胆汁泡蛋白成核活性及其氨基酸序列分析的研究

分离胆汁泡蛋白,研究其成核活性和末端氨基酸序列。方法:应用超速离心法分离胆石症患者胆汁泡,运用SDS-PAGE电泳分离其中胆汁泡蛋白,并经HPLC系统纯化,研究其成核活性和N-端氨基酸序列。结果:分离到一种分子量为33.5kd的胆汁泡蛋白,其促成核活性为0.30,N-端氨基酸具有较多的极性氨基酸(天冬酰、苏、丝和谷氨酰等)。结论:33.5kd胆汁泡蛋白有明显的促成核活性,其N-端极性氨基酸可能参与促成核机制。     

胆汁成核效应蛋白的分离纯化与成核活性比较

目的 纯化并比较各种成核效应蛋白的活性,筛选最具病理学意义的促成核因子。方法 通过ConA-Sepharose 4B亲和层析和Sephadex G-200、Sephadex G-100分子筛凝胶过滤以及超速离心法从胆固醇性结石病人胆汁中分离提纯70 kDa、200 kDa促成核蛋白以及33.5 kDa泡蛋白,在模拟胆汁体系中观察成核因子促进胆固醇结晶生长、析出过程,比较其成核活性。结果 四种候选的成核效应蛋白中,33.5 kDa泡蛋白是活性最强的促成核因子,成核活性强弱依次为33.5 kDa泡蛋白>200 kDa糖蛋白≈α1-酸性糖蛋白>70 kDa糖蛋白,当浓度为100／μg／ml时,33.5 kDa泡蛋白成核活性指数Ig、Ic、It分别为1.52、1.63、0.57,并随着蛋白浓度的增加,促成核活性亦随之增强(F=678.18,P<0.05),且呈剂量依赖效应。结论 胆汁中存在多种促成核作用的糖蛋白,其中33.5 kDa泡蛋白可能与胆石形成关系最为密切。     

胆汁成核活性蛋白中糖链的致石作用

目的 探讨糖链在胆石形成中的作用。方法 分别将5mg辣根过氧化酶（HRP）标记蔓陀罗凝集素（DSA）、麦胚凝集素（WGA）和伴刀豆凝集素（ConA），鉴定糖链结构与类型，并在透射电镜下观察亲和染色的模拟胆汁泡形态学变化；通过结晶生长试验检测胆汁泡蛋白（0.1g／L）促成核活性及其糖链水解、多肽降解产物的活性改变。结果 胆汁泡蛋白糖链为DSA强结合、ConA(一），属多天线复杂型聚糖。HRP－DSA标记的泡蛋白糖链，直接反映泡蛋白促进胆汁泡聚集、融合及胆固醇单水结晶析出的动态过程。胆汁泡蛋白具明显促成核活性，其It、Ig、Ic分别为0.57、1.52及1.63（P＜0.05）。糖苷酶切、肽链酶解后其成核活性均几乎丧失。结论 糖链可能参与成核效应蛋白的致石作用过程。     

卵磷脂分子种类与胆石形成关系的研究

作者运用高效液相色谱法分离和检测了胆囊胆汁内卵磷脂分子种类的构成和含量,以及在胆汁内的胆固醇运载形式—胆固醇磷脂泡和微胶粒中的分布,同时比较了胆固醇结石患者和正常人胆囊胆汁内各分子成份构成上的差异。结果在胆囊胆汁中分离并检测出21种卵磷脂分子。胆汁内的卵磷脂分子种类的检测发现,人胆汁内卵磷脂分子的构成基本类似,在胆汁泡和微胶粒的分布上发现饱和和低不饱和脂肪酰卵磷脂主要分布在泡相,而多不饱和脂肪酰卵磷脂主要分布在微胶粒相。胆石患者的微胶     

成核效应蛋白在泡凝聚融合过程中作用的初步研究

为了探讨成核效应蛋白在泡凝聚、融合过程中的作用，作者研究了胆汁中主要的促成核蛋白系统—ＣｏｎＡ结合蛋白对模拟胆汁泡的形态与脂类组成的影响，发现ＣｏｎＡ结合蛋白在加快泡凝聚与融合的同时，也使泡胆固醇增加，磷脂减少，泡胆固醇／磷脂比增高，认为成核效应蛋白促泡凝聚与融合的本质是改变了泡胆固醇饱和度。作者的初步研究还发现泡相蛋白虽量微却具有强的促成核活性；几种已知的成核效应蛋白在泡相与微胶粒相的分布有差异；胆固醇结石患者与色素结石患者相比，泡蛋白的量与促成核活性均增高。通过泡蛋白亲和染色技术，还发现ＣｏｎＡ结合蛋白能与模拟胆汁泡形成脂质－蛋白复合体。作者认为，泡中成核效应蛋白的存在或量与质的改变，在泡凝聚与融合过程中起重要作用。     

胆固醇结石病胆汁游离脂肪酸的水平及其临床意义

作者运用气相色谱法和高效液相色谱法分离和检测了胆固醇结石患者和正常人胆囊胆汁内的游离脂肪酸和卵磷脂的分子种类的含量和构成，同时运用体外模拟胆汁添加游离脂肪酸对胆固醇结晶生长的实验，观察四种游离脂肪酸对胆固醇结晶生长的作用。结果发现在胆固醇结石患者（２５例）胆囊胆汁内总的游离脂肪酸的量和其中的软脂酸、硬脂酸、亚油酸和花生四烯酸的含量显著高于正常人（１５例）。胆固醇结石患者与正常人胆汁内的卵磷脂分子的构成基本类似。在体外模拟胆汁的添加实验中，软脂酸、油酸、亚油酸和花生四烯酸具有显著的促成核作用，为胆汁内的非蛋白促成核因子。我们认为，胆汁中游离脂肪酸的含量和分子构成的变化在胆石形成机制中有重要的作用。     

胆宁片对胆汁33.5kDa泡蛋白的影响

目的;探讨中药胆宁片预防胆固醇结石形成的作用机制。方法：建立胆汁成核因子（33．5kDa泡蛋白）ELISA快速检测法,监测正常人群组,胆固醇及胆色素结石组患者血清及胆汁中33．5kDa泡蛋白浓度,将另一组胆醇结石患者（n=45)按随机序贯原则分为胆宁片治疗组,胆酸钠治疗组及对照组,观察药物对33．5kDa泡蛋白浓度的影响。结果：胆固醇结石患者血液及胆汁中33．5kDa泡蛋白含量显著高于正常人群和胆色素结石组,胆宁片治疗2w后,血清及胆汁中33．5kDa泡蛋白明显降低（P＜0．05）,结论：胆宁片能降低血清和胆汁中的成核因子（33．5kDa泡蛋白）的含量,改变了胆汁中胆固醇的成石趋势。     

胆固醇结石患者胆囊胆汁中凝血和纤溶状态的初步研究

目的：通过研究胆固醇结石患者胆囊胆汁中凝血纤溶状态与交联纤维蛋白生成和降解的关系来探讨胆囊结石的形成机制。方法：收集胆固醇结石（简称胆石）患者胆囊胆汁20份和非胆囊结石患者胆囊胆汁15份,测定胆汁中的纤维蛋白特异性降解产物D－二聚体抗原和部分凝血纤溶因子抗原和活性水平。结果：胆囊结石组建者胆汁中D－二聚本抗原高于非胆囊结石组（P＜0．01）,抗凝血酶Ⅲ抗原高于非胆囊结石组（P＜0．05）,抗凝血酶Ⅲ活性低于非胆石组（P＜0．05）,胆石组抗凝血酶Ⅲ抗原与活性之比与非胆石组相比明显增高（P＜0．01）,胆石组纤溶酶活性较非胆石组增高（P＜0．05）,纤溶酶活性与凝血活性指标之比明显低于非胆石组（P＜0．05）,两组间纤溶酶原激活性抑制活性差异无显著性。结论：胆固醇患者胆囊胆汁中的凝血和行 性均高于非胆石组,但纤溶活性增高的程度与凝血活性比则明显减低,从而使交联纤维蛋白折生成增多,而降解相对减少,导致成石组胆囊胆汁中交联纤维蛋白积累,促进胆囊结石的形成。     

胆汁中氨肽酶N的分离、提纯及其促成核作用的初步研究

目的　观察氨肽酶N(APN )在胆石形成中的成核活性。方法　应用伴刀豆凝集素A亲和层析、羟基磷灰石柱层析及高压液相法从胆石症患者胆汁中分离、提纯胆汁中的APN ,并用模拟胆汁观察APN的成核活性。结果　最终APN纯化倍数达 2 94倍 ,酶的活性为12 .9nM·min-1·μg-1,分子量为 130kDa。随后在模拟胆汁观察到APN有明显的促成核活性。结论　APN在胆固醇结石形成中具有促成核作用。     

胆固醇结石病人胆汁免疫球蛋白含量增高及其对胆固醇-磷脂泡的影响

目的 :研究胆固醇结石病人胆囊胆汁、胆总管胆汁、血清3种免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)含量及其对胆固醇-磷脂泡变化的影响。方法:通过Con A亲和层析与Sephadex G-200分子筛凝胶两次过滤,从胆囊胆固醇结石病人及胆囊胆色素结石病人、无结石对照病人、非结石急性胆囊炎病人以及白胆汁病人胆囊胆汁、胆总管胆汁和血清中分离提纯Ig A、Ig G和Ig M;应用单向免疫扩散法检测3种Ig含量;应用电子显微镜观察Ig在模拟胆汁体系对胆固醇-磷脂泡的影响。结果:胆固醇结石组胆囊胆汁含有较高浓度的Ig G和Ig M,胆总管胆汁的3种Ig含量增高。胆色素结石组胆总管胆汁Ig A、Ig M含量与对照组无差异。胆固醇结石组和胆色素结石组除血清Ig A含量低于对照组外,其余Ig含量与对照组无差异。胆固醇结石组胆囊胆汁Ig G和Ig M分别作用于模拟胆汁7 d,明显促使单层泡直径增大,且增加多层泡数量;而Ig A仅轻微增加单层泡直径,不影响多层泡数量。结论:本实验结果显示,胆固醇结石组胆汁中Ig增高,可能通过影响胆固醇-磷脂泡变化,促进胆固醇结石形成。