靶向Survivin的小分子干扰RNA对骨肉瘤细胞的体内外抑制作用

目的 观察靶向Survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体对人骨肉瘤细胞MG-63的体内外抑制作用.方法 体外构建Survivin siRNA表达载体pSilence2.1-neo-Survivin,转染骨肉瘤细胞株MG-63、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学(SP)法检测转染前后Survivin mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡,建立裸鼠移植瘤模型,记录瘤体形成时间及肿瘤生长.结果 转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降,转染后mRAN表达抑制率为85.08%,增殖指数为空白组的28.20%;细胞周期分析显示:shRNA组G0/G1期细胞明显增多,而G2/M期、S期细胞数目减少;吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变,转染组凋亡率为24.54%;稳定转染组细胞裸鼠体内致瘤能力降低,转染组成瘤时间为(13.2±2.0)d,空白组为(6.5±1.6)d,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).4周时同空白组相比转染组瘤体体积小62.89%(P＜0.01),重量轻59.07%(P＜0.01).结论 靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖,促进细胞凋亡;明显抑制人骨肉瘤细胞的致瘤活性及裸鼠移植瘤的生长.     

NF-kB抑制剂PDTC对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及Livin和Caspase-9表达的影响

[目的]观察NF-kB抑制剂PDTC对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及Livin和Caspase-9表达的影响.[方法]体外培养人骨肉瘤MG -63细胞系,用50,100,200和400 RmoV L的PDTC作用于骨肉瘤MG-63细胞24,48,72 h后,用MTT法测各组骨肉瘤MG-63细胞存活率,用流式细胞仪测细胞的凋亡率.用Western Blot方法检测不同浓度PDTC作用于骨肉瘤MG-63细胞24 h后,各组细胞的Livin和Caspase-9蛋白的表达水平.[结果]随PDTC浓度增加,骨肉瘤MG-63细胞后其增殖活性呈下降趋势,作用时间越长细胞的增殖活性越低,而细胞的凋亡率呈上升趋势(P<0.05).随PDTC浓度增加各组细胞中Livin蛋白的表达呈下降趋势,而Caspase9蛋白表达呈上升趋势(P<0.05).[结论]PDTC可诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡,其机制可能与PDTC抑制NF-kB传导通路,下调Livin表达继而上调Caspase-9表达有关.     

腺相关病毒载体介导p27Kip1基因转染骨肉瘤MG-63细胞的研究

目的 观察p27Kip1基因转染后对骨肉瘤MG-63细胞增殖和生存能力的影响.方法 重组质粒在内的三质粒共转染包装、收集腺相关病毒颗粒,检测病毒滴度并感染MG-63细胞,细胞免疫组织化学检测p27Kip1基因的表达,并行细胞增殖实验、细胞周期分析,探讨p27Kip1基因对骨肉瘤MG-63细胞的体外作用.结果 三质粒成功共转染293细胞,X-gal染色观察转染率为60%;采用CPE法(微量全细胞病变法)检测病毒滴度1.6×108 PFU/ml;细胞免疫细胞化学鉴定p27Kip1基因高表达;细胞生长曲线显示转染组细胞增殖明显减慢;流式细胞仪观察转染AAV-p27Kip1组细胞周期见S、G2期细胞比例明显降低,G0/G1期细胞比例增高.结论 p27Kip1基因重组腺相关病毒感染骨肉瘤MG-63细胞后能高表达目的 基因,并阻滞细胞于G1/S期,从而显著抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对人骨肉瘤细胞抑制增殖和诱导分化的研究

[目的]观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和分化的影响.[方法]不同浓度的TSA作用MG-63细胞,采用噻唑蓝(MTT)法、倒置相差显微镜观察药物对细胞生长的影响并绘制细胞生长曲线;软琼脂集落形成实验观察细胞生长和侵袭能力的变化;流式细胞仪测定细胞周期变化.[结果]TSA可明显抑制MG-63细胞增殖,并呈现剂量和时间的依赖性;细胞形态呈明显的良性分化;瘤细胞的软琼脂集落形成率明显降低;TSA能够延缓细胞周期G1-S进程,阻滞细胞于G1期,停留在G2/M期.[结论]TSA对MG-63细胞有明显的抑制增殖和诱导分化作用.     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导骨肉瘤细胞凋亡及其对p27Kip1蛋白表达的影响

目的探讨蛋白酶体抑制剂Z-LLL-CHO(MG132)对人骨肉瘤MG-63细胞诱导凋亡的作用及其对p27Kip1蛋白表达的影响。方法分别以不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG132培养p53突变型人骨肉瘤MG-63细胞、正常二倍体成纤维细胞WI-38和p53野生型人骨肉瘤U2OS细胞。通过MTT法检测不同培养时间的细胞增殖活力、琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡、流式细胞仪定量检测不同时间的细胞凋亡发生率、Westernblot检测p27Kip1表达情况。结果MG132能选择性抑制人骨肉瘤MG-63和U2OS细胞生长,IC50分别为(0.92±0.06)μmol/L及(0.33±0.05)μmol/L,均低于二倍体成纤维WI-38细胞(9.13±0.12)μmol/L。1μmol/LMG132处理MG-63细胞24h后,DNA琼脂糖凝胶电泳可检测到典型的“阶梯状”DNA条带,而WI-38细胞则为基因组DNA。流式细胞仪于1μmol/LMG132作用12h后检测到明显的亚G1峰(凋亡细胞峰),且存在时效关系。Westernblot发现,处理后p27Kip1蛋白表达明显上调。结论蛋白酶体抑制剂MG132在体外可选择性诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡。p27Kip1蛋白在诱导MG-63细胞凋亡中可能起重要作用。     

NS-398对骨肉瘤细胞的作用及其对Survivin表达的影响

目的：观察选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398对人骨肉瘤细胞系MG-63的凋亡的影响及其对survivin基因表达的影响。方法：体外培养骨肉瘤细胞系MG-63，应用MTT法研究不同浓度NS-398对骨肉瘤细胞系MG-63的凋亡诱导作用，流式细胞仪检测细胞周期的改变及凋亡率的变化，RT-PCR法分析NS-398对骨肉瘤细胞系MG-63中survivin基因表达的影响。结果：NS-398可诱导骨肉瘤细胞系MG-63发生凋亡，并具有剂量依赖性，在NS-398浓度为200μmol／L时，对细胞生长有明显的抑制作用。流式细胞仪检测显示NS-398引起MG-63细胞凋亡率增加。RT-PCR分析显示经NS-398作用后的骨肉瘤细胞系MG-63表达survivin较用药前明显下降。结论：NS-398对骨肉瘤细胞系MG-63有杀伤作用，其作用可能通过抑制survivin的表达，促进肿瘤细胞的凋亡而实现。     

藤黄酸联合顺铂对人骨肉瘤细胞作用的实验研究

[目的]本实验主要研究藤黄酸(gambogic acid,GA)在骨肉瘤中的抗肿瘤作用,检验藤黄酸与传统的骨肉瘤化疗药物顺铂(cisplatin,CDDP)联用是否具有协同作用,探讨其作用的机制。[方法]采用CCK-8法测定不同浓度藤黄酸、顺铂单用及联合应用对人骨肉瘤细胞MG-63的增殖抑制作用,PI染色流式细胞术检测细胞周期变化,Annexin V-FITC/PI双染色检测细胞凋亡变化。[结果]藤黄酸对MG-63具有明显生长抑制作用,且具有浓度依赖性,IC 25为0.52μg/ml,藤黄酸诱导MG-63细胞产生G2/M期细胞周期阻滞和凋亡,而顺铂则诱导产生G0/G1期细胞周期阻滞和凋亡。藤黄酸与顺铂联用时增殖抑制及诱导凋亡作用比单用时明显增强。[结论]藤黄酸通过诱导MG-63细胞周期阻滞和凋亡产生抗人骨肉瘤细胞增殖作用,藤黄酸与顺铂联用具有协同作用。     

Notch1 siRNA对乏氧环境骨肉瘤细胞MG-63增殖及周期的影响

[目的]探讨Notch1 siRNA对乏氧环境人骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖和周期的影响。[方法]将骨肉瘤细胞株MG-63细胞置于乏氧(37℃、1%O2、5%CO2)环境下培养作为实验组,以正常氧环境(37℃、21%O2、5%CO2)下培养作为对照组,培养72 h,应用MTT方法检测不同时间乏氧培养对MG-63细胞增殖的影响;采用Notch siRNA转染乏氧环境中的MG-63细胞,MTT方法检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞周期的变化;Western blot检测细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达变化。[结果]乏氧培养可促进MG-63细胞增殖,48 h常氧及乏氧对细胞增殖的作用可见明显差异(2.164±0.075 vs 1.421±0.086)(P<0.01)。流式细胞分析显示实验组、对照组MG-63细胞培养48 h G1/G2期细胞比例分别为(41.79±3.25)%和(53.87±2.31)%(P<0.05),乏氧可以促进细胞周期进展,Notch1 siRNA有效下调乏氧MG-63细胞Notch1蛋白表达,Notchl siRNA作用48 h后乏氧环境MG-63细胞周期阻滞于G1/G2期。Western-blot结果显示乏氧环境下MG-63细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达增高。[结论]乏氧环境能通过促进MG-63细胞周期进展,从而明显促进细胞增殖,阻断Notch可逆转乏氧对MG-63细胞促增殖作用,提示Notchl是治疗骨肉瘤的有效分子靶点。     

硫化砷对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响

目的 研究硫化砷对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响，并探讨其可能的机制。方法 应用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞生长抑制率、倒置显微镜观察细胞形态、AnnexinV法检测细胞凋亡、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测bcl-2及bax基因的表达，观察硫化砷对骨肉瘤细胞株MG-63诱导凋亡的作用。结果 硫化砷可明显抑制MG-63细胞的增殖，1．0mg／L浓度的硫化砷作用24h后，MG-63细胞的抑制率可达26．43％。倒置显微镜观察被硫化砷抑制的MG-63细胞呈典型的凋亡改变．流式细胞仪检测凋亡率与硫化砷处理时间、处理浓度呈正相关。在硫化砷的作用下，MG-63细胞的bcl-2表达下调，而bax表达无明显改变．结论 硫化砷可有效地诱导骨肉瘤细胞凋亡，bcl-2表达下调是诱导细胞凋亡的重要机制。     

Survivin基因干扰RNA对骨肉瘤MG-63细胞系增殖和凋亡的影响

[目的]观察Survivin基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法]体外构建Survivin shRNA表达载体pSilence2．1-neo-Survivin，转染骨肉瘤细胞系MG-63，筛选稳定表达的克隆，倒置显微镜观察各组细胞形态学变化，RT-PCR、Weston-blot方法检测转染后Survivin mRNA及蛋白的表达，噻唑蓝（MTT）法、克隆形成实验检测细胞的增殖情况，吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡情况。[结果]转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降，其抑制率分别为85．08％和81．14％；细胞增殖受到显著抑制，培养48h后与空白组比较，抑制率达63．4l％；吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变，转染组凋亡率为24．54％。[结论]靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。     

腺病毒介导反义c-myc增强骨肉瘤细胞对顺铂化疗敏感性的实验研究

目的构建表达反义cmyc的重组腺病毒,探讨重组腺病毒介导反义cmyc转染的人骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性的影响。方法应用基因重组技术,将约720bp的人cmyccDNA反向克隆到腺病毒载体,经重组、扩增、病毒包装后构建表达反义cmyc的重组腺病毒(AdAscmyc),并在体外转染骨肉瘤MG63细胞,采用瑞士染色、吖啶橙染色、蛋白免疫印迹(WesternBlot)、细胞体外增殖抑制试验(MTT)、流式细胞仪(FCM)等观察细胞形态、检测cmyc蛋白表达、瘤细胞体外增殖抑制、凋亡及细胞周期,分析AdAscmyc体外转染的骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性。结果成功构建AdAscmyc,滴度可达2×109pfu/ml,体外转染MG63细胞48h后,可降低cmyc蛋白表达,并与浓度为2.0、5.0μg/ml的顺铂作用2h后,可抑制MG63细胞的体外增殖,抑制率分为33.4%、54.2%,与对照腺病毒(AdLacZ)转染组相比差异有统计学意义(P<0.05),FCM检测证实AdAscmyc的转染可诱导骨肉瘤细胞凋亡,且顺铂治疗后凋亡比例增加,细胞周期分析显示AdAscmyc转染的骨肉瘤细胞出现G2/M期阻滞。结论腺病毒介导反义cmyc能诱导骨肉瘤MG63细胞凋亡并增加MG63细胞对顺铂化疗敏感性。     

survivin基因反义寡核苷酸对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡与细胞周期的调控作用

目的研究survivin基因反义寡核苷酸转染对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期、细胞凋亡的作用及其可能的作用机制。方法采用脂质体介导survivin基因反义寡核苷酸转染人肝癌SMMC-7721细胞,透射电镜观察细胞超微结构,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,RT-PCR方法检测cyclin B1 mRNA的表达。结果survivin反义寡核苷酸转染后细胞内cyclin B1表达由0.36±0.03增加至0.91±0.03,同时G2-M期细胞及凋亡细胞比例分别由5.81%及0.7%明显增加至42.11%及31.35%,同时细胞超微结构呈典型凋亡样改变。结论survivin基因反义寡核苷酸转染细胞后可以通过诱导cyclinB1的表达,导致G2-M期阻滞,从而诱导细胞凋亡的发生。survivin基因反义寡核苷酸转染可以作为治疗肝癌的重要新方法。     

人可溶性TRAIL蛋白诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的 初步观察并探讨人重组可溶性TRAIL蛋白诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的作用，并通过实验初步探讨TRAIL对肿瘤细胞的选择性杀伤作用。方法 MTT法测定TRAIL对MG-63细胞、MRC-5人肺二倍体细胞及L-02人肝细胞的抑制率；电镜观察与FACS分析TRAIL蛋白诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的作用；用RT-PCR检测TRAIL受体在MG-63骨肉瘤细胞、MRC-5人肺二倍体细胞及L-02人肝细胞上的表达，并初步分析TRAIL诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的机制。结果 MTT还原试验表明：作用24h后500ng/ml TRAIL的抑制率为10.1％，1μg/ml TRAIL的抑制率为24.3％，2μg/ml TRAIL的抑制率为50.6％，5μg／ml TRAIL的抑制率为95％以上，其半数抑制浓度为2μg/ml。而TRAIL对MRC-5人肺二倍体细胞株及L-02人肝细胞株无明显作用。细胞形态学观察显示：MG-63骨肉瘤细胞经TRAIL作用3～8h后即有部分细胞开始变小、变圆，24h后大量细胞变圆、脱落，漂浮于培养液中。透射电镜可观察到核固缩，染色质浓聚于核膜形成新月状小体。流式细胞仪检测显示2μg／ml的TRAIL处理MG-63骨肉瘤细胞6h，即可在二倍体峰前出现较明显的凋亡峰。结论 人可溶性TRAIL蛋白可以迅速地选择性杀伤MG-63骨肉瘤细胞，具有潜在的临床应用价值。     

塞来昔布协同顺铂P13K/Akt途径诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡的实验研究

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响及作用机制.方法 塞来昔布(50 μmol/L或100 μmol/L)和(或)顺铂(10 μg/ml)作用骨肉瘤MG-63细胞48 h后,MTT法测定细胞增殖的抑制率,电子显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测基因水平COX-2表达变化,Western blot检测COX-2及凋亡相关蛋白表达变化.P13K抑制剂Wortmannin作用MG-63细胞48 h,检测蛋白表达变化.结果 塞来昔布导致MG-63细胞阻滞在G1期,通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9的内源性凋亡途径诱导细胞凋亡;顺铂单药作用后骨肉瘤MG-63细胞凋亡率为5.93%,而联合应用塞来昔布50μmol/L或100 μmol/L后,凋亡率分别为6.66%和37.15%,与顺铂联合具有明显的协同作用;COX-2蛋白表达未降低.塞来昔布联合顺铂明显降低P13K/Akt、survivin、Bcl-2的表达,检测到caspase-9、caspase-3的激活和PARP裂解片段.Wortmannin作用MG-63细胞48 h,检测到pAkt(Thr308)、Bcl-2、survivin表达下调.结论 塞来昔布可通过非COX-2途径诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡,与P13K/Akt、survivin、Bcl-2蛋白相关,并且PI3K/Akt途径在survivin、Bcl-2表达调控中发挥重要作用.这可能是塞来昔布药物干预的中心环节.     

人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用

[目的]探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用及其具体作用机制。[方法]MG-63细胞分为空白对照组和CK药物处理组。采用MTT法检测细胞活性及增殖能力,倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验检测药物CK对细胞的诱导凋亡作用;Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2及BAX的表达,研究其具体凋亡机制。[结果]CK能够显著降低MG-63的体外活性及生存率(P<0.05);细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验证明CK可诱导MG-63凋亡(P<0.05);CK处理后MG-63细胞表达的Caspase-9及BAX表达上调,相反Bcl-2表达下调(P<0.05)。[结论]人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63具有凋亡诱导作用,而以Caspase-9为关键因素的线粒体凋亡途径在此凋亡中起着决定性作用。     

骨肉瘤诱导分化与多药耐药表型的生物学性状比较

[目的]探讨诱导分化剂诱导骨肉瘤分化时同骨肉瘤耐药状态产生的分化情况的异同点,以便正确认识分化与耐药相关性。[方法]以诱导分化剂ATRA,IL-4处理人成骨肉瘤细胞系,对比MG-63耐药表型MG-63/R,观察瘤细胞生物学性状。用原位杂交分析在这一转化过程上凋亡调控基因P53,bcl-2 mRNA表达,用Tunel法分析细胞的凋亡。MTT法检查细胞对药物敏感性。[结果]MG-63/R,以及IL-4,ATRA处理的MG-63,细胞均出现分化,AT-RA处理的MG-63表现多药耐药性,并同MG-63/R表现出了相似的特性而IL-4处理的细胞分化的同时并未出现耐药。[结论]肿瘤细胞分化的过程中有可能出现一种顽固的多药耐药的亚分化状态,这种差异性分化的产生可能同细胞种类、状态、药物作用特点及剂量有关,如何控制细胞向耐药状态的分化为肿瘤的治疗提出了新的难题。     

反义表达人组织蛋白酶L对骨肉瘤细胞侵袭特性的影响

目的: 构建人组织蛋白酶L (cathepsinL, CATL) 基因的正、反义真核表达载体, 观察其转染后对人骨肉瘤细胞MG-63侵袭特性的影响。方法: 用基因重组技术构建人组织蛋白酶L正、反义真核表达载体, 转染人骨肉瘤细胞MG-63, RT-PCR和Westernblot检测CATL的mRNA和蛋白质的表达水平, 并对转染前后骨肉瘤细胞的侵袭能力进行检测。结果: 正、反义真核表达载体成功构建并转染入MG-63细胞中。反义载体转染后的细胞CATL的mRNA和蛋白质的表达水平下降, 体外侵袭实验表明细胞的侵袭力下降。结论: 反义CATL基因的转染使骨肉瘤细胞CATL的分泌水平下降, 细胞的体外侵袭力下降。     

鹰嘴豆芽素A诱导人成骨肉瘤MG63细胞凋亡作用研究

[目的]探讨植物雌激素(phytoestrogen)鹰嘴豆芽素A (biochanin-A, BA)诱导人成骨肉瘤MG-63细胞凋亡及其调控丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-altivated protein kinase, MAPK)/凋亡信号通路的作用机制。[方法]用不同浓度的鹰嘴豆芽素A处理MG-63细胞,以MTT法检测细胞活性的抑制情况;以DAPI染色法和Annexin-V/PI流式细胞仪检测细胞的凋亡情况;应用Western blot法检测MG-63细胞中MAPK信号通路相关蛋白磷酸化和主要凋亡通路Bcl-2家族和caspase家族相关蛋白的表达情况。[结果] BA有效抑制MG-63细胞的细胞活性,并呈时间和剂量依赖效应,且可以诱导细胞凋亡。40μmol/L和80μmol/L的BA作用于MG-63细胞48 h,细胞凋亡率分别为(45.28±3.79)%和(82.51±5.23)%,高于正常组(5.31±3.14)%(P0.05)。Western blot结果显示,BA可促进caspase-9、caspase-3和PARP发生剪切(P0.05),并促进p-p38、p-JNK、Bax的表达(P0.05),抑制Bcl-2的表达(P0.05),并呈剂量依赖效应。[结论]鹰嘴豆芽素A可有效抑制人成骨肉瘤MG-63细胞的细胞活性,促进细胞凋亡,作用机制可能是通过激活MAPK/凋亡信号通路来实现。     

反义转化生长因子β1表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞增殖活性的影响

目的:构建反义TGFβ1基因,探讨阻断肿瘤细胞TGFβ1自分泌环对细胞增殖活性的影响.方法:采用RT-PCR获取人TGFβ1 cDNA后,构建反义TGFβ1表达载体pcDNA3-TGFβ1(-).将pcDNA3-TGFβ1(-)转染骨肉瘤细胞MG-63,采用流式细胞仪检测阻断TGFβ1自分泌环对肿瘤细胞增殖活性的影响.结果:pcDNA3-TGFβ1(-)转染骨肉瘤细胞后,反义基因转染细胞MG-TGFβ1(-)的G0/G1期细胞从56.2%和60.1%增至71.6%,S期细胞从19.1%和17.8%降至12.9%,细胞增殖活性明显降低.结论:通过阻断TGFβ1自分泌环以降低骨肉瘤细胞表达的TGFβ1,可以明显抑制肿瘤细胞增殖活性.进一步的深入研究,必将为骨肉瘤疗效的提高开辟新的研究方向.