应用间接免疫荧光技术检测人巨细胞病毒-PP65抗原的临床意义

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）-PP65抗原检测的临床意义。方法：利用间接免疫荧光技术对本院56例住院患者外周血HCMV-PP65抗原进行检测,其中器官移植组35例（肾移植患者13例,肝移植患者14例,骨髓移植患者8例）,其他疾病组21例。设本院健康体检者20例为正常对照组。结果：56例标本中有25例检出HCMV-PP65抗原阳性,阳性率为45%。25例抗原阳性患者中,有临床症状的患者外周血中的HCMV-PP65抗原阳性细胞数明显高于无临床症状的HCMV-PP65抗原阳性的患者,两者比较差异有显著性（P〈0.01）。正常对照组无一例阳性。结论：HCMV-PP65抗原检测具有简便、敏感的特点,其结果与患者的临床症状相关,可以作为监测HCMV活动性感染的指标,为临床提供诊治依据。     

荧光定量PCR与PP65抗原检测在诊断儿童巨细胞病毒活动性感染的比较

目的用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和pp65抗原检测儿童人巨细胞病毒(HCMV)感染,并对其诊断HCMV活动性感染进行比较评估。方法分析924例HCMV血清学检测阳性的儿童的全血HCMV-DNA荧光定量PCR及HCMV-pp65抗原检测结果,与临床诊断的符合程度进行比较。结果全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的一致率为81.17%,其标准误为0.39,Kappa值为0.60;PCR检测HCMV感染的灵敏度为98.4%,特异度为97.3%,Youden指数为0.957,PVP和PVN分别为0.961和0.989;pp65抗原检测用于检测HC-MV感染的灵敏度为59.2%,特异度为100%,Youden指数为0.592,PVP和PVN分别为1.00和0.782。结论全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的结果有较好的一致性,诊断HCMV感染PCR检测的灵敏度较pp65抗原检测的灵敏度要高,而后者的特异度较前者高。二种方法都可用于CMV活动性感染的诊断。     

流式细胞术分析HCMV—PP65抗原在外周血各有核细胞群上的表达及意义

目的 研究分析人外周血有核细胞感染人类巨细胞病毒PP65抗原(Human Cytomegalovirus PP65 antigen,HCMV-PP65Ag)的阳性表达率及临床意义.方法 应用漉式细胞术(Flow Cytometry,FCM)对广州军区广州总医院2007年1月～2008年12月共256例患者的外周血有核细胞HCMV-PP65Ag阳性表达百分率进行分析,其中移植组80例,肿瘤组48例,肾功能不全组86例.其它疾病组42例;设门诊健康体检者20例为正常对照组.对HCMV检出阳性患者根据并发细菌感染与否分为两组,观察两组间临床治疗方案的选择.另对26例HCMV现症感染患者进行连续四周检测,动态现察HCMV-PP65Ag的表达与临床症状的关联.结果 256例患者共检出144例HCMV-PP65Ag阳性;HCMV-PP65Ag阳性患者中并发细菌感染与无细茼并发感染两组临床发热症状及临床用药方案问比较差异均有统计学显著性意义(均P＜0.05).动态观察组监测结果 显示,持续HCMV-PP65Ag检测阳性患者,尤其是粒细胞群表达阳性时,临床多表现有发热症状及易并发细菌感染.结论 运用FCM检测人外周血有核细胞表面HCMV-PP65Ag,能快速、准确、有效地提供HCMV感染依据;而对HCMV感染的各细胞群进行分析,有利于临床了解疾病情况和制订治疗方案.     

外周血白细胞HCMV PP65抗原检测结果分析

目的 分析外周血白细胞巨细胞病毒（HCMV）PP65抗原检测结果，总结儿科常见疾病的HCMV感染情况及HCMV感染所致临床疾病的分布情况。方法 采用间接免疫荧光法检测了1016例儿童外周血白细胞HCMV PP65抗原，对检测结果及阳性病例进行分析。结果 所有送检标本总阳性检出率为25．2％，以肝炎、婴儿肝炎综合征组患儿阳性检出率最高，分别为37．8％、32．4％。CMV感染可累及全身各个系统，引起疾病多样，但以婴儿肝炎综合征最多见（37．1％），其次为高胆红素血症（12．9％）、急性呼吸道感染（10．9％）、腹泻（9．4％）、发热待查（6．6％）．肝炎（5．5％）等。结论 HCMV感染临床上常见，症状多样，临床医生对可疑病例应及早作相应的实验室检查，以助于早期临床诊断，并指导有效的治疗。     

人巨细胞病毒gp52蛋白与pp65蛋白融合表达及初步应用

为提高HCMVIgM抗体检测试剂盒的敏感性及特异眭．本研究重组表达了HCMV糖蛋白gp52与磷蛋白DD65的嵌台抗原。从病毒及质粒中分别扩增gp52(氨基酸181～333,f1)及pp65(氨基酸261～373,f2)两个片段．以不同酶切位点插人到pTrcHi B载体上,筛选正确的重组质粒并在太肠杆菌中诱导表达融合蛋白rp52～65。SDE-PAGE结果显示表达蛋白占菌体总蛋白的30％,卧包涵体的形式存在,分子量为35000。以金属鳌合亲和屡析(IMAC)及分子筛方法纯化表达蛋白,纯度达到96％,回收率为252％。以间接法检测HCMV IgM阳性血清,敏感性达到904％(19／21),证明此融合蛋白具有良好的抗原性,可作为HCMV IgM抗体检测试剂盒的包被抗原。     

CMVPP65抗原监测无关供体造血干细胞移植后巨细胞病毒感染

目的 利用免疫荧光组化方法对CMV.PP65抗原进行监测,探讨无关供体造血干细胞移植后CMV的感染率,危险因素和治疗情况.方法 以37例无关供体造血干细胞移植患者为研究对象,移植14d后每周采集受者的抗凝血标本直到移植后3个月,之后每隔1～3个月采集一次受者的血标本直到移植后3年,3年后仍有CMV再次感染者继续采集患者标本,并进行动态观察.结果 1、在2～50个月的随访期内,CMV首次检出的中位时间在50d,CMV病毒血症发生率59.46%(22/37).严重GVHD患者和无严重GVHD患者CMV感染率无明显差异;2、CMV病毒血症患者对早期抗病毒治疗有效,CMV疾病发生率很低.结论 无关供体造血干细胞移植后长期坚持CMV监测非常必要,有助于指导CMV病毒感染的治疗和预后评价.     

人巨细胞病毒PP65抗原检测在中枢神经系统感染性疾病中的应用

人巨细胞病毒（HCMV）可侵袭中枢神经系统，引起相应的感染性疾病及并发症甚至死亡。HCMV的低基质磷酸蛋白65（HCMV-PP65）抗原是HCMV感染表达的早期抗原，用单克隆抗体混合物C10／C11检测HCMV-PP65抗原，是监测HCMV在疾病中活动性感染的标准方法之一。本研究对25例中枢神经系统感染患者进行了HCMV-PP65抗原检测，现报告如下。     

异基因骨髓移植中巨细胞病毒的临床检测

在异基因骨髓移植中，巨细胞病毒(CMV)感染常可引起致命危险及移植失败，因而探索早期准确检测CMV感染的有效实验手段至关重要。本文介绍了传统的CMV的培养法及近年来发展起来的抗原检测方法和分子生物学方法。     

人巨细胞病毒pp65抗原血症检测方法的建立和初步临床应用

目的建立人巨细胞病毒抗原pp65(HCMVpp65)血症特异、灵敏和低成本的酶免组化和荧光免疫组化方法,以利于临床推广应用.方法以HCMV-AD169感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)爬片作阳性对照,选择试剂和材料组建试剂盒,并与商品化的同类试剂盒作比较,建立人外周血多形核白细胞(PMNLs)中HCMVpp65抗原阳性细胞的检测方法,然后再用荧光定量PCR(FQ-PCR)方法做相应考评.结果我们建立的HCMVpp65抗原血症检测法能成功地检出PMNLs中的pp65阳性细胞.其可检测限分别为102 pfu/ml的AD169攻击24 h后的HELF细胞爬片和3～5个pp65阳性细胞/2×105 PMNLs;用高相对分子质量(500 000)的葡聚糖能快速、有效地分离PMNLs;用4%中性多聚甲醛固定的细胞片,于-20 °C或以下可长期保存(≥6个月),而且pp65抗原性稳定.结论自建的试剂盒与同类进口试剂盒相比,检测pp65的结果差异无显著性,并与FQ-PCR的检测结果相一致,其检测特异、灵敏、操作简单、费用低廉,适宜临床实验室推广应用.     

抗巨细胞病毒pp65抗原单克隆抗体的制备及临床初步比对检测

目的：制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体并建立外周血巨细胞病毒抗原血症免疫荧光检测方法。方法 CM V AD169感染人胚胎肺成纤维细胞M RC‐5后24、48、72h ,超声波破碎和甲醛灭活制备CM V抗原,以及CMV pp65重组抗原免疫BALB／C小鼠,标准方法制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体。利用所得单克隆抗体建立检测外周血巨细胞病毒抗原血症检测的实验方法,并与进口试剂盒CM V BriteTM Kit进行比对。结果共有两株杂交瘤细胞产生特异性抗体,克隆名称为13D1‐3和29F1‐1,免疫球蛋白亚型分别是IgG1型和IgG2a型,制备的腹水抗体纯化后仍具有良好的免疫学特性。单克隆抗体13D1‐3与 CM V BriteTM Kit试剂盒比对,阳性符合率为88．8％,阴性符合率为98．9％,总符合率为97．3％,Kappa值为0．895,吻合度较高。结论成功制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体,建立以13D1‐3单克隆抗体为基础的检测外周血巨细胞病毒抗原血症方法,与CM V BriteTM Kit试剂盒比对具有良好的符合性。     

儿童抽动-秽语综合征HCMV pp65抗原检测的临床意义

目的探讨儿童巨细胞病毒(Hum an cytom egalov irus,HCMV)活动性感染与抽动-秽语综合征(T ourette’s sym-drom e,TS)的关系。方法离心分离64例抽动-秽语综合征患儿和40例正常儿童外周血单个核细胞(PBM C s)和血浆,分别用免疫荧光法和定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV DNA,并比较2种方法的一致性。结果64例TS患儿HCMV pp65抗原有14例阳性,阳性率21.9%,40例正常儿童HCMV pp65抗原有1例阳性,阳性率2.5%,2组儿童HCMV感染率有显著性差异(2χ=7.49,P<0.01)。免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性(89.1%)。结论抽动-秽语综合征儿童HCMV感染率显著高于正常儿童,HCMV活动性感染可能诱发抽动-秽语综合征。     

常见性病患者血液套式PCR扩增HCMV—DNA的研究

目的　建立检测人巨细胞病毒 (HCMV)感染的套式 PCR方法并探讨常见性病患者 HCMV的感染情况。方法　在 HCMV IEA基因内自行设计两对引物 ,建立套式 PCR检测 688例常见性病患者及 1 38名健康献血员血液HCMV- DNA,同时应用捕获 ELISA检测 HCMV- Ig M。结果　性病患者 HCMV- Ig M及 DNA阳性率分别为 34.74%和39.53% ,与对照组 (8.0 0 %、1 0 .1 4 % )相比均有显著性差异 (P<0 .0 1 )。从性病类型来看 ,梅毒患者 HCMV感染率最高 ,其 HCMV- Ig M及 DNA阳性率分别达 46.80 %、51 .90 % ;从年龄分组看 2 6～ 35岁组为 HCMV感染高峰组 ,HCMV- Ig M及 DNA阳性率分别达 40 .2 0 %、46.62 %。结论　性病患者易发生活动性的 HCMV感染 ,性接触也是成年人之间 HCMV的重要传播途径之一。套式 PCR是一种临床检测 HCMV的快速有效手段 ,值得临床推广。     

人类巨细胞病毒与2型糖尿病视网膜病变关系的研究

目的:探讨人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染与2型糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的关系。方法:采用聚合酶链反应(chain reaction technique,PCR)技术分别检测2型糖尿病(T2DM)患者86例(单纯T2DM组40例、DR组46例)以及对照组30例外周血中的HCMV-DNA,放射免疫法测定血浆内皮素(endothelin,ET)。结果:DR组HCMV-DNA检测阳性率(65%)明显高于单纯T2DM组(35%)和对照组(13%,P<0.01),DR组ET含量与单纯T2DM组和对照组比较差异也有显著性。结论:HCMV感染与DR的发生发展有关,HCMV感染可能加重DR。     

小片段干扰RNA抑制人肝癌细胞株中YAP基因表达的研究

目的:研究用小片段干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制肝癌细胞株中YAP(yes-associated protein)表达后肝癌细胞株对阿霉素(adriamycin,ADM)的敏感性变化。方法:设计YAP基因的siRNA序列,用脂质体LipofectamineTM2000将siRNA转染至4株肝癌细胞株PLC/PRF/5、Huh-7、MHCC97H、MHCC97L中,在荧光显微镜下观察并采用蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测肝癌细胞株中YAP的表达。将细胞以不同浓度的ADM处理后,采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thialzolyl tetrazolium,MTT)比色法检测细胞的存活率。结果:成功构建针对YAP的siRNA表达载体。Western blotting结果显示,肝癌细胞株经特异性siRNA转染后,YAP蛋白的表达受到抑制,表明RNA干扰(RNA interference,RNAi)能特异、有效地抑制肝癌细胞株中YAP的表达。MTT结果显示,转染YAP siRNA后肝癌细胞株的存活率受到明显抑制。结论:siRNA抑制肝癌细胞株中YAP的表达可增强肝癌细胞株对ADM的敏感性。     

nm23蛋白表达与人膀胱癌细胞生物学行为的关系探讨

〖目的〗探讨nm23蛋白表达对人膀胱癌细胞生物学行为的影响.〖方法〗对32例临床病理诊断为膀胱移行细胞癌标本、32例癌旁组织标本和32例正常膀胱粘膜标本,采用S-P免疫组化和图像分析技术检测细胞的nm23蛋白表达量,并对32例患者的临床疗效进行为期两年的随访.〖结果〗①nm23蛋白在膀胱癌不同组织中表达率不同,癌组织(75%)明显高于癌旁组织(31.25%)(P＜0.05);癌旁组织明显高于正常组织(6.25%)(P＜0.05);②膀胱癌不同分级之间nm23表达量无显著差异.但表浅膀胱肿瘤(Ta-T1)组表达量(0.198 3±0.004 5)明显高于浸润性膀胱癌(T2～T3)组(0.103 7±0.002 7),未复发组(0.170 3±0.0074)明显高于复发组(0.080 5±0.001 2)(P＜0.05).〖结论〗①膀胱癌组织nm23阳性表达率高于癌旁组织和正常粘膜组织,癌旁组织高于正常粘膜组织.②膀胱癌nm23表达量与其分化、浸润、复发等生物学行为有关.     

nm23蛋白表达与人膀胱癌细胞生物学行为的关系探讨

[目的]探讨nm23蛋白表达对人膀胱癌细胞生物学行为的影响.[方法]对32例临床病理诊断为膀胱移行细胞癌标本、32例癌旁组织标本和32例正常膀胱粘膜标本,采用S-P免疫组化和图像分析技术检测细胞的nm23蛋白表达量,并对32例患者的临床疗效进行为期两年的随访.[结果]①nm23蛋白在膀胱癌不同组织中表达率不同,癌组织(75%)明显高于癌旁组织(31.25%)(P＜0.05);癌旁组织明显高于正常组织(6.25%)(P＜o.05);②膀胱癌不同分级之间nm23表达量无显著差异.但表浅膀胱肿瘤(Ta-T1)组表达量(0.198 3±0.004 5)明显高于浸润性膀胱癌(T2～T3)组(0.103 7±0.002 7),未复发组(0.170 3±0.0074)明显高于复发组(0.080 5±0.001 2)(P＜0.05).[结论]①膀胱癌组织nm23阳性表达率高于癌旁组织和正常粘膜组织,癌旁组织高于正常粘膜组织.②膀胱癌nm23表达量与其分化、浸润、复发等生物学行为有关.     

糖基化终产物对人单核细胞源树突状细胞丝裂原激活蛋白激酶表达的影响

目的:探讨糖基化终产物(AGEs))对人单核细胞源树突状细胞(MDCs)丝裂原激活蛋白激酶表达的影响,探索AGEs在动脉粥样硬化免疫炎症反应中的作用。方法:免疫磁珠法分离人外周血CD14 单核细胞,经含重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)(100ng·mL-1)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)(50ng·mL-1)的RPMI1640培养,使其分化为MDCs,用200μg·mL-1AGE-BSA干预DCs0,10,20,30,40min,采用Western-Blot,检测丝裂原激活蛋白激酶(MAPK),即磷酸化Erk、磷酸化Jnk、磷酸化P38MAPK的表达。结果:AGE-BSA刺激磷酸化Erk、磷酸化Jnk、磷酸化p38MAPK的表达,20min达到高峰,30min后开始下降,并且Jnk抑制剂SP600125明显抑制了AGE-BSA促进的糖基化终产物受体(RAGE)的表达。结论:AGEs能够激活MAPK信号途径,其中Jnk信号途径与RAGE的表达有关,这可能是AGEs通过树突状细胞促进动脉粥样硬化炎症免疫反应发生的重要机制之一。     

B7-H1在人骨髓间充质干细胞上的表达及其对T淋巴细胞增殖的影响

目前关于人骨髓间充质干细胞（hBMMSC）的免疫调节机制尚不完全清楚。为探讨B7-H1在hBMSC上的表达水平及hBMMSC的免疫调节机制是否与B7-H1介导的信号通路（B7-H1／PD-1）有关,首先分离、培养、鉴定hBMMSC,采用流式细胞术、RT—PCR、Western—blot检测B7-H1在hBMMSC上的表达水平。进一步采用混合淋巴细胞培养法（MLC）观察hBMMSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用,然后使用功能级的抗B7-H1单克隆抗体阻断B7-H1．用CCK-8试剂盒检测阻断前后T淋巴细胞增殖活性。结果表明：hBMMSC高表达B7-H1分子;表达B7-H1的hBMMSC能有效地抑制T淋巴细胞的增殖,其抑制作用与hBMMSC数量呈剂量依赖性;使用抗B7-H1单克隆抗体阻断B7-H1后hBMMSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用显著降低,抑制率由64．1％降低至38．75％。结论：B7-H1在hBMMSC上高表达,B7-H1介导的信号通路（B7-H1／PD-1）参与了hBMMSC的免疫调节作用。