尿道粘膜上皮细胞的分离培养和鉴定

目的：为采用组织工程技术构建尿道粘膜组织提供实验依据。方法：取雄性新西兰幼兔尿道粘膜组织小块,酶消化成单细胞悬液,接种后静置培养、传代。动态观察细胞形态变化及生长增殖情况。细胞进行常规组化染色、免疫组化染色及流式细胞仪检查,并观察超微结构。结果：整个上皮细胞生长期内无成纤维细胞混杂生长,均为单一的上皮细胞,并证实为二倍体细胞。细胞可传11－13代,成活50－60d。结论：新西兰幼兔尿道粘膜上皮细胞可在体外培养,在一定时间内保持增殖能力。     

阴道粘膜上皮细胞的分离培养和鉴定

目的 初步建立阴道粘膜上皮细胞体外培养方法,为阴道粘膜上皮研究提供实验模型.方法 取雌性新西兰大白兔阴道粘膜组织小块,胶原酶Ⅳ和胰蛋白酶联合消化分离法收集上皮细胞,接种于角朊细胞无血清培养液中静置培养、传代.动态观察细胞生长增殖情况,扫描和透射电镜观察超微结构,流式细胞仪测定细胞增殖周期,并进行免疫组织化学鉴定.结果 体外培养的阴道粘膜上皮细胞为二倍体细胞,增殖状态良好,细胞间可见桥粒连接,免疫组化角蛋白染色阳性.细胞的超微结构和免疫组化染色均具有上皮细胞特征.结论 在本实验条件下,体外培养的阴道粘膜上皮细胞具有较好的增殖能力,可作为阴道粘膜上皮研究的理想实验模型.     

组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的获取与培养

目的:探索体外培养组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的条件,并观察其部分生物学活性。方法:采用机械-酶消化法对3周龄新西兰大白兔耳软骨和关节软骨消化来获得软骨细胞,采用全骨髓贴壁法来获得骨髓间充质干细胞,对两种细胞进行原代和传代培养,通过倒置相差显微镜观察细胞形态、绘制生长曲线、免疫组化染色等对细胞进行生物学特性分析。结果:原代培养的软骨细胞以多角形或三角形为主,传代3次以后出现去分化。形态学和免疫组化显示细胞3代以内可以保持表型稳定,具有较强的增殖及分泌细胞外基质的能力,而且耳软骨及关节软骨细胞在实验中没有表现出明显的生物学差别。采用贴壁筛选法获得的BMSCs呈长梭形或多边形,生长曲线呈"S"形,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,细胞生长增殖能力旺盛。结论:体外分离培养的软骨细胞和骨髓间充质干细胞符合组织工程要求,能够作为骨-软骨复合组织的种子细胞。     

成人及家兔阴茎海绵体平滑肌细胞培养和鉴定

目的 :探索阴茎海绵体平滑肌细胞 (CCSM)体外培养及鉴定方法。　方法 :采用勃起功能正常的成年男子及新西兰家兔的新鲜阴茎标本 ,经处理后采用原代细胞培养法 ,对阴茎海绵体组织块进行培养 ,获得CCSM后用光镜、透射电镜和免疫组化等多种方法从细胞形态学及CCSM生长特性等不同侧面对培养的人及新西兰家兔的CCSM进行鉴定 ,并测定CCSM在体外培养时的细胞增殖情况。　结果 :经 2 4h潜伏期 ,体外培养的CCSM进入指数增长期 ,维持约 96h后进入平台期 ;从接种组织块至长成单层细胞约需 15～ 2 0d ,传代后约 4～ 7d后长成单层 ;传代后的细胞增殖旺盛 ,成束状生长 ,并呈现层叠排列及“峰 谷”现象 ;CCSM在体外可稳定传 7～ 12代 ,传代期间其形态及增殖活性变化不明显 ;各种检测鉴定均证实所获细胞为CCSM。　结论 :CCSM原代细胞培养法简便、稳定、可靠 ,对研究阴茎的勃起机制及勃起功能障碍的发生、发展、调控及其治疗药物筛选有重要理论及现实意义。     

表皮细胞作为种子细胞构建尿道的长期随访比较研究

目的将通过分离培养的表皮细胞与脱细胞膀胱黏膜下筋膜复合，修复缺损的尿道，观察表皮细胞表型在尿道环境中的转归。方法采用同种异体（家兔）的膀胱，经显微分离和脱细胞液处理，制成无细胞的生物支架（并经随机切片证实脱细胞效果），选择兔的小块包皮组织，消化收集分离出的表皮细胞，经过增殖、传代培养植入生物支架中，并加入Brdu标记物，将其卷成管状，回植入自体人工造成的尿道缺损，术后1、2、6及12个月分别测定治疗效果（每组各处死3只家兔／批），观察指标：尿道造影、大体外形、修复段尿道黏膜的HE染色、免疫组化和荧光标记等。结果术后实验对象伤口愈合正常，修复尿道的大体形态和尿道造影显示排尿通畅，无尿瘘和狭窄发生；HE染色和免疫组化显示，术后1月-6月，修复段尿道黏膜层次由单一向复层结构转变；而术后12月修复段尿道黏膜已基本显示为类似移行上皮细胞结构；术后角蛋白染色阳性；Brdu标记在术后1月清晰显示植入上皮细胞层存在，随后逐渐稀少。术后6及12月尿道黏膜结构中未见显影。结论作为种子细胞，表皮细胞可与胶原筋膜结合运用于尿道修复，修复效果良好，并随着时间延长向尿道原有细胞结构转变。     

毛乳头细胞培养基血清浓度的探索

目的 研究不同血清浓度的培养基对毛乳头细胞生长速度及细胞状态的影响.方法 改良一步酶消化法分离培养人头皮毛乳头细胞,分别以无血清培养基及10%、15%等不同浓度小牛血清培养基,培养第3代毛乳头细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,细胞消化后,计数并绘制生长曲线.结果 在无血清培养基培养条件下,毛乳头细胞传代后贴壁率较低.贴壁后细胞未见明显增殖;传代后前8 d,15%和20%血清培养基培养的毛乳头细胞生长速度,明显快于无血清培养基组和10%血清培养基组(P<0.05);传代第10天后,15%和20%血清培养基中毛乳头细胞生长速度差异无显著的统计学意义.结论 细胞生长速度与血清浓度密切相关.     

人膀胱癌组织中成纤维细胞的培养和鉴定

目的:探索人膀胱癌组织中成纤维细胞的培养和鉴定方法,为其功能的研究奠定基础。方法:分别应用组织块法、消化法进行人膀胱癌组织中成纤维细胞的原代培养,细胞铺满培养瓶底后首次传代,通过胰酶消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化;通过倒置显微镜观察细胞形态、透射电镜观察细胞内部结构和免疫组化方法检测细胞膜波形蛋白(vimentin)、角蛋白(keratin)表达情况对细胞进行鉴定。结果:组织块法原代培养约1周可见纤维样细胞从组织块周围游出,消化法4天后可见细胞贴壁,均于5周左右细胞基本长满培养瓶底。首次传代时应用胰酶消化法进行成纤维细胞的初次纯化,第二次转种时先后应用酶消化法和反复贴壁法再次进行细胞纯化,第3、4代基本可获纯的含单个核的长梭形纤维样细胞。取第5、6代状态良好的细胞常规准备后进行透射电镜检查和免疫组化染色:电镜提示细胞内可见明显的粗面内质网、高尔基体和(或)微丝结构,线粒体数量少,分布不均;免疫组化结果为vimentin染色阳性,keratin染色阴性。结论:只要给细胞创造良好的生长条件并正规操作,组织块法和消化法均可成功地进行人膀胱癌组织中成纤维细胞的原代培养;因与恶性肿瘤细胞相比,成纤维细胞的优势生长并不明显,故细胞的纯化工作极为重要。     

组织工程舌黏膜构建的研究

目的 探讨舌黏膜细胞的体外培养方法,及其作为种子细胞与同种异体膀胱脱细胞移植物(BAMG)复合构建组织工程化黏膜的方法.方法 分离并获取雄性新西兰大耳白兔舌黏膜细胞进行培养,定期观察细胞形态变化及生长增殖情况.对体外培养的舌黏膜细胞进行广谱角蛋白抗体(AE1/AE3)免疫荧光染色鉴定;流式细胞仪检测第2代培养细胞的AE1/AE3阳性细胞百分比;细胞计数及噻唑蓝(MTT)比色法测定以判断细胞增殖能力.取同种异体兔膀胱经脱细胞处理制成BAMG,随机取小块组织行HE和Masson染色观察脱细胞效果,然后将第2代体外培养的舌黏膜细胞种植于BAMG上,通过HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG的复合情况.结果 舌黏膜细胞形态均一有较强的增殖能力可传代至4～5代,传至第4代时开始出现老化,细胞贴壁及增殖能力均明显减弱.免疫荧光染色显示近100%体外培养的舌黏膜细胞AE1/AE3免疫荧光染色阳性.流式细胞仪检测结果表明第2代舌黏膜细胞AE1/AE3阳性细胞百分比大于96%.舌黏膜细胞传至第3代时可获得细胞数量在2×107以上.HE和扫描电镜观察均显示舌黏膜细胞和BAMG复合良好.结论 兔舌黏膜细胞可在体外成功培养、扩增;兔舌黏膜细胞与同种异体BAMG复合后生长良好.     

尿道移行上皮细胞与生物可降解尿道支架体外复合培养的研究

目的:研究体外培养的兔尿道上皮细胞在生物可降解性网状尿道支架上的贴附和生长增殖情况,观察其对尿道上皮细胞形态和功能的影响,利用组织工程技术培养种植细胞的尿道内支架.方法:应用机械分离与酶消化法分离培养兔尿道移行上皮细胞,并在体外行原代培养与扩增后制成细胞悬液,接种在网状尿道支架上,形成尿道移行上皮细胞-支架复合物.应用免疫组织化学、荧光染色法鉴定尿道上皮细胞及其活性,并用倒置显微镜、扫描电镜观察尿道上皮细胞在支架表面吸附与生长状态.结果:网状尿道支架具有良好的生物相容性,能使尿道移行上皮细胞增殖,不影响其活性.尿道移行上皮细胞在尿道支架上贴附生长良好,1～2天后完全贴壁,3～7天细胞生长增殖活跃,支架网眼内充满上皮细胞;长期培养仍保持尿道移行上皮细胞特性,扫描电镜可见上皮细胞与网状支架紧密贴附,适度伸展并有基质分泌.结论:网状尿道支架适合尿道移行上皮细胞黏附生长,可作为尿道组织工程的细胞载体,利用组织工程方法可获得适于移植尿道细胞的组织工程化尿道.     

犬膀胱移行上皮细胞的体外连续培养及生物学特征观察

目的探讨犬膀胱移行上皮细胞体外连续培养和纯化方法,为进一步构建组织工程尿路上皮组织提供实验依据。方法无菌获取幼犬膀胱组织,0.125%胰蛋白酶消化获取单细胞悬液,于上皮细胞无血清培养基中培养。采用0.05%胰蛋白酶和0.02?TA消化、纯化细胞,动态观察细胞形态变化和增殖情况,MTT法绘制生长曲线;透射电镜观察细胞超微结构;SABC法对培养的细胞进行免疫组织化学鉴定;并采用流式细胞仪检测不同代次细胞的细胞周期和倍体水平。结果采用酶消化法能从4～6cm2的膀胱黏膜组织中分离获取(1～5)×106个细胞。原代培养接种24h后可见大量细胞贴壁,第7天细胞生长融合达80%～90%,细胞排列呈典型的铺路石样。MTT法测定第3代细胞在传代培养7d生长达高峰;传代并纯化的细胞纯度高,无成纤维细胞污染,至第4～6代细胞仍保持良好形态。透射电镜下,可见上皮细胞特征性张力微丝和细胞间桥粒连接。细胞角蛋白AE1/AE3免疫组织化学染色,胞浆呈棕黄色阳性反应。不同代次细胞均为二倍体细胞。结论酶消化法能从较少的膀胱组织中分离获取足量、较纯的膀胱移行上皮细胞,细胞在无血清培养基中能连续传代扩增,可以满足进一步构建组织工程尿路上皮组织的需要。     

表皮细胞体外增殖与增殖表型细胞含量变化规律的实验研究

目的研究人表皮细胞(humanepidermalcells,hECs)体外扩增与增殖表型细胞含量变化规律。方法收集2～3岁健康幼儿包皮共20例,对标本拍照,软件分析照片中标本面积,分离、收集表皮细胞,计算原代(P0)细胞获得率(5例)。记录不同代次细胞生长曲线,细胞直径,克隆形成率(5例)。对不同代次细胞的角蛋白19(keratin,K19)和外皮蛋白(involucrin)的mRNA表达情况及阳性细胞率分别进行RTPCR检测(5例)和流式细胞仪(FACS)分析(5例)。结果原代细胞平均获得率为(164±0297)×106cm2。hECs最大可扩增(700±37)倍,第5代(P5)的扩增倍数为(243±13)倍。P0克隆形成率为(45±4)%,随传代依次降低,至第5代(P5)时为(9±2)%,至第6代(P6)时消失。RTPCR检测发现K19mRNA在P5及P5之前表达,P6未见表达;Involucrin各代均表达。FACS检测各代hECs中K19阳性细胞百分率逐渐降低,P0时为(6697±314)%,P6为(465±138)%;外皮蛋白表达阳性细胞百分率逐渐增高,P0时为(1165±162)%,P6为(9703±266)%。结论体外扩增至第5代的幼儿包皮来源的表皮细胞,维持着增殖细胞表型,符合组织工程表皮种子细胞的要求。表皮细胞体外扩增能力逐渐降低与增殖表型细胞含量减少有关。     

Urethral replacement using epidermal cell-seeded tubular acellular bladder collagen matrix

OBJECTIVES: To investigate the feasibility of replacing urinary epithelium cells with foreskin epidermal cells to reconstruct engineered anterior urethra with an acellular collagen matrix. MATERIALS AND METHODS: Acellular collagen matrices were generated from allogeneic rabbit bladder submucosa. In nine rabbits, autologous foreskin epidermal cells were isolated, expanded in vitro, and labelled with 5-bromo2'-deoxy-uridine (BrdU) before seeding onto a tubular acellular collagen matrix (1.5x1 cm). In male rabbits, a urethral mucosal defect was created, and urethroplasty performed with a tubular acellular collagen matrix seeded with epidermal cells (nine rabbits) or with a matrix with no cell seeding (nine rabbits; control group). Urethrography was done at 1, 2 and 6 months after grafting. The urethral grafts were harvested and analysed grossly and histologically. RESULTS: In the control group, gross views and urethrography revealed stricture of repaired defects at the different sample times. In the experimental group, a wide urethral calibre was maintained with no sign of strictures. Histology in the control group showed a single layer of epithelium cells with disorganized muscle fibre bundles in the submucosa layer at 1 month after grafting, and a transitional cell layer surrounded by disorganized muscle fibre bundles at 2 and at 6 months. Grafts seeded with epidermal cells formed a single-layer structure by 1 month, and at 2 and 6 months there were several layers of epidermal cells with abundant vessels in the submucosa. There was an evident margin between graft epidermal cells and host epithelium at 6 months. The implanted cells expressed keratin, shown by staining with anti-pancytokeratins. Immunofluorescence for BrdU confirmed the presence of implanted epidermal cells at 1 month after grafting; there were fewer positive cells at the implantation site at 2 months. At 6 months, there were several layers of epidermal cells with no signs of BrdU staining. CONCLUSIONS: Urethral reconstruction was better with an acellular collagen matrix seeded with epidermal cells than with the acellular collagen matrix alone. Foreskin epidermal cells seem adequate in replacing urethral epithelium cells for urethral reconstruction.     

以L929细胞为滋养层的尿道黏膜上皮细胞体外培养

目的 探索尿道黏膜上皮细胞体外培养的技术和方法，为进一步采用组织工程技术构建尿道黏膜组织奠定基础，并为尿道黏膜的生理、药理、毒理学及微生态研究提供实验模型。方法 取刚离乳的雄性新西兰幼兔尿道黏膜组织，分别以DispaseⅠ消化液和混合消化液消化成单细胞悬液，以差速贴壁法排除成纤维细胞，接种后以L929细胞为滋养层细胞进行培养，定期换液，细胞生长、增殖至80％～90％融合时传代。细胞进行常规HE染色、流式细胞仪检测，以扫描电镜、透射电镜观察其超微结构。再分别设立实验组(n=20)、阳性对照组(正常尿道黏膜组织石蜡切片，n=20)及阴性对照组(成纤维细胞铺片，n=20)行免疫组织化学染色。结果 原代培养10天左右细胞逐渐生长融合成片，如铺路石状，细胞大小均一。上皮细胞为二倍体细胞，生长期内均为单一的上皮细胞，无成纤维细胞混杂生长，细胞可传11～13代，成活50～60天。结论 新西兰幼兔尿道黏膜上皮细胞可在体外进行培养，在一定时间内保持增殖活力，为构建组织工程化尿道奠定了基础，且为尿道黏膜的体外研究提供了实验模型。     

Experimental generation of a tissue-engineered functional and vascularized trachea

OBJECTIVE: We sought to grow in vitro functional smooth muscle cells, chondrocytes, and respiratory epithelium on a biologic, directly vascularized matrix as a scaffold for tracheal tissue engineering. METHODS: Ten- to 15-cm-long free jejunal segments with their own vascular pedicle were harvested and acellularized from donor pigs (n = 10) and used as a vascular matrix. Autologous costal chondrocytes, smooth muscle cells, and respiratory epithelium and endothelial progenitor cells were first cultured in vitro and then disseminated on the previously acellularized vascular matrix. Histologic, immunohistologic, molecular imaging, and Western blotting studies were then performed to assess cell viability. RESULTS: The endothelial progenitor cells re-endothelialized the matrix to such an extent that endothelial cell viability was uniformly documented through 2-(18F)-fluoro-2'-deoxyglucose positron emission tomography. This vascularized scaffold was seeded with functional (according to Western blot analysis) smooth muscle cells and successfully reseeded with viable ciliated respiratory epithelium. Chondrocyte growth and production of extracellular cartilaginous matrix was observed as soon as 2 weeks after their culture. CONCLUSIONS: The fundamental elements for a bioartificial trachea were successfully engineered in vitro in a direct vascularized 10- to 15-cm-long bioartificial matrix. Future experimental work will be directed to give them a 3-dimensional aspect and a biomechanical profile of a functioning trachea.     

转化生长因子β1对体外培养尿道细胞的生物学作用研究

目的 观察转化生长因子β1(TGF-β1)对尿道黏膜上皮细胞及成纤维细胞的生长调节作用及在诱导靶细胞结缔组织生长因子(CTGF)的表达中的作用.方法 体外培养尿道黏膜上皮细胞及成纤维细胞并鉴定.取第4代细胞分别设立对照组(以不含TGF-β1的细胞培养液培养)和实验组(分别以TGF-β11、2、4、8 μg/L的细胞培养液培养),24 h后分别以MTT比色试验和细胞计数法检测细胞活力,RT-PCR检测细胞内CTGF mRNA的表达.结果 与对照组相比较,实验组尿道黏膜上皮细胞数量和吸光度值随TGF-β1浓度升高而降低(P＜0.05),成纤维细胞数量和吸光度值随TGF-βl浓度升高而升高(P＜0.05);CTGF mRNA在实验组上皮细胞和成纤维细胞中均有表达,且表达水平随TGF-βl浓度升高而增加(P＜0.05).结论 TGF-β1可抑制尿道黏膜上皮细胞生长,促进成纤维细胞生长,并能诱导尿道黏膜上皮细胞及成纤维细胞表达CTGF mRNA.     

The paracellular permeability of opossum kidney cells, a proximal tubule cell line

The paracellular permeability of opossum kidney cells, a proximal tubule cell line. BACKGROUND: The regulation of the unusually leaky paracellular pathway of the proximal tubule is poorly understood partially because of the lack of an appropriate in vitro cell model. In this study, we determined whether the paracellular permeability of opossum kidney (OK) cells would resemble that of the in vivo proximal tubule epithelium. METHODS: The parental and subclonal OK cells and, for comparison, LLC-PK1 cells were cultured on permeable Transwell supports. The apparent paracellular permeability coefficient (Papp) for the extracellular marker 3H-mannitol was determined. RESULTS: The Papp of OK cell sheets (12.17 x10-6 cm/sec) was remarkably close to the previously reported Papp of rat proximal tubules. The Papp of LLC-PK1 cells, another proximal tubule cell line, however, was approximately 20-fold lower than that of both OK cells and the in vivo proximal tubule. Phorbol 12-myristate 13-acetate, a protein kinase C activator, enhanced the Papp of OK cell sheets. The characteristic response of paracellular permeability to Ca2+ switch was demonstrated in OK cell sheets. Slight variations of Papp among several OK subclones were observed. Basal to apical Papp was uniformly higher than apical to basal Papp, independent of cell subtype. This rectification was attenuated by inhibition of active transport. CONCLUSIONS: OK cell sheets cultured on Transwell supports possess a leaky paracellular pathway resembling that of the proximal tubule epithelium in vivo.     

组织工程皮肤种子细胞的同期快速分离

目的 寻找一种快速可行的同期分离组织工程皮肤种子细胞——表皮细胞及成纤维细胞的方法。方法 取手术切除包皮，利用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶消化法，同期分离表皮细胞及成纤维细胞，观察细胞形态。对表皮细胞及表皮干细胞行PAN—FITC、K19-FITC荧光免疫染色及K19流式细胞仪鉴定；对成纤维细胞行波形蛋白FITC免疫荧光鉴定。并分别对两种细胞培养7d，观察其生长情况。结果 应用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶，在3h内快速分离得到表皮细胞及成纤维细胞，免疫荧光染色表皮细胞PAN—FITC染色均为阳性、K19-FITC染色部分阳性，流式细胞仪鉴定其K19阳性表达的细胞接近17％。表皮细胞培养48h开始呈克隆样增长，至7d生长停滞，向终末的角细胞分化。成纤维细胞体外培养7d可扩增100倍，波形蛋白FITC免疫荧光染色呈阳性。结论 利用胶原酶结合胰蛋白酶消化法可在3h内同期分离到用于构建复合型组织工程皮肤的种子细胞，为复合组织工程皮肤的快速构建提供了可能。     

表皮细胞、成纤维细胞和几丁质-胶原蛋白复合人工皮的体外构建

目的 探讨几丁质—胶原蛋白膜作为表皮细胞、成纤维细胞培养支架的可能性，体外构建包含双层细胞的复合皮。方法 取健康成人环切包皮，分离成纤维细胞、表皮细胞，分别制成单细胞悬液，将几丁质-胶原蛋白膜(有孔面向上)平铺于60mm培养皿中，首先接种成纤维细胞，培养2d后，将含10％小牛血清的DMEM更换成完全型DMEM，翻转膜，使光滑面朝上，再种植表皮细胞，每日换液。定期观察细胞与材料的粘附、细胞贴壁及其生长增殖情况。结果 几丁质—胶原蛋白膜对成纤维细胞、表皮细胞无明显毒性作用，成纤维细胞培养1d后，细胞贴附于材料支架，细胞胞体较大，呈典型的梭形。加入表皮细胞复合培养2d示表皮细胞贴壁生长，并分化、增殖。复合皮构建2周，网格支架及孔内均有大量细胞生长，膜表面细胞融合成片，表皮细胞分化形成复层。结论 几丁质—胶原蛋白膜对细胞无毒性，有利于培养细胞的粘附、生长。在体外可以构建成功类似生理性皮肤的人工皮肤。     

在胶原海绵膜上构建人表皮细胞和成纤维细胞复合移植物的实验研究

目的将原代培养的人表皮细胞和成纤维细胞，接种到一种新的载体-胶原海绵膜上，构建新的复合皮肤替代物。方法来源于人包皮的表皮细胞和成纤维细胞分别原代培养，成纤维细胞经消化后接种在胶原海绵膜上(1×10