TaqMan探针双重荧光PCR法检测副溶血性弧菌毒力基因

目的建立同时检测副溶血性弧菌毒力基因tdh和trh的双重荧光PCR方法。方法筛选副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因的特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度实验,并对本实验室保存的54株副溶血性弧菌进行tdh、trh毒力基因的检测,以了解不同来源的副溶血性弧菌携带毒力基因的状况。结果建立的双重荧光PCR方法特异度强(100%),最低检测浓度达到20 cfu/ml,对本实验室保存的副溶血性弧菌进行毒力基因的检测结果显示,从临床分离的10株副溶血性弧菌和海产品样品中分离的1株副溶血性弧菌均为tdh扩增阳性,trh扩增阴性。结论所建立的方法特异性好,灵敏度高,适用于副溶血性弧菌的毒力基因检测。     

应用SYBR Green Ⅰ荧光PCR快速检测副溶血弧菌及其毒力基因

目的利用SYBR Green Ⅰ荧光PCR反应检测副溶血弧菌及其trh和tdh毒力基因。方法根据副溶血弧菌tlh基因设计引物,建立检测副溶血弧菌SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,利用33株副溶血弧菌分离株以及22株其他种属细菌进行特异性和灵敏度评价。根据副溶血弧菌trh和tdh毒力基因序列设计引物,建立检测副溶血弧菌毒力基因的单重和双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,并对这两种方法进行特异性和灵敏度评价。结果本研究中基于tlh基因的荧光PCR检测对全部33株副溶血弧菌检测为阳性,检测下限为5×101拷贝/μl,而22株其他种属细菌均为阴性。毒力基因trh和tdh均能特异性检测,其单重荧光PCR检测下限为5×101拷贝/μl,双重荧光PCR检测下限为5×102拷贝/μl。结论本研究建立了tlh作为靶基因检测副溶血弧菌的单重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法和同时检测副溶血弧菌trh和tdh毒力基因的双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,简化了毒力基因检测,有良好的实际应用前景。     

双重PCR快速检测副溶血弧菌

目的:建立一种快速、敏感、特异的双重PCR方法检测副溶血弧菌.方法:根据GenBank收录的副溶血弧菌tdh、trh、tlh基因序列用vtII软件分别设计引物,应用多重PCR技术同时扩增副溶血弧菌的特异性基因tdh、trh、flh.结果:副溶血弧菌标准株和实验菌株均能扩增一条或两条目的带,扩增产物tdh、trh、tlh片段大小分别为224,466,381 bp.结论:tdh、trh基因分别存在于不同副溶血弧菌株中,而tlh基因在不同副溶血弧菌中都广泛存在,具有种属特异性,因此可以用来特异快速的检测副溶血弧菌.     

利用多重PCR检测食品中副溶血性弧菌的方法研究

目的:建立食品中副溶血性弧菌的简便、快速、准确地检测方法。方法:根据副溶血性弧菌的tl、tdh、trh基因设计引物,多重PCR扩增,进行特异性和标准菌株的验证,并用经典方法做平行试验。结果:本实验设计的引物能特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269、500 bp的片断,而对其它种类的菌无特异性扩增。结论:本实验方法可在增菌后8 h快速、简单、准确的检测出食品中的副溶血性弧菌,灵敏度可达15 cfu/ml。     

环介导等温核酸扩增法快速检测副溶血性弧菌的研究

目的基于环介导等温核酸扩增法(LAMP)建立副溶血性弧菌tlh基因的快速检测方法。方法以副溶血性弧菌tlh基因为扩增的靶序列分别设计外引物、内引物和环引物各1对,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域在恒温条件下扩增靶序列,快速检测副溶血性弧菌。并对该法进行灵敏度、特异度试验,将该方法与荧光定量PCR法检出率进行统计学比较。结果 LAMP法最低检出限为10 fg/μl,灵敏度是荧光定量PCR的10倍;特异度实验中除检出2株副溶血性弧菌外,6株非副溶血性弧菌均未检出;LAMP法与荧光定量PCR法检出率差异无统计学意义(P0.05)。结论 LAMP法具有高特异性、高效性、快速简便易检测等特点,适合现场快速检测,在食物中毒暴发处置中有深远的经济价值。     

实时荧光定量PCR联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法建立与应用

目的建立实时荧光定量PCR法联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒和副溶血性弧菌tlh基因设计特异性引物。通过调整引物浓度和优化反应条件,建立多重荧光定量PCR检测体系,对方法的灵敏度和特异性进行验证。结果多重荧光定量PCR检测方法对诺如病毒、副溶血性弧菌、轮状病毒、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌O157等样本进行检测,未发生交叉反应。结论本研究建立的实时荧光定量PCR法同时检测诺如病毒和副溶血性弧菌灵敏度高、特异性好,能用于食品携带病原微生物和感染性腹泻暴发中诺如病毒和副溶血性弧菌的检测。     

食物中毒中副溶血性弧菌和沙门菌双重荧光PCR检测方法的建立

目的建立双重荧光PCR用于检测食物中毒中副溶血性弧菌和沙门菌。方法设计特异性引物和探针用于扩增副溶血性弧菌tlh基因和沙门菌invA基因(invA),采用倍比稀释法检测方法的DNA灵敏度和菌液灵敏度,采用9株其他肠道致病菌验证方法的特异性。结果两种病原菌DNA检测灵敏度分别为65 fg/PCR和56 fg/PCR体系,菌液检测灵敏度分别为11 cfu/ml和9 cfu/ml,特异度100%。用建立的方法对4起食物中毒进行检测,共检出副溶血性弧菌15株和沙门菌8株。结论该方法高效并具有很高的灵敏性和特异性,在副溶血性弧菌和沙门菌引起的食物中毒的快速检测中具有广阔的应用前景。     

副溶血性弧菌MPCR-DHPLC检测方法的建立

目的:建立多重PCR(Multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(Denaturing High-Performance Liquid Chromatography,DHPLC)检测副溶血性弧菌的方法,并了解该菌携带毒力基因的情况。方法:根据副溶血性弧菌的毒力基因tdh、trh和种特异性基因toxR进行引物设计,以其单一PCR扩增产物在DHPLC出现的色谱峰作为标准色谱峰,建立MPCR-DHPLC的检测方法。结果:该方法能有效扩增副溶血性弧菌的tdh、trh和toxR基因,25株副溶血性弧菌的MPCR扩增产物经DHPLC分析所得的色谱峰在位置和峰型与标准色谱峰有很好的符合性,其他菌属的菌株均无特异性扩增,对模拟污染样品可正确检测,灵敏度达到1*103CFU/ml,特异性达到100%。结论:本文建立的MPCR-DHPLC方法可准确检测副溶血性弧菌,并了解该菌携带毒力基因的情况。     

副溶血性弧菌的免疫捕获PCR检测

目的:将免疫捕获PCR法应用于副溶血性弧菌检测。方法:将脱毒后的副溶血性弧菌作为抗原免疫家兔,得到抗血清包被PCR管,对待检的副溶血弧菌进行免疫捕获,利用捕获到的菌体作为模板进行PCR检测。结果:PCR体系对副溶血性弧菌的tlh基因扩增具有特异性;抗体对副溶血弧菌起到一定程度的富集作用,包被抗血清后使PCR扩增出来的阳性结果更为明显,而抗血清本身没有扩增出DNA条带。结论:该检测方法能够对副溶血性弧菌进行特异性的检测,同时包被抗体的捕获对提高检测灵敏度起到一定的作用。     

基于toxR基因的PCR检测副溶血性弧菌的方法建立

目的建立基于toxR基因的PCR检测副溶血弧菌的方法,并通过实验条件摸索,优化反应体系条件,验证PCR方法检测副溶血弧菌的优势。方法应用基于toxR基因的环引物PCR法和已报道的PCR法对副溶血性弧菌和食品样品进行检测,并优化反应条件。对两种检测方法的灵敏度、特异度和检测时间进行比较。结果环引物PCR法可以使副溶血性弧菌扩增出大小180 bp的toxR基因片段,两种方法检测副溶血性弧菌的特异度均为100%,检出限分别为4×103CFU/mL和5×104CFU/mL,检测所需时间分别为2 h 50 min和3 h10 min。结论基于toxR基因的环引物PCR法检测副溶血性弧菌的特异性更强,检出限更低,检测所需时间更短,能够较好地满足卫生防疫机构快速检测副溶血性弧菌的需要。     

市售生食水产品污染副溶血性弧菌的病原学分析

目的通过对2011～2012年合肥市售生食水产品中分离的副溶血性弧菌血清型、毒力基因和耐药性的研究,了解生食海产品污染的副溶血性弧菌的病原学特征。方法按GB/T4789.7-2008方法进行分离鉴定,用PCR技术检测不耐热溶血素(tlh)基因、耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热直接溶血素相关溶血素基因(trh)。药敏试验采用K-B法。结果两年检获的65株副溶血性弧菌分属11个血清群,以O2(41.54%)、O1(12.31%)、O3(12.31%)群为主。65株菌均不携带tdh和trh毒力基因,tlh基因全部阳性。药敏结果显示,65株菌对15种抗生素显示出较高的青霉素(100.0%)和氨苄西林(95.4%)耐药性。结论近年来合肥市售生食水产品中污染的副溶血性弧菌以O2血清型为主,tdh基因和trh基因均为阴性。     

2011-2014年北京市副溶血性弧菌血清型 及毒力基因特征分析

摘要:目的　了解2011-2014年北京市引起腹泻的副溶血性弧菌血清分型及主要毒力基因特点。方法　对561株副溶血性弧菌进行生化鉴定和血清学分型试验,应用实时荧光PCR方法检测毒力基因tlh、tdh和trh。结果　561株副溶血性弧菌有9个O群和23个K型,共34个血清型,以O3∶K6血清型为主,占67.6%（379/561）。2011-2014年血清型分布存在差异。561株副溶血性弧菌tlh、tdh和trh基因阳性率分别为100.0%（561/561）,97.1%（545/561）和1.1%（6/561）。3种毒力基因分成4种类型,tlh+tdh+trh-为优势基因型,占96.4%（541/561）。结论　2011-2014年北京市引起腹泻的副溶血性弧菌有多种血清型,多为产毒株,以携带tlh 和tdh基因的O3∶K6为优势血清型。通过对生化、血清分型和毒力基因检测结果进行综合分析,有助于提高副溶血性弧菌鉴定的正确性。     

霍乱毒素基因(ctx)和耐热直接溶血素基因(tdh)双重TaqMan实时PCR检测方法的建立

[目的]建立霍乱毒素和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时-PCR实验室检测方法。[方法]根据霍乱毒素基因(Cholera toxin gene,ctx)和耐热直接溶血素基因(thermostable direct hemolysin,tdh)的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立检测霍乱毒素和耐热直接溶血素两种毒力基因的双重TaqMan实时PCR方法。对所建立的霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价。[结果]建立了霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR的实验室检测方法。优化的tdh和ct双重TaqMan实时PCR反应体系中,ct引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L;tdh引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为94%和97.7%。[结论]本研究建立了基于TaqMan探针的tdh和ct双重实时PCR检测方法,具有令人满意的灵敏度和特异度。检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,高于普通PCR100倍。并且双重实时PCR能够在一个反应体系中同时检测两种毒力基因,这为费时又繁琐的传统检测方法提供了一种可靠又快速的替代选择。     

食源性相关腹泻患者粪副溶血性弧菌检测结果分析

目的了解多重荧光PCR检测食源性相关腹泻患者粪副溶血性弧菌与增菌培养分离法检测结果的关系以及毒力基因携带情况。方法比较多重荧光PCR与培养分离法对200例食源性相关腹泻患者粪副溶血性弧菌的检测,在培养鉴定中使用VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统(法国bio Mérieux公司)的GN配套鉴定卡及AST-GN09药敏卡,并进行血清学分型。结果增菌培养分离法的检出率为36.00%(72/200),所有菌株均能被多重荧光PCR鉴定出tlh基因,其中毒力基因携带tdh+/trh+占2.78%(2/72)、tdh+/trh-占88.89%(64/72)、tdh-/trh+占5.55%(4/72);tdh-/trh-占2.78%(2/72)。血清型O3∶K6最多,占58.33%(42/72)、其次O4∶K8占8.33%(6/72)。结论多重荧光PCR比较适合于食源性相关腹泻患者粪副溶血性弧菌的快速鉴定与毒力检测,也应重视培养分离法对鉴定与药敏的地位,努力优化选择性培养基及培养条件,加强主动监测。     

北京市副溶血弧菌病原学和分子流行病学特征分析

目的 了解北京市副溶血弧菌腹泻病例分离株的病原学和分子流行病学特征.方法 2010年4-12月从临床收集散发腹泻病例2118份粪便标本,进行副溶血弧菌的分离培养、生化鉴定.阳性菌株进行血清分型;采用药敏纸片法对12种抗生素进行敏感性检测;用实时荧光定量PCR方法检测毒力基因tlh、tdh和trh;用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型.结果 2118份粪便标本分离出副溶血弧菌114株,阳性分离率为5.38％.114株副溶血弧菌分属于23种血清型,其中O3:K6为优势血清型,占63.16％.临床分离株对氨苄西林和庆大霉素产生耐药;对阿莫西林、头孢曲松、氯霉素、亚胺培南、萘啶酸和四环素等均具有较高敏感性.全部菌株tlh基因阳性;tdh存在于大部分菌株中,所占比例为93.86％;只有1株菌trh阳性.O3:K6型菌株tdh基因阳性率(98.61％)明显高于非O3:K6型菌株(85.71％)(P=0.0098).114株副溶血弧菌分成54种PFGE型别,72株O3:K6型菌株分成34种PFGE型别,带型分散,无明显聚集性.结论 北京地区感染性腹泻病例副溶血弧菌分离株以O3:K6型为主.毒力基因tlh和tdh携带率高,且O3:K6型临床分离株毒力更强.副溶血弧菌对多数抗生素均具有较高敏感性.PFGE结果提示北京地区流行的副溶血弧菌存在多克隆来源.     

泰州市不同来源副溶血性弧菌分离株毒力基因型和耐药性的比较研究

目的　了解泰州市水产品及腹泻病人中副溶血性弧菌的检出情况,并对检出的所有阳性菌株进行毒力基因和耐药性的比较研究。方法　对采集的水产品和腹泻病人的粪便样本进行副溶血性弧菌的分离及鉴定,运用荧光PCR技术检测副溶血弧菌的tlh(不耐热溶血素)、tdh(耐热直接溶血素)、trh(相关耐热溶血素)这3种毒力基因,采用WHO推荐的纸片扩散法(K-B法)分别对所有阳性菌株进行药敏实验。结果　泰州市2014-2017年采集的水产品和腹泻病人样本中副溶血性弧菌的检出率分别为34.3%(37/108)、1.2%(18/1548),55株阳性菌株中tlh均为阳性,trh均为阴性,水产品分离株均未检出tdh,但腹泻病人分离株tdh的检出率为94.4%(17/18)。腹泻病人分离株对头孢唑啉、氨苄西林、四环素的耐药性高于水产品分离株,其中腹泻病人分离株和水产品分离株对氨苄西林的耐药率分别达到61.1%（11/18）、54.1%（20/37）。结论　本市水产品中副溶血性弧菌的污染情况较为严重,副溶血性弧菌是导致食源性腹泻的主要致病菌之一。腹泻病人分离株的tdh携带率较高而水产品分离株均未携带tdh;腹泻病人分离株对头孢唑啉、氨苄西林、四环素的耐药性高于水产品分离株,而且两种分离株对氨苄西林均有较高的耐药率。     

应用双重PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的应用双重聚合酶链反应（PCR）技术,建立金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的快速检测方法,指导临床及时、合理使用抗菌药物,防止MRSA的扩散。方法 根据金黄色葡萄球菌血浆凝固酶基因Coag和耐药基因mecA设计引物,调整PCR扩增反应各参数,建立快速、准确扩增Coag和mecA基因的双重PCR体系;应用双重PCR对临床分离鉴定的85株金黄色葡萄球菌同时扩增Coag和mecA基因片段,并将PCR扩增结果与苯唑西林-高盐琼脂筛选试验（OSAS）的结果进行比对。结果生化常规试验分离鉴定85株金黄色葡萄球菌,通过OSAS试验,共检出MRSA 53株,MRSA检出率为62.35%。双重PCR快速检测MRSA,85株金黄色葡萄球菌均扩增出Coag基因片段,其中53株扩增出mecA基因片段。双重PCR检测MRSA的结果与生化常规试验分离鉴定MRSA结果一致。结论双重PCR法能快速、同时检测金黄色葡萄球菌血浆凝固酶Coag基因和耐药基因mecA,有助于及早检出MRSA,指导临床合理用药,控制MRSA传播。     

2008年广东省食物中毒副溶血弧菌分子特征研究

目的了解2008年广东省副溶血弧菌食物中毒分离株的血清分型及分子特征。方法对2008年广东省14起副溶血弧菌食物中毒事件中90株分离自病例和9株分离自相关食物的菌株进行血清分型,耐热溶血素基因（tlh）、耐热直接溶血素相关基因（trh）和耐热直接溶血素基因（tdh）PCR检测以及选取优势菌型O3∶K6和O4∶K8血清型进行ER IC-PCR分子分型。结果 90株病例来源菌株以O3∶K6（62.2%）和O4∶K8（14.4%）血清型为主,9株食物来源菌株血清型别多样,无优势菌型,且同时分离到病例及食物来源菌株的4件事件中有3起食物来源菌株的血清型与同一事件中从病例分离到的血清型不同。PCR检测发现,99株副溶血弧菌tlh基因均为阳性,trh基因均为阴性,tdh基因88株阳性,其中食物来源菌株tdh基因阳性率为11.1%（1/9）,病例来源菌株tdh基因阳性率为96.7%（87/90）。选取22株O3∶K6血清型和10株O4∶K8血清型菌株（均分离自病例）进行ER IC-PCR分子分型分析,结果显示,2种血清型菌株可分为8个ER IC型别,且可区分为2类不同的聚类,这2类聚类之间的相似值为54.7%。同1起食物中毒事件中分离到的O3∶K6或O4∶K8血清型,其ER IC型别表现出多样性;而不同食物中毒事件中分离到的O3∶K6或O4∶K8血清型,部分菌株ER IC型别表现出100%的相似性。结论广东省副溶血弧菌食物中毒分离株血清型多样,同一血清型菌株存在遗传多样性,一群遗传关系密切的trh阴性、tdh阳性的O3∶K6和O4∶K8血清型为副溶血弧菌食物中毒优势菌型。     

132株副溶血性弧菌毒力基因及耐药性分析

目的了解2014年-2017年桐乡市副溶血性弧菌分离株毒力基因携带与耐药性情况,为临床更为有效用药提供数据上的支持。方法利用RT-PCR技术对其分离株进行毒力(tlh、tdh、trh)检测;采用纸片扩散法操作,测定其对22种抗生素的耐药性。结果在132株副溶血性弧菌中,毒力基因tlh、tdh和trh阳性携带率分别为100.00%(132/132)、57.58%(76/132)和0.00%(0/132);对氨苄西林、头孢唑啉、哌拉西林、复方新诺明的耐药率分别为31.5%、23.5%、12.5%、12.5%,对除碳青霉烯类和喹诺酮类外的6大类抗生素均有耐药性,而其中对β-内酰胺类抗生素和叶酸代谢途径抑制剂及氯霉素的耐药性相对较高。多重耐药方面,对2种以上抗生素耐药的有15株,占11.90%。结论126株副溶血性弧菌分离株主要携带毒力基因为tlh、tdh。除氨苄西林等9类抗生素外,其余13类在副溶血性弧菌感染的治疗中可作为首选。     

65株副溶血性弧菌分子分型及耐药特征分析

目的了解副溶血性弧菌分子分型及耐药特征,为防控副溶血性弧菌引起的肠道腹泻病及临床治疗用药提供基础数据。方法收集2017年不同时间、不同区域分离的65株副溶血性弧菌,进行毒力基因检测、药敏试验,PFGE分型。结果65株副溶血性弧菌,tdh携带率为100%,trh基因全部菌株阴性。65株副溶血性弧菌对氨苄西林敏感率为43.1%,对磺胺异恶唑敏感率为36.9%,对阿奇霉素和头孢西丁敏感率分别为95.4%和98.5%,对其他13种抗菌药敏感率达到100.0%。65株副溶血性弧菌的PFGE图谱分为51个PFGE型别,不同PFGE型别的相似系数介于7.08%~94.87%,同一带型2株菌以上的带型有10个。结论副溶血性弧菌分离株主要携带tdh基因,副溶血性弧菌对氨苄西林、磺胺异恶唑、阿奇霉素头孢西丁这4类抗生素有耐药性。副溶血性弧菌菌株的PFGE型别呈多态性,同时存在2株以上的聚集簇,对于患者相关PFGE图谱成簇的菌株应加强流行病学调查和溯源工作。