerted potent anticancer activity through the mechanism of eukaryotic topoisomerase ?? poisoning. The growth inhibition is mainly mediated via apoptosis-associated mitochondrial dysfunction and regulation of Bcl-2 signaling pathways.     

异黑成熟颗粒调节免疫功能作用的研究

目的：研究畀黑成熟颗粒对正常小鼠免疫功能的影响。方法：将60只昆明种小鼠随机分为空白对照组（0．2ml／10g灌胃生理盐水）、阳性对照组（28．8g／kg／d,六味地黄丸）、异黑成熟颗粒高剂量组（8g/kg/d）、异黑成熟颗粒中剂量组（4g／kg／d）、异黑成熟颗粒低剂量组（2g／kg／d）,每组12只,各组每天灌胃1次,连续给药14d。观察异黑成熟颗粒对正常小鼠巨噬细胞吞噬功能、对DNCB诱导的迟发性变态反应、对血清溶血素抗体生成和免疫器官重量等的影响,评价异黑成熟颗粒对正常小鼠免疫功能的影响。结果：异黑成熟颗粒对正常小鼠免疫器官重量无影响（P〉0．05）;对正常小鼠巨噬细胞吞噬功能无明显影响（P〉0．05）;对DNCB诱导的正常小鼠迟发性变态反应无拮抗作用（P〉0．05）;但是,能够促进正常小鼠血清溶血素抗体的生成（P〈0．05）。结论：异黑成熟颗粒正常小鼠具有一定的免疫调节作用。     

异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质载体动物模型下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节作用研究

目的阐明异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质载体动物模型丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAA)功能的调节。方法根据维吾尔医学理论采用多因素复制小鼠异常黑胆质载体动物模型,并用异常黑胆质成熟剂不同剂量(8.58,17.16,34.32g/kg),14d全程干预给药,此后用ELISA法检测血清ACTH和CORT含量;采用高效液相-荧光检测分析法分析了异常黑胆质载体动物模型小鼠血清和脑去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、3,4二羟基本乙酸(DOPAC)等单胺类神经递质含量。结果异常黑胆质成熟剂不同剂量可以降低异常黑胆质载体动物模型血清NE含量(P<0.01),增加血清DA、5-HT和DOPAC含量(P<0.01),同时发现异常黑胆质成熟剂能降低异常黑胆质载体动物模型脑组织中NE含量(P<0.01),异常黑胆质成熟剂大剂量能增加DA含量(P<0.05),小剂量和大剂量能增加DOPAC含量(P<0.01)。结论提示异常黑胆质成熟剂可能通过参与神经内分泌系统的内在调节,改善异常黑胆质载体动物模型的丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAA)功能的紊乱。     

扶正抑瘤颗粒对小鼠H22肿瘤细胞凋亡及p53和Caspase-3基因表达的影响

目的 研究扶正抑瘤颗粒(FYK)对小鼠H22肿瘤细胞生长的抑制作用,及其对细胞凋亡和p53、Caspase-3基因表达的影响。方法 用体内实验观察FYK对H22瘤株的抑瘤率,流式细胞术测定细胞凋亡率和细胞周期,反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定野生型p53(Wtp53)和Caspase-3的mRNA表达情况。结果 12g／kg、24g／kg FYK均能显著抑制小鼠H22肿瘤细胞的生长,最高抑瘤率为51．24％(P<0．01)。流式细胞术检测表明,FYK显著提高H22肿瘤细胞的凋亡率,最高为15．84％(P<0．01);肿瘤细胞阻滞在G0／G1期,S期细胞比率降低;RT-PCR实验表明,FYK可显著上调p53和Caspase-3 mRNA的表达水平。结论 FYK能显著抑制小鼠H22肿瘤细胞生长,其抗肿瘤机制与诱导细胞凋亡,调控细胞周期,促进Wt p53与Caspase-3基因的表达有关。     

龟鹿二仙胶汤及其拆方对大鼠软骨细胞凋亡基因表达的影响

目的:通过观察龟鹿二仙胶汤及其拆方对SD大鼠软骨细胞凋亡基因表达的影响,比较龟鹿二仙胶汤中各药物组成在全方中的作用。方法:取1月龄SD大鼠膝关节软骨建立软骨细胞体外培养体系,采用实时荧光定量PCR检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53mRNA表达。结果:龟鹿二仙胶、龟甲、鹿角、人参、枸杞、盐酸氨基葡萄糖均可显著抑制大鼠软骨细胞Bax、Caspase-3、P53的表达;龟鹿二仙胶、龟甲、鹿角与盐酸氨基葡萄糖效果相当,人参、枸杞弱于盐酸氨基葡萄糖。结论:龟甲和鹿角是龟鹿二仙胶抑制凋亡的主要物质。龟甲、鹿角峻补阴阳以生气血精髓的作用可以一定程度上从抑制软骨细胞凋亡来体现。人参大补元气、枸杞滋补肾阴,抑制凋亡有效,但效果明显不如龟鹿二仙胶;而4味药共同作用,具有填补精髓、益气壮阳之功,人参、枸杞可以在一定程度上加强龟甲、鹿角抑制软骨细胞凋亡基因的表达。