反义STAT3对肿瘤细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用

背景与目的：研究表明STAT3蛋白在多种肿瘤组织或细胞中高表达。STAT3蛋白可能参与了肿瘤的形成和发生。本文拟研究STAT3蛋白在鼠黑色素瘤细胞B16、人肝癌细胞SMMC-7721、人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞A549、人宫颈癌HeLa细胞株中表达和活化情况,研究反义STAT3寡核苷酸对B16细胞的增殖抑制和促凋亡作用,为进一步反义药物设计及应用于辐射领域作前期研究。方法：利用Western blot检测所选几种肿瘤细胞的STAT3蛋白表达和磷酸化情况、反义干涉前后B16细胞中STAT3蛋白表达和磷酸化活化的变化情况,MTT法检测细胞增殖变化,利用Hoechst33258染色对细胞凋亡作形态学上的观察．用Annexin V／PI复染结合流式细胞仪检测细胞早期凋亡。结果：所研究的几种肿瘤细胞中均可检测到STAT3蛋白的高表达和磷酸化;反义STAT3转染后,B16细胞中STAT3蛋白的表达量及磷酸化水平均有下降;转染后48h,在0到200nmol／L范围内,反义核酸浓度越高。对B16细胞的增殖抑制效应越强,但是并不能够完全抑制肿瘤细胞的增殖（P〈0．01）。寡核苷酸浓度超过250nmol／L时．正义对照也表现出一定的增殖抑制作用（P〈0．05）;转染后不同时间内检测,结果表明转染后24h反义核酸即开始表现出一定的增殖抑制效应,48h起表现出明显的抑制效应;反义转染后,检测各组细胞早期凋亡率：对照组早期凋亡率为5．52％．反义400、800、2000nmol／L组早期凋亡率分别为8．22％、9．99％．16．97％,正义对照400、800、2000nmol／L组早期凋亡率分别为5．87％、5．36％、13．31％。统计分析表明反义寡核苷酸与B16细胞作用后能够促进细胞的早期凋亡（P〈0．01）,正义低浓度转染组（400、800nmol／L组）与对照组无明显差别（P〉0．05）,而对照组与正义2000nmol／L组相比,细胞的早期凋亡率也有统计学差异（P〈0．01）。结论：B16、SMMC-7721、HepG-2、A549、HeLa等恶性肿瘤细胞株中STAT3蛋白高表达并且可检测到磷酸化水平的增高;反义转染后B16细胞中STAT3蛋白的表达和磷酸化水平降低．细胞增殖受到明显抑制。细胞的凋亡增加．表明STAT3可能成为肿瘤治疗新的分子靶位。     

Survivin反义寡核苷酸诱导K562/A02细胞凋亡的实验研究

背景与目的:Survivin是最近发现的凋亡抑制基因,与白血病的发生和耐药有关,反义寡核苷酸可抑制survivin表达,诱导凋亡,增加药物的敏感性。本研究探讨survivin反义寡核苷酸对白血病耐药细胞K562/A02生长、凋亡和半胱氨蛋白水解酶3的活性的作用。方法:以脂质体转染survivin反义寡核苷酸,以MTT、RT-PCR、流式细胞术、荧光分光光度计分别检测survivin反义寡核苷酸对K562/A02细胞的生长抑制、survivin mRNA表达、凋亡和半胱氨蛋白水解酶3的活性。结果:survivin反义寡核苷酸对K562/A02细胞的生长抑制呈浓度-时间依赖性,与对照组相比,survivin mRNA表达降低36.2%(P<0.05),半胱氨蛋白水解酶3的活性增加67.6%(P<0.05);K562/A02细胞的凋亡率明显增加(14.48±2.65%vs 2.39±0.47%,P<0.005)。结论:survivin反义寡核苷酸通过抑制survivin表达,上调半胱氨蛋白水解酶3活性而诱导凋亡。     

端粒酶反义寡核苷酸及顺铂对恶性脑胶质瘤治疗的协同作用

目的观察端粒酶反义寡核苷酸(ODN)及顺铂对恶性脑胶质瘤治疗的协同作用.方法用15例Ⅲ、Ⅳ级端粒酶活性阳性表达的脑恶性胶质瘤制备单细胞悬液并原代培养,以5μmol/L端粒酶反义ODN抑制恶性胶质瘤细胞端粒酶活性后,用不同浓度顺铂处理细胞.流式细胞仪检测处理前后胶质瘤细胞PCNA、TUNEL阳性百分率变化情况.结果端粒酶反义ODN作用于恶性胶质瘤细胞72h后,TRAP法检测端粒酶活性转为阴性,此时0.3μg/mL顺铂即可对胶质瘤细胞有明显抑制增殖、促进凋亡作用.结论端粒酶反义ODN能抑制端粒酶活性,增加恶性胶质瘤细胞对顺铂的敏感性,与顺铂在治疗恶性胶质瘤细胞过程中有协同作用.     

下调miR-93表达抑制人脑胶质瘤细胞生长和侵袭的研究

目的 验证下调miR-93表达对人脑胶质瘤细胞株的生长和侵袭抑制作用.方法 合成miR-93抑制物,应用脂质体转染人脑胶质瘤细胞以抑制其表达,实时定量PCR检测转染后miR-93表达情况,流式细胞术检测、四甲基偶氮噻唑法(MTT)试验和软琼脂克隆形成实验评价细胞生长变化,tran-swell实验检测细胞侵袭能力的变化.结果 转染miR-93抑制物后,细胞中miR-93高表达被明显抑制,细胞周期进展迟滞,S期细胞减少,生长速度减慢,克隆形成能力减弱,穿过matrigel胶的细胞数减少,侵袭能力被抑制.结论 下调miR-93表达可抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭.     

Survivin反义寡核苷酸抑制EC9706细胞增殖并诱导细胞凋亡

目的 观察Sunrivin反义寡核苷酸(ASODN)对人食管癌细胞系EC9706细胞增殖和凋亡的影响.方法 人工合成Survivin基因反义和正义ODN,并进行硫代磷酸化修饰,通过脂质体途径分别转染 EC9706 细胞;应用 RT-PCR 和 Western Blot 检测 SurvivinmRNA和蛋白表达;应用MTT法检测 Survivin ASODN 对 EC9706 细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡比率.结果 体外培养的 EC9706 细胞可表达较强的 Survivin mRNA 和蛋白;Survivin ASODN 可呈浓度依赖性地抑制 Survivin mRNA 和蛋白表达,50μmoL/L ASODN 几乎可以完全抑制.MTT 研究结果表明,Survivin ASODN 可呈浓度依赖性地抑制 EC9706 细胞增殖,50μmol/L ASODN 对细胞生长的抑制率可达78.5%,诱导细胞凋亡,使细胞阻滞于G2/M 期.Survivin SODN 对 Survivin mRNA 和蛋白以及 EC9706 细胞的增殖和细胞周期无明显的抑制作用.结论 脂质体介导转染 Survivin 反义寡核苷酸可抑制细胞增殖、诱导细胞G2/M 期阻滞而促进细胞凋亡.     

热休克蛋白70反义寡核苷酸诱导胶质细胞瘤凋亡的研究

目的：探讨热休克蛋白70（HSP70）反义寡核苷酸阻断胶质瘤细胞的HSP70的表达及对胶质瘤细胞凋亡的影响。方法：用MTT法、流式细胞术、琼脂糖凝胶DNA电泳方法观察HSP70反义寡核苷酸对体外培养的胶质瘤C6细胞株HSP70表达的抑制及其对生长和凋亡的影响。结果：用HSP70反义寡核苷酸处理的胶质瘤细胞表现出明显的生长抑制,琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞DNA降解的特征性DNA阶梯图;MTT法测定的生长抑制率和流式细胞术分析的凋亡率与HSP70反义寡核苷酸呈剂量、时间依赖性关系。结论：HSP70反义寡核苷酸通过抑制HSP70表达而诱导胶质瘤C6细胞株凋亡并抑制其生长,可作为基因治疗胶质瘤的新靶向。     

生存素反义寡核苷酸促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡

目的：探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASODN）对顺铂（diamminedichloroplatinum，DDP）诱导骨肉瘤细胞凋亡的促进作用。方法：通过合成靶向survivin的ASODN转染骨肉瘤OS-732细胞并与DDP联合作用，同时设空白对照组、正义（SODN）组及DDP组进行比较。采用RT—PCR、免疫细胞化学法检测各组细胞survivin mRNA和蛋白表达状态，流式细胞仪（flow cytometry，FCM）、吖啶橙／溴化乙锭（acridine orange／ethidium bromide，AO／EB）染色法检测各组细胞凋亡水平和形态，MTT法检测细胞生长抑制情况。结果：与空白对照组、SODN组及DDP组相比，ASODN转染组细胞survivin mRNA及蛋白表达明显减弱，细胞凋亡水平较空白对照组、SODN组相应提高，细胞萎缩、染色质浓缩呈典型凋亡改变，细胞生长相对受抑；上述指标在ASODN＋DDP组变化更为明显。其细胞凋亡指数（apoptotic index，AI）和细胞生长抑制率（inhibition ratio，IR，61．36％）明显高于各单“药”组（SODN组6．81％、ASODN组31．82％和DDP组41．35％）及SODN＋DDP组（45．45％），P〈0．05。结论：As0DN能够特异性封闭骨肉瘤OS-732细胞中survivin基因表达，使其功能相应爱抑，增加细胞对DDP敏感性，进而增进DDP诱导骨肉瘤细胞凋亡效应。     

生存素反义寡核苷酸促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡

目的:探讨生存素(survivin)反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASODN)对顺铂(diamminedichloroplatinum,DDP)诱导骨肉瘤细胞凋亡的促进作用。方法:通过合成靶向survivin的ASODN转染骨肉瘤OS732细胞并与DDP联合作用,同时设空白对照组、正义(SODN)组及DDP组进行比较。采用RTPCR、免疫细胞化学法检测各组细胞survivinmRNA和蛋白表达状态,流式细胞仪(flowcytometry,FCM)、吖啶橙/溴化乙锭(acridineorange/ethidiumbromide,AO/EB)染色法检测各组细胞凋亡水平和形态,MTT法检测细胞生长抑制情况。结果:与空白对照组、SODN组及DDP组相比,ASODN转染组细胞survivinmRNA及蛋白表达明显减弱,细胞凋亡水平较空白对照组、SODN组相应提高,细胞萎缩、染色质浓缩呈典型凋亡改变,细胞生长相对受抑;上述指标在ASODN+DDP组变化更为明显,其细胞凋亡指数(apoptoticindex,AI)和细胞生长抑制率(inhibitionratio,IR,61.36%)明显高于各单“药”组(SODN组6.81%、ASODN组31.82%和DDP组41.35%)及SODN+DDP组(45.45%),P<0.05。结论:ASODN能够特异性封闭骨肉瘤OS732细胞中survivin基因表达,使其功能相应受抑,增加细胞对DDP敏感性,进而增进DDP诱导骨肉瘤细胞凋亡效应。     

反义硫代寡核苷酸对人脑胶质瘤细胞系转化生长因子α基因表达及生长抑制作用的研究

目的研究转化生长因子α（ＴＧＦα）反义寡核苷酸对人脑胶质瘤细胞系中该ＴＧＦα基因表达的作用。方法采用人工合成反义、正义及随机三组硫代脱氧寡核苷酸（ＳＯＮ）经阳性脂质体包裹后转染人脑胶质瘤ＴＪ９０５细胞系。用细胞计数检测转染后瘤细胞的生长抑制率，用细胞原位ＲＮＡ杂交与免疫组化方法检测ＴＧＦαｍＲＮＡ及蛋白的表达水平。结果ＴＧＦα反义ＳＯＮ可抑制ＴＪ９０５细胞系的生长和ＴＧＦαｍＲＮＡ及其蛋白的表达。结论ＴＧＦα反义ＳＯＮ能够抑制人脑胶质瘤ＴＪ９０５细胞系ＴＧＦαｍＲＮＡ及其蛋白的表达，同时细胞的生长受到明显抑制。     

端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验

目的研究端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞株的凋亡诱导作用及其机制。方法以人肝癌细胞株SMMC-7721、正常肝细胞株L-02为研究对象,采用TRAP-ELISA法对肿瘤细胞端粒酶活性进行定性定量分析;细胞形态学、TUNEL染色、DNA 琼脂糖凝胶电泳观察端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用,用流式细胞仪对细胞周期进行时相分析,Western杂交对细胞周期蛋白进行研究。结果一定浓度的端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性,肝癌细胞端粒酶活性被抑制后传代23～26次出现细胞凋亡。细胞凋亡与细胞周期蛋白有关。结论端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性并诱导其凋亡。     

K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对体外培养的人胰腺癌细胞PC-2凋亡的影响

目的观察针对于胰腺癌K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对体外培养人胰腺癌细胞株PC-2凋亡的影响。方法脂质体将人工合成的针对于K-ras基因第12位密码子点突变的反义寡脱氧核苷酸转染体外培养的人胰腺癌细胞株PC-2,流式细胞仪、凋亡细胞原位末端标记（TUNEL）、倒置相差显微镜检测反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞PC-2凋亡的影响。结果转染48小时后,流式细胞仪：实验组有明显的凋亡峰,细胞大部分被阻滞于G1期,S期比例减少。TUNEL：实验组凋亡细胞明显增多。倒置相差显微镜：实验组凋亡小体明显增多。结论针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸作用于体外培养的胰腺癌细胞PC-2,对癌细胞的凋亡有明显的促进作用。     

蜂胶黄酮PB3A对大肠癌细胞SW480中RGS2和GEM基因表达水平的影响

目的 研究蜂胶黄酮(pinobanksin-3-acetate,PB3A)对体外培养的大肠癌SW480细胞中G蛋白信号转导调节因子2 (regulator of G-protein signaling 2,RGS2)和GTP结合丝裂原诱导蛋白(GTP binding protein overexpressed in skeletal muscle,GEM)基因转录和蛋白质表达水平的影响,探讨PB3A的抗肿瘤作用机制及其相关信号通路.方法 通过实时荧光定量RT-PCR和蛋白印迹法检测100 mg/L PB3A作用下人大肠癌细胞SW480中RGS2和GEM基因的转录和表达情况.结果 100 mg/L PB3A药物的干预诱导SW480细胞出现悬浮的细胞碎片、细胞体缩小、变圆、皱缩.药物干预之后,SW480细胞中RGS2和GEM基因在mRNA和蛋白水平上调表达.实验组与对照组比较,RGS2和GEM基因的mRNA转录水平差异有统计学意义(P＜0.01),蛋白质表达水平差异有统计学意义(P＜0.05).根据RT-PCR检测结果,利用Spearman相关性分析检测出RGS2和GEM高度正相关(r=0.929,P＜0.01).结论 PB3A干预大肠癌SW480细胞后使RGS2和GEM基因在转录和翻译水平上上调表达.PB3A的抗大肠癌作用机制可能与RGS2和GEM基因的上调表达有关.     

TRAIL蛋白与顺铂协同诱导横纹肌肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的探讨肿瘤坏死因子（INF）相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白和顺铂联合应用对人横纹肌肉瘤细胞生长抑制和诱导凋亡作用。方法将不同浓度的TRAIL作用于培养的人RD横纹肌肉瘤细胞，通过MTT比色法、流式细胞仪检测细胞凋亡和Fas蛋白表达的方法，观察其对横纹肌肉瘤细胞的作用，及其与顺铂协同作用的效果和机制。结果TRAIL浓度为1．0、10．0、100．0ng／ml时，细胞毒性指数分别为18．9％、20．8％和43．5％；顺铂浓度为1．0、5．0、10．0μg／ml时，细胞毒性指数分别为9．8％、23．4％和37．1％。而浓度为100ng／ml的TRAIL与浓度为5μg／ml的顺铂联合作用时，细胞毒性指数明显增加达66．4％，结合FCM分析显示联合应用提高了Fas蛋白的表达，与细胞凋亡率增加相一致。结论TRAIL和顺铂均能有效诱导横纹肌肉瘤细胞凋亡，联合应用具有明显的协同效果。     

顺维甲酸体外诱导肺腺癌细胞A549凋亡的研究

目的:探讨9-顺维甲酸(9-cis-RA)对人肺腺癌细胞A549的诱导凋亡作用。方法:体外培养肺腺癌细胞株A549,用MTT法观察9-cis-RA对细胞的生长抑制作用,采用电镜、流式细胞仪等方法检测9-cis-RA对细胞的诱导凋亡作用。结果:9-cis-RA对A549细胞有生长抑制效应,抑制率随着9-cis-RA浓度、作用时间的增加而增加。9-cis-RA明显诱导A549细胞的凋亡,可观察到凋亡小体和凋亡峰,药物作用48h后,9-cis-RA浓度为5、10μmol/L的细胞凋亡率分别为7.2%和13.3%,细胞凋亡率呈现量效关系。结论:9-cis-RA可能通过诱导肺癌细胞凋亡抑制肺癌细胞增殖,发挥其抗癌作用。     

藤茶双氢杨梅树皮素对人视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞凋亡的诱导作用

目的 观察中药单体成分双氢杨梅树皮素(ampelopsin,APS)对人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)细胞株HXO-RB44凋亡的影响,以探讨中药治疗RB的可能性.方法 取对数生长期的人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44用于实验,不同浓度的APS作用于HXO-RB44细胞24小时后,以MTT法、生长曲线法、软琼脂克隆形成法观察APS对HXO-RB44的体外抑制作用;倒置显微镜观察其形态学变化;AO/EB染色观察细胞凋亡形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 MTT法检测证实,APS对HXO-RB.的IC50为14.71 mg/L;细胞生长曲线法提示其对HXO-RB44细胞生长有明显抑制作用;软琼脂克隆形成法观察APS浓度＞9.90 mg/L时抑制率为100.0％,药物浓度为4.40 mg/L,抑制率为52.2％.APS作用后出现了明显的凋亡细胞,表现为细胞皱缩、核染色质浓缩、核碎裂等凋亡特征性的形态学改变.流式细胞仪检测50.00 mg/L、14.84 mg/L、4.40 mg/L和0.00 mg/L APS作用24小时后的细胞凋亡率分别为88.1％、58.5％、14.8％和4.8％,各浓度组凋亡率与空白对照组(4.8％)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05),各浓度组细胞凋亡率之间差异也均有统计学意义(P＜0.05).结论 APS对HXO-RB44细胞的体外增殖活性有明显的抑制作用,并可诱导体外培养的RB细胞凋亡,可作为中药治疗RB的候选药物.     

吲哚美辛诱导肝癌HepG2细胞凋亡及其对cyclin E蛋白表达的影响

目的　观察吲哚美辛诱导肝癌 Hep G2细胞凋亡 ,及其对 cyclin E蛋白的影响。方法　采用 MTT比色法观察吲哚美辛对肝癌 Hep G2细胞增殖的影响 ;采用流式细胞仪检测吲哚美辛对 Hep G2细胞周期分布的影响 ,同时结合透射电子显微镜观察吲哚美辛诱导肝癌 Hep G2细胞凋亡的作用 ;免疫细胞化学方法观察吲哚美辛对Hep G2细胞周期调控蛋白 cyclin E的影响。结果　吲哚美辛可抑制肝癌 Hep G2细胞的增殖 ,诱导其凋亡 ,改变细胞周期分布 ,使 G0 /G1 期细胞比例增高 ,S期比例降低 ,同时还可使 cyclin E蛋白表达下降。上述作用具有剂量和时间依赖性 (P<0 .0 5 )。结论　吲哚美辛可诱导肝癌 Hep G2细胞凋亡 ,改变细胞周期分布 ,影响细胞周期调控蛋白表达 ,从而抑制细胞增殖。     

Livin反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖和凋亡影响的研究

目的：探讨Livin mRNA反义寡核苷酸（ASODN）对人乳腺癌MCF-7细胞抑制增殖及诱导凋亡的影响。方法：设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸（MSODN）,脂质体转染至培养的MCF-7细胞。采用MTT法检测Livin ASODN对MCF-7细胞的增殖抑制作用,RT-PCR检测Livin mRNA的表达水平,电镜、流式细胞仪与吖啶橙／溴化乙锭（AO／EB）细胞染色法检测细胞凋亡水平和形态学改变。结果：Livin ASODN在终浓度为600nmol／L作用MCF-7细胞48h时,能明显地抑制其增殖（IC50=604.4）,降低Livin mRNA的表达;电镜、流式细胞仪与A0／EB细胞染色法则表明MCF-7细胞在形态学上出现明显的凋亡改变,细胞凋亡率显著增加,而对照组寡核苷酸未见抑制效应。结论：Livin ASODN能够特异性下调MCF-7细胞中Livin基因表达,在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制增殖中发挥重要作用。     

外源性白介素24促进C6细胞凋亡的体外研究

目的 探讨外源性白细胞介素24(interleukin 24,IL-24)体外抑制胶质瘤细胞增殖及促凋亡的相关机制.方法 应用MTT体外观察转染IL-24对胶质瘤C6细胞增殖的抑制作用.应用Hoechst 33258荧光染色体外观察IL-24对C6细胞的促凋亡作用.Western blot法检测c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和caspase-3蛋白的表达变化情况.结果 IL-24能使C6细胞的体外增殖能力降低,转入IL-24的C6细胞(C6/IL-24)增殖能力下降.经Hochest 33258染色,转入IL-24的C6细胞凋亡后出现核固缩、染色质凝集呈块或碎裂状改变.与转入空载体的C6细胞(C6/pLXSN)及C6细胞比较,C6/IL-24细胞的JNK和caspase-3蛋白表达均增高(均P＜0.05).C6/pLXSN与C6细胞比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 外源性IL-24基因可抑制C6胶质瘤细胞的增殖并诱导其凋亡,该诱导凋亡的作用可能与其上调并激活JNK及caspase-3表达有关.     

人脑胶质瘤细胞原代培养实验模型的构建

目的:探索人脑胶质瘤细胞原代培养的方法,提高原代培养的成功率,快速构建人脑胶质瘤细胞体外试验模型。方法:分别采用组织块培养法和酶消化法对12例人脑胶质瘤细胞进行原代培养,比较两种方法的培养效果;通过倒置相差显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞的形态学特点;通过生长曲线的测定研究体外培养细胞的生长特性。结果:原代人脑胶质瘤细胞短期培养成功,并可传代。经组织块培养法成功率较低为33.3%;经酶消化法短期培养成功率为83.3%,明显高于组织块培养法。培养成功的细胞状态稳定,增殖活跃,有明显的对数生长期。结论:用酶消化法可进行人脑胶质瘤短期体外培养,且成功率较高,适宜建立体外细胞培养模型。