人UNC5CL原核蛋白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建UNC5CL基因的原核表达载体,纯化GST-UNC5CL融合蛋白,并以其为抗原免疫家兔,制备抗人UNC5CL多克隆抗体,并鉴定其反应性和特异性。方法:用PCR方法扩增UNC5CL基因(表达其280-518位氨基酸)片段并克隆至pGEX-4T-2原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21诱导融合蛋白GST-UNC5CL(aa 280-518)表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化,免疫家兔制备抗血清,再采用ELISA、Western blot和免疫组化的方法检测抗体的效价及特异性。结果:测序证实原核重组质粒构建成功;经IPTG诱导,可表达Mr为52 000的GST-UNC5CL(aa280-518)的融合蛋白;谷胱甘肽亲和层析柱纯化的融合蛋白免疫家兔制备的抗血清经Western blot和免疫组化检测证实可识别目的蛋白。结论:制备了兔抗人UNC5CL的多克隆抗体,且抗体对内源性UNC5CL具有较好的反应性和特异性,为进一步研究UNC5CL的功能奠定了基础。     

FHL1抗体的制备与特异性鉴定

目的:制备FHL1及其剪接体FHL1B、FHL1C的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:融合表达GST-FHL1蛋白,常规免疫小鼠,制备多克隆抗体。分别构建带有FLAG标签的FHL1-5、FHL1B、FHL1C以及FHL1N端和C端缺失突变体的真核表达载体。Westernblot检测抗体的特异性。结果:获得了FHL1-5、FHL1B、FHL1C及FHL1(1-169aa)和FHL1(168-280aa)的真核表达载体;得到的多克隆抗体可特异识别FHL1、FHL1B和FHL1C,而不识别FHL2-5;抗体与FHL1N端反应,而不与其C端反应。结论:成功得到可特异识别FHL1、FHL1B和FHL1C的多克隆抗体,为进一步研究FHL1及其剪接突变体的功能奠定了坚实的基础。     

人UL16结合蛋白3的原核表达及其多克隆抗体制备

目的:表达和纯化人UL16结合蛋白3(ULBP3)胞外段融合蛋白,制备兔抗人ULBP3多克隆抗体。方法:利用PCR技术获得人ULBP3分子胞外段的基因编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建出重组表达质粒pQE30-ULBP3(aa30-171)。测序鉴定正确后转化入大肠杆菌感受态细胞M15,经IPTG 30℃诱导4 h后,SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在。用镍柱对融合蛋白进行纯化,将纯化的蛋白免疫新西兰白兔,采用流式细胞术(FCM)、Western blot法和免疫组化染色对所得多克隆抗体的生物学特性进行鉴定。结果:成功表达及纯化了人ULBP3(aa30-171)重组蛋白。结果显示该多克隆抗体能够识别大肠癌细胞株COLO205表面表达的天然构象ULBP3分子,而且能与结直肠癌组织细胞的ULBP3分子结合。结论:成功构建了原核表达载体pQE30-ULBP3(aa30-171),并获得高纯度的人pQE30-ULBP3(aa30-171)重组蛋白;成功制备了兔抗人ULBP3分子的多克隆抗体。     

人ULBP1重组蛋白的克隆表达和多克隆抗体制备

目的:表达人UL16结合蛋白l(ULBP1)胞外段重组蛋白,并制备兔抗人ULBP1多克隆抗体.方法:利用RT-PCR技术获得人ULBP1分子胞外段的基因编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-ULBP1.测序鉴定正确后转化入大肠杆菌感受态细胞M15,经IPTG 30℃诱导4h后,对表达产物进行鉴定.用镍柱对人ULBP1重组蛋白进行纯化,并将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔,采用流式细胞术(FCM)、Western blot法对制备的多克隆抗体进行生物学鉴定.结果:成功构建了原核表达载体pQE30-ULBP1(aa81～244),并获得了高纯度的人pQE30-ULBP1 (aa81～244)重组蛋白.制备的多克隆抗体能够识别肺癌细胞株A549表面表达的天然构象ULBP1分子.结论:成功表达了人ULBP1(aa81～244)重组蛋白并成功制备了兔抗人ULBP1的多克隆抗体.     

降钙素原基因克隆表达及多克隆抗体的制备

目的 克隆、表达降钙素原(PCT),制备相应的多克隆抗体.方法 根据GenBank上PCT的基因序列,设计10条用于基因拼接的DNA引物,利用PCR技术扩增PCT基因并构建pGEX-KG-PCT重组质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白PCT-GST,然后用融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot法进行生物活性鉴定,并利用琼脂免疫扩散实验检测了多克隆抗体的特异性和效价.结果 成功获得PCT全长基因,重组质粒pGEX-KG-PCT在大肠杆菌中成功表达,SDS-PAGE电泳显示蛋白相对分子质量(Mr)大小为36 000左右.利用纯化的蛋白同时制备了GST和PCT-GST多克隆抗体,琼脂免疫扩散实验显示多克隆抗体可以特异性识别PCT,效价为1∶4.结论 成功克隆、表达并纯化出PCT蛋白,制备了相应的多克隆抗体.     

人Polycomb家族成员NSPc1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的 Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测。方法 应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a(+)载体中，在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His 标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔，获得兔抗人NSPc1多克隆抗体。用Western blot检测抗体免疫反应的特异性。结果 在大肠杆菌中表达并纯化了人NSPc1重组蛋白，纯度达95％，用其免疫新西兰大白兔，成功制备了相应兔源多克隆抗体，Western blot实验中该抗体可以特异识别内源及外源性NSPc1蛋白。结论 原核表达的NSPc1融合蛋白可以被纯化，并具有足够的蛋白免疫原性，所制备的相应多克隆抗体具有良好的特异性，可以运用于NSPc1基因的功能研究。     

小鼠肺炎链球菌脂蛋白SPD_1609多克隆抗体的制备

目的制备肺炎链球菌脂蛋白SPD_1609的小鼠多克隆抗体。方法通过PCR扩增肺炎链球菌D39菌株中的spd_1609基因,连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒pGEX-4T-1609。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶-SPD_1609(GST-1609)融合蛋白。利用GST亲和层析柱纯化GST-1609融合蛋白,纯化后的融合蛋白用凝血酶(thrombin)外切酶切掉GST标签,进一步通过GST亲和层析得到SPD_1609蛋白。用纯化的不含GST标签的SPD_1609蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体的效价, Western blot法检测抗体的特异性。结果成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1609,经GST亲和层析柱分离纯化后可得到相对分子质量(M_r)35 000的SPD_1609蛋白,蛋白纯度在95%以上。ELISA检测结果显示纯化后的SPD_1609蛋白可诱导小鼠产生特异性免疫应答,免疫小鼠血清抗体的效价达1∶40 960, Western blot法检测显示此多克隆抗体可以特异地识别原核表达和肺炎链球菌细胞内表达的SPD_1609蛋白。结论成功制备具有较好特异性的SPD_1609蛋白的小鼠多克隆抗体。     

PPM1A蛋白的表达纯化及鼠多克隆抗体制备研究

目的 表达、纯化PPM1A-His融合蛋白及制备鼠多克隆抗体.方法 将pBEX1-PPM1A-His原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内进行诱导表达,用纯化的PPM1A-His融合蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA、免疫组化和免疫荧光检测抗体的灵敏度和特异性.结果 成功表达并纯化了PPM1A-His融合蛋白,纯化后纯度可达90%;ELISA法测定抗体效价为1:100 000;免疫组化和免疫荧光结果显示所制备的抗体可特异性检测肝和肝癌细胞的PPM1A.结论 获得的PPM1A鼠多克隆抗体有较高的效价和特异性,为PPM1A在肝癌的相关研究打下了基础.     

兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备兔抗人羧酸酯酶1(CES1)多克隆抗体(pAb), 并对抗体进行特性鉴定.方法: 以人正常肝cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CES1(即CES1-GST)和pET-32a-CES1(即CES1-His).CES1-GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb, 辛酸-硫酸铵法纯化抗体, 采用Western blot和免疫组化鉴定抗体的特异性.结果: CES1-GST和CES1-His融合蛋白均在大肠杆菌中以包涵体形式大量表达.兔抗人CES1 pAb效价为1∶ 64 000.Western blot鉴定表明, 该抗体可识别重组人CES1蛋白, 也可特异地识别人肝微粒体中的CES1亚基.免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性识别正常肝组织中的CES1蛋白.结论: 成功地制备了兔抗人CES1 pAb, 该抗体可应用于ELISA、 Western blot、免疫组化等实验, 为进一步研究CES1的功能提供了特异性检测工具.     

兔抗人PON2抗体的制备与初步应用

目的:制备兔抗人PON2(paraoxonase-2)的多克隆抗体并进行初步鉴定.方法:生物信息学方法分析人PON2蛋白序列,选取人兔同源性较低,亲水性及免疫原性较强的片段,通过大肠杆菌原核表达系统进行重组表达,获得GST-PON2融合蛋白用于免疫新西兰大耳白兔获得多克隆抗体,通过XX方法分离纯化得到的抗PON2多克隆抗体,用West-ern blot、间接免疫荧光对其进行特异性及灵敏度鉴定.结果:成功获得了高表达的相对分子质量(Mr)为46 000的PON2重组融合蛋白;Western blot鉴定结果显示此多克隆抗体可特异识别肝脏总蛋白、HeLa细胞及U937细胞中Mr为39 000的天然PON2蛋白;间接免疫荧光结果显示此多克隆抗体所识别的蛋白定位于SY5Y细胞胞质中.结论:抗人PON2的多克隆抗体特异识别肝总蛋白、HeLa细胞及U937细胞中的天然蛋白,可用于PON2的研究及临床检测.     

抗淋巴样增强因子-1羧基端单克隆抗体的制备及其表位的初步鉴定

目的 制备抗淋巴样增强因子-1(LEV-1)羧基端86个氨基酸(Lct86)特异性单克隆抗体,并初步明确其表位,为进一步研究LEF-1 C端特异序列的功能奠定基础.方法 从Jurkat细胞株中扩增LEF-1 C端特异序列eDNA,并克隆入PQE40、pET32a原核表达载体;分别转化入M15、BL21(DE3)感受态菌,IPIG诱导表达;纯化PQFAO-Lct86融合蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体,以pET32a-Lct86融合蛋白鉴定单克隆抗体特异性.LEF-1 C端特异序列不同长度的基因片段定向克隆人PQE40,鉴定各片段的表达,利用Western blotting初步鉴定单克隆抗体的表位.结果 成功构建了PQE40-Lct86、pET32a-Lct86重组原核表达载体;纯化获得PQE40-Lct86融合蛋白;得到一株特异性的抗LEF-1 C端单克隆抗体TMAb1,证实其表位位于437aa～454aa.结论 成功制备了一株特异性的抗LEF-1 C端单克隆抗体TMAb1,并鉴定其抗原识别表位位于437aa～454aa,为进一步研究LEF-1 C端的功能奠定基础.     

人GITR_(aa27-165)蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的: 表达和纯化人GITR胞外段(hGITRaa27-165)融合蛋白, 制备hGITRaa27-165融合蛋白的兔源性多克隆抗体(pAb).方法: 利用PCR从pGEM T-hGITR获得hGITRaa27-165编码序列, 将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建重组表达质粒pQE30-hGITRaa27-165; 将阳性重组质粒转化大肠杆菌, IPTG诱导表达融合蛋白, 通过Profinity IMAC Ni-Charged Resin亲和层析柱进行纯化; 纯化蛋白免疫新西兰大白兔, 获取多克隆抗血清并利用Protein A Sepharose柱进行纯化, ELISA法检测抗体效价, Western blot法检测抗体特异性.结果: 构建了pQE30-hGITRaa27-165原核表达载体, 原核蛋白hGITRaa27-165蛋白以包涵体形式在大肠杆菌得到高水平表达, 通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的hGITRaa27-165蛋白, 蛋白浓度为400 mg/L, 制备的抗hGITRaa27-165多抗效价高达1:1.6×105, Western blot鉴定其具有良好的特异性.结论: 获得高纯度hGITRaa27-165蛋白, 并制备特异性pAb, 将为进一步研究hGITR的生物学功能提供实验基础.     

兔抗人Rig-I蛋白N端CARD结构域多克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人维甲酸诱导基因I(hRig-I)N端CARD结构域(hRig-I-N)多克隆抗体.方法:从逆转录病毒载体MigRI-hRig-I中扩增hRig-I基因N端CARD结构域852 bp长度的基因片段,克隆入pGEX-4T3中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,表达GST-hRig-I-N融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化,免疫家兔制备抗体,并以间接ELISA法测定抗体效价,以Western blot、细胞免疫荧光方法鉴定抗体的特异性.结果:在大肠杆菌中成功表达融合蛋白GST-hRig-I-N,ELISA法检测抗体的效价达到1:125 000,Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示抗体可与原核及真核表达的hRig-I-N蛋白特异结合.结论:制备了高效价、高特异性的hRig-I-N抗体,为进一步研究hRig-I-N的功能奠定了基础.     

小鼠SKA1蛋白的多克隆抗体制备、鉴定与初步应用

目的:制备兔抗鼠SKA1(Spindle and Kinetochore Associated 1)多克隆抗体.方法:利用PCR的方法得到小鼠SKA1基因并克隆至pGEX-2T 原核表达载体中,转化入大肠杆菌BL21表达,经IPTG 诱导表达GST-SKA1融合蛋白,经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA测定抗鼠SKA1多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性.结果:构建了pGEX-2T-SKA1原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-SKA1融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体.ELISA测定表明SKA1多克隆抗体效价为1:25 600,Western blot分析表明SKA1多克隆抗体具有良好的特异性.通过免疫组织化学方法发现,SKA1表达于高分化前列腺癌细胞中.结论:成功地制备了效价及特异性良好的兔抗鼠SKA1多克隆抗体,为SKA1基因功能的研究奠定基础.     

小鼠抗人Myosin Va多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备Myosin Va多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具.方法:PCR扩增编码人Myosin Va C末端(MyoVaCT)278个氨基酸的cDNA片段,DNA重组入原核表达质粒pET28a,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基β-D硫代半糖苷(IPTG)诱导表达His-MyoVaCT融合蛋白.经电泳纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗血清.通过ELISA和免疫荧光法鉴定血清特异抗体效价和特异性.结果:成功构建了pET28a/MyoVaCT原核表达载体,转化BL21后可高效表达融合蛋白His-MyoVaCT,纯化蛋白免疫小鼠后产生的Myosin Va多抗可特异检测细胞内源性Myosin Va的表达及定位情况,同时能特异识别细胞内外源表达的Myosin Va分子.结论:获得了效价和特异性都良好的Myosin Va抗体,适合应用于Myosin Va的检测.     

HIV-1 C亚型Gp120蛋白表达、纯化及其抗体制备的研究

目的 制备HIV-1 C亚型Gp120蛋白及其抗体.方法 用PCR技术从表达C亚型HIV-1全长gp16O基因的质粒上扩增gP120基因羧基末端部分片段,其长度为612个核苷酸,编码204个氨基酸.将测序鉴定正确的gp120基因片段克隆到原核表达载体pET-30a上,以包涵体的形式在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,Gp120蛋白C端融合6×His标签便于纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备C亚型Gp120特异性兔多克隆抗体,用间接ELISA法测定抗体滴度,并用Western Blot方法验证该抗体是否可识别在哺乳动物细胞内表达的C亚型Gp160蛋白.结果 成功地获得高纯度的C亚型Gp120融合蛋白,用其制备的多克隆抗体滴度可达1:204 800,该抗体可特异性识别在COS-1细胞中瞬时表达的C亚型Gp160蛋白.结论 获得了高纯度的C亚型Gp120融合蛋白及其高效价的抗体.     

截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建截短型鸭乙型肝炎病毒(DHBV)核心蛋白的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体.方法:应用基因工程技术将编码截短型DHBV核心蛋白(DH-BeAg 1～214 aa)的基因片段装入原核表达载体pRSET-B内,在宿主菌Rosetm(DE3)pLacI内进行诱导表达,运用Ni-NTA方法纯化目的蛋白.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验(ELISA),Westemblot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性.结果:成功地构建了含截短型DHBV核心区基因的质粒,并纯化得到了相对分子质量(Mr)约为28 000的目的蛋白,用之免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体.结论:获得的重组截短型DHBV核心抗原纯度高,免疫反应性强;获得的多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性,为DHBV的检测和研究奠定了实验基础.     

小鼠双尾C蛋白Bicc1多克隆抗体的制备及细胞内定位的初步研究

目的:制备小鼠双尾C蛋白Bicc1的多克隆抗体并确定其在细胞内定位.方法:根据生物信息学分析结果, PCR扩增小鼠Bicc1编码61E-199A的cDNA片段.将该片段克隆到GST融合蛋白表达载体上, 在IPTG诱导下产生Bicc1-N抗原.纯化目的蛋白并制备兔抗Bicc1蛋白多克隆抗体.Western blot鉴定抗体特异性, 并以间接免疫荧光法初步分析该蛋白在细胞内定位.结果:成功构建Bicc1-N片段原核表达载体, 在大肠杆菌中实现可溶性表达, 制备小鼠Bicc1蛋白的多克隆抗体, 并证实该蛋白主要表达于细胞质内.结论:成功制备了高效价并特异的兔抗Bicc1多克隆抗体, 为进一步研究Bicc1基因产物的生物功能奠定了基础.     

ENO1多克隆抗体的制备与初步鉴定

目的制备抗Enolase 1的兔多克隆抗体(pAb)并进行特异性鉴定。方法以人宫颈癌细胞系HeLa细胞cDNA为模板,构建重组表达质粒pET-32a-ENO1。His-ENO1融合蛋白在大肠杆菌中高效表达,纯化后作为免疫原制备兔多克隆抗体。采用ELISA、Western blot和免疫组化法鉴定抗ENO1兔多克隆抗体针对重组蛋白和天然蛋白的特异性。结果 His-ENO1融合蛋白在相对分子质量约29 000处呈现明显表达条带。Western blot鉴定表明,制备的抗ENO1兔多克隆抗体可特异性地识别ENO1重组蛋白和不同肿瘤细胞系HeLa、MCF7、HepG2和K562中的ENO1蛋白。免疫组化结果表明该多抗可特异性识别肾组织中的ENO1蛋白。结论成功制备出兔抗人ENO1抗血清,为进一步研究ENO1的功能奠定了基础。     

Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Nono(non-POU-domain-containing,octamer-bindingprotein)融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a( )-Nono重组表达质粒,转入Rosetta(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a( )-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。