γ分泌酶研究新进展:γ分泌酶激活蛋白

β淀粉样蛋白(Aβ)聚集是阿尔茨海默病(AD)的重要病理特征之一,γ分泌酶对Aβ形成起关键作用,但γ分泌酶存在多种底物蛋白,目前多种在研究的γ分泌酶抑制剂临床试验均因同时抑制其他底物蛋白而产生严重不良反应被终止。γ分泌酶激活蛋白(GSAP)可激活γ分泌酶特异性裂解产生Aβ,因此通过抑制GSAP,可选择性减少Aβ,而不影响其他蛋白裂解,有望成为AD的治疗靶点。文中就γ分泌酶激活蛋白生物特性、作用机制及调控因子等进行综述。     

β－分泌酶与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（A D ）是最常见的一种痴呆症,主要临床特点为进行性认知功能下降,最终导致身体机能的下降甚至死亡,65岁以上的老年人群多发［1］。对于年轻家族性AD患者而言,AD的发生与多基因因素相关,而对于年老的散发性AD患者,其原因是多重性的,包括基因、环境和后天造成的基因改变等因素。尽管AD的病因不明,但患者脑内β－淀粉样蛋白（Aβ）的增多可能是导致此病的首要原因。Aβ主要是由β－淀粉样前体（APP ）在β－分泌酶（BACE1）的作用下使其在β位点发生裂解而产生,这一过程在AD的病理性神经纤维缠结和淀粉样斑块形成中发挥着重要作用［2］。AD患者中BACE1的表达和活性均有显著升高［3］,已成为诊断AD的一个重要生物指标［4］。而关于BACE1的了解目前还存在很多局限,现通过以下几个方面来讨论近年BACE1在AD中的有关研究进展。     

20008/慢性脑血流低灌注对大鼠海马β-和γ-分泌酶活性的影响

目的：研究慢性脑血流低灌注条件下海马区域β-和γ-分泌酶活性变化。方法： 5月龄SD雄性大鼠行双侧颈总动脉结扎,随机分为术后10d、30d、90d和180d组。Morris水迷宫实验检测动物行为学改变,直接荧光法检测各组海马组织β-和γ-分泌酶活性。结果：　Morris水迷宫实验结果显示,大鼠在术后30d即出现学习记忆能力下降,该变化持续至术后180d,呈进行性改变,与对照组比较差异有统计学意义(P < 0. 05);β-分泌酶活性从低灌注术后10d开始升高（P < 0. 05）,持续至180d（P < 0. 01）,平均活性增高14.25%;γ-分泌酶活性与β-分泌酶活性变化趋势一致,平均活性增高10.6%。结论：慢性脑血流低灌注可导致实验动物学习记忆能力下降,海马组织中β-和γ-分泌酶活性升高,可能导致β-淀粉样蛋白产生增多,在老年痴呆早期发病过程中起着重要作用。     

γ-分泌酶在神经干细胞分化过程中调节作用研究

背景：Notch信号通路在神经干细胞分化过程中起着关键作用,γ分泌酶是Notch信号通路调节的核心环节。 目的：对神经干细胞分化过程中γ分泌酶的活性、酶解产物和活性中心进行检测,为后期深入研究神经干细胞分化过程的调节机制提供一个重要的实验基础。 设计、时间及地点：观察性实验,于2008-10/2009-01在山西医科大学生物化学与分子生物学实验室完成。 材料：质粒Notch1 △E-GVP和MH100（Urban Lendahl教授惠赠）,质粒pRL-CMV（Promega公司）;15胚龄的BALB/c胎鼠。 方法：利用Gal4-VP16/UAS系统和双荧光素酶报告基因系统测定神经干细胞分化过程中γ分泌酶的活性;通过Western blot技术检测γ分泌酶酶解产物NICD的生成量;采用实时荧光定量PCR测定γ分泌酶活性中心—早老素1的表达。 主要观察指标：①双荧光素酶报告基因检测γ分泌酶的活性。②酶解产物NICD的Western blot分析。③荧光定量PCR测定早老素1的特异性表达。 结果：在γ分泌酶抑制剂DAPT作用下,γ分泌酶活性呈剂量依赖性降低,NICD的生成量也同步减少,而其催化中心组份的表达则呈反馈性的同步增高。 结论：通过对神经干细胞分化过程中γ分泌酶的活性、酶解产物和活性中心进行检测,所得结果为继续深入研究神经干细胞分化过程的调节机制奠定了坚实的前期基础。     

β-分泌酶2在散发性阿尔茨海默病发病机制中的作用

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种病因不明的、以认知功能障碍为主要特征的神经系统变性病,通常认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果.AD作为老年期痴呆中最常见的类型,其发病机制并未完全阐明,有遗传易感性、淀粉样β蛋白(β-amyloid,Aβ)毒性、氧化应激、炎症反应等多种学说.但是学者们普遍认为老年斑是AD特征性病理改变之一,它的主要成分是β淀粉样蛋白(Amyloid β protein,Aβ).     

β-分泌酶基因编码区多态性与散发性阿尔茨海默病的关系

目的检测β-分泌酶(BACE1)基因编码区多态性位点与散发性阿尔茨海默病(AD)的相关性,探讨BACE1在AD发病中的作用。方法选择美国国家生物技术信息中心(NCBI)单核苷酸序列多态性数据库(SNPdatabase)中BACE1基因编码区的单核苷酸多态性(SNP)位点,利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测99例散发性AD患者和140例正常人各多态性位点的基因型后,进行病例-对照相关分析。结果在所检的4个多态性位点中,其中3个位点的多态性(rs11216349,rs1061659,rs539765)均未在本研究的标本中检测到,而位于第5外显子的G/C多态性(rs608435),其等位基因的频率在病例组和对照组中分布差别有统计学意义(P=0.039),但基因型频率在两组的分布差别无统计学意义(P=0.095)。结论BACE1编码区上的3个多态性(rs11216349,rs1061659,rs539765)在我国汉人人群中没见到或不存在。外显子5上的G/C多态性(rs608435)的C等位基因可能通过某种途径增加了散发性AD的发病危险性。     

β-分泌酶2多态性位点rs2252576与散发性阿尔茨海默病的相关性分析

目的 研究β-分泌酶2（BACE2） rs2252576位点基因多态性与中国北方汉族人群散发性阿尔茨海默病（SAD）发病的相关性.方法 随机选取10例SAD患者和10名健康对照者进行BACE2外显子区测序.筛查出第5外显子上游10bp存在一多态性位点rs2252576C/T,随后对348例SAD患者和294名健康对照者进行多态性分型及统计学分析.结果 SAD患者和健康对照组的BACE2基因rs2252576多态性位点基因型和等位基因频率差异无统计学意义（P＞0.05）.根据是否携带ApoEε4等位基因进行进一步分层比较后,该位点差异仍无统计学意义（P＞0.05）.应用Logistic回归分析平衡了年龄、性别和ApoE分型的影响后,差异仍无统计学意义（P＞0.05）.结论 中国北方汉族人群中BACE2基因rs2252576 C/T位点的基因多态性与SAD的发病可能无关.     

阿尔茨海默病与淀粉样β分泌酶基因的相关性研究

目的 探讨淀粉样β分泌酶(BACE)基因与阿尔茨海默病(AD)发病风险的关系。方法 采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态方法，在上海121例汉族AD患者和165名正常人中检测BACEl 91 591C／G、BACE2 1158C／T及apoE基因多态的分布。按比值比(OR)做疾病关联分析。结果 (1)BACEl基因91591C／G多态G／G基因型、G等位基因均与AD显著关联[G／G基因型：OR＝2．072，95％可信区间(95％CI)＝1．259—3．412;G等位基因：OR＝1．626，95％CI＝1．155—2．289]；按apoEε4等位基因分层后，仅apEε4阳性者中存在显著相关(G／G基因型：OR＝5．339，95％CI＝1．627—17．523；G等位基因：OR＝2．203，95％CI＝1．149—4．226)。(2)AD患者与正常对照人群间BACE2基因1169C／T多态分布的差异无显著性(X^2＝0．645，v＝2，P＝0724)。结论 上海地区汉族人群中，BACEl基因可能协同apEε4基因，共同参与AD的发病风险。     

RNA干扰调节β分泌酶治疗阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(AD)是一种最为常见的慢性神经系统退行性疾病,AD发病机制中众多的细节问题尚未完全阐明,且无针对病因的有效治疗方法,文中针对AD最新治疗进展作一综述。     

早老素-1对阿尔茨海默病相关蛋白调节的可能途径

阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD)是成人痴呆症中最常见的一种,其中约105为显性遗传的家族性阿尔茨海默病（familial Alzheimer disease,FAD)。自从Sherrington首次报道早老素－1（presenilin-1,PS-1),并随后发现另1条与它高度同源的基因早老素－2（PS－2）以及药50％－80％FAD与它们突变有关以来,老素（PS）已成为AD研究的热点。但迄今为止,PS的功能尚不清楚。越来越多的语气表明,PS－1参与notch、wnt信息传导途径的调节,并藉此在AD发病中起重作用。     

慢性低氧低糖培养影响新生大鼠海马神经元α-分泌酶的实验研究

目的探讨慢性低氧低糖培养对新生大鼠海马神经元α-分泌酶活性及表达的影响。方法取新生24h的Wistar大鼠海马原代培养神经元并予以鉴定,培养第七天予以12h、24h、36h低氧低糖培养干预,MTT法检测海马神经元的活力,荧光法检测α、β-分泌酶活性,Western blot检测α-分泌酶蛋白表达水平。结果低氧低糖培养12小时组海马神经元α-分泌酶活性升高(P<0.01),低氧低糖培养24h、36h组α-分泌酶(TACE)活性无明显变化(P>0.05),低氧低糖培养12h、24h、36h组海马神经元β-分泌酶(BACE1)活性升高(P<0.05);低氧低糖培养12h、24h、36h组海马神经元α-分泌酶蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论慢性低氧低糖培养降低新生大鼠海马神经元α-分泌酶的表达。     

RNAi下调β分泌酶表达治疗阿尔茨海默病的前景展望

β淀粉样蛋白沉积是多种因素导致阿尔茨海默病发病的共同通路。本文介绍了近年来在β淀粉样蛋白及其相关的β分泌酶在阿尔茨海默病发病机制作用研究中所取得的进展,并对利用RNA干扰技术下调β分泌酶表达治疗阿尔茨海默病的进展及前景作一综述,以期为治疗阿尔茨海默病的药物研发提供思路。     

亚低温对颅脑创伤大鼠脑组织中β-分泌酶表达的影响

目的 研究亚低温对大鼠颅脑创伤(TBI)后β-分泌酶(BACE)的影响.方法 应用液压冲击装置制作大鼠颅脑创伤模型,实验分为假手术组、创伤常温组(37℃)和创伤亚低温组(32℃),每组12只大鼠.采用免疫组织化学和免疫荧光法检测BACE表达部位,采用RT - PCR和免疫印迹法研究BACE mRNA和蛋白表达水平.结果 与假手术组比较,创伤常温组大鼠脑组织BACE免疫阳性细胞数明显增多,BACE mRNA和蛋白表达上升(P＜0.05).但是,可以看出BACE在给予亚低温处理后的免疫阳性细胞数量以及蛋白水平显著低于常温处理组(P＜0.05),与假手术组比较差异无统计学意义.结论 亚低温可以通过降低颅脑创伤后BACE表达水平来减轻继发性脑损伤程度,起到神经保护作用.     

慢性低氧低糖培养对大鼠海马神经元α-和β-分泌酶活性的影响

目的 探讨慢性低氧低糖培养对大鼠海马神经元α-和β-分泌酶活性的影响.方法 取新生24h的wistar大鼠海马神经元培养,用慢性低氧低糖进行干预,MTT法检测神经元细胞活力,直接荧光法检测α、β-分泌酶活性.结果 低氧低糖组较对照组细胞活力降低,具有显著性差异（P＜0.05）,低氧低糖培养海马神经元12 h的α-分泌酶活性升高（P＜0.0001）,低氧低糖培养海马神经元12、24、36 h的β-分泌酶活性升高（P=0.0032、0.0018、＜0.0001）.结论 慢性低氧低糖培养对海马神经元具有毒性,可能与其升高β-分泌酶活性使具有神经营养作用的sAPPα降低和具有神经毒性作用的Aβ升高有关.     

EGb761对慢性低氧低糖培养的大鼠海马神经元β分泌酶的影响

目的 研究银杏叶制剂EGb761（金钠多）对慢性低氧低糖培养大鼠海马神经元β分泌酶的影响，探讨其防治痴呆的可能机制。方法 取新生24h的Wistar大鼠海马神经元原代培养，培养第7d行低氧低糖培养和EGb 761（金纳多100ug/ml）药物干预，以荧光法检测β分泌酶活性，Western blot检测β分泌酶BACE1蛋白表达。结果 低氧低糖培养12 h、24 h、36 h组海马神经元较正常培养对照组β分泌酶活性升高（P＜0.05）；金纳多药物干预12 h、24 h、36 h组与相应时间非药物干预组相比海马神经元β分泌酶活性降低（P＜0.05）。低氧低糖培养12 h、24 h、36 h组海马神经元β分泌酶BACE1表达水平升高（P＜0.05）；金纳多药物干预12 h、24 h、36 h组与相应时间非药物干预组相比β分泌酶BACE1表达水平降低（P＜0.05）。结论 金钠多对慢性低氧低糖培养海马神经元β分泌酶活性和表达的影响是其防治痴呆的可能机制之一。     

17β-雌二醇对解聚素金属蛋白酶9表达水平的影响

目的 研究17β-雌二醇对解聚素金属蛋白酶9(ADAM9)表达水平的影响. 方法 应用盐析法提取人类基因组DNA,扩增ADAM9基因启动子目的片断,构建表达ADA M9启动子的报告基因质粒.应用脂质体转染法,分别转染入人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH、人胚肾细胞HEK293和宫颈癌细胞HeLa内.17β-雌二醇处理各组细胞后,检测ADAM9启动子转录效率.结果 成功扩增了ADAM9启动子区1676 bp目的片段,构建了ADAM9启动子报告基因质粒pGL-ADAM9,瞬时转染入细胞内.17β-雌二醇处理SK-N-SH细胞后,ADAM9启动子转录活性上升至31.250±1.328,较处理前的15.471±1.256增加约2倍,差异有统计学意义(P＜0.05).HEK293细胞内,ADAM9启动子转录活性上升至13.499±0.866,较处理前的8.513±1.356增加约1.6倍,差异有统计学意义(P＜0.05).HeLa细胞中没有观察到17β-雌二醇对ADAM9启动子转录活性的影响. 结论 17β-雌二醇能上调人ADAM9启动子的表达水平,是ADAM9基因表达的激活剂.     

α-分泌酶与阿尔茨海默病的治疗

淀粉样前体蛋白(APP)在脑内经β和γ分泌酶的作用生成β淀粉样蛋白(Aβ),也可在α和γ分泌酶的作用下从Aβ序列内部进行降解,生成sAPPα而避免Aβ的生成,sAPPα可对神经细胞产生神经营养和神经保护作用。Aβ在脑内沉积从而对细胞造成毒性作用即Aβ毒性学说被认为是阿尔茨海默病(AD)发病机制之一。目前AD的治疗策略主要集中于抑制β分泌酶和γ分泌酶的研究。新近的研究显示,一类属于解聚素和金属蛋白酶(主要指ADAM10、ADAM17和ADAM9)分子具有α分泌酶的功能,提高α分泌酶的表达可以降低Aβ,有可能在AD的治疗中具有潜在作用。     

早老素-1V97L基因突变对家族性Alzheimer病SH-SY5Y细胞Aβ42产生的影响

目的 探讨早老素-1(presenilin-1,PS-1)Val97Leu位点突变对家族性Alzheimer病SH-SY5Y细胞Aβ42产生的影响.方法采用一步法定点突变技术,由含有野生型(wild type,wt)PS-1的pcDNA3.1/Zeo(+)质粒合成携带有突变位点Val97Leu的突变型(mutation type,mt)PS-1质粒并转染至神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞中,筛选出稳定表达的细胞系.用ELISA法和放射免疫法来检测培养基及胞浆中Aβ42和总Aβ含量;同时检测APP及BACE表达水平的变化.结果48小时,转染突变PS-1基因的细胞,细胞内和细胞外Aβ42的含量较24小时有显著提高,且相对未转染、wt和mock转染的细胞也有显著提高,而各组间总Aβ的含量变化无明显差异.APP及BACE的表达水平各组间也无明显差异.结论 此中国人阿尔茨海默病家系中发现的PS-1基因Val97Leu突变为一新的突变位点,可选择性引起细胞内外Aβ42的增高,因此认为是一病理性突变.     

小檗碱通过抑制β分泌酶的表达抑制Aβ产生的机理

目的 探讨小檗碱抑制Aβ产生的机理.方法 稳定转染人淀粉样前体蛋白瑞典突变695的人胚胎肾293细胞(HEK293APPsw695)分别给与小檗碱(1μM,5μM,10μM和20μM)48 h、5μM小檗碱(8 h,24 h,48 h和72 h)、U0126(0.5μM)48 h以及小檗碱(5 μM)+U0126(0.5μM)48 h,然后分别通过噻唑蓝(MTT)技术和测定培养基中乳酸脱氢酶的活性研究以上各处理对HEK293APPsw695增殖和毒性的影响,通过ELISA方法检测各处理组对HEK293APPsw695产生Aβ40/42的影响.通过WB方法研究各处理组对β分泌酶和p-ERK1/2表达的影响.结果 以上各处理对HEK293APPsw695细胞的增殖和毒性没有影响,小檗碱以时间和浓度依赖的方式显著抑制Aβ40/42的产生和β分泌酶的表达.以及促进p-ERK1/2的表达,U0126完全逆转小檗碱对Aβ40/42产生和β分泌酶表达的抑制,以及对p-ERK1/2表达的促进.结论 小檗碱可能通过活化ERK1/2通路抑制β分泌酶的表达而抑制Aβ40/42的产生.