诱导hBMSCs成骨分化中微小RNA和靶基因表达水平的变化

目的明确萎缩性骨不连组织中表达上调的数种微小RNA(micro RNA,miRNA)与其相应靶基因mRNA、蛋白在hBMSCs成骨分化过程中的表达变化趋势和生物学功能。方法取自体髂骨植骨手术患者的髂骨骨髓血,采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs。取第4代hBMSCs以成骨诱导培养液诱导成骨分化,分别提取0、12 h,1、2、4、7、14 d时的细胞总RNA和蛋白,进行miRNA的实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、相应靶基因mRNA的qRT-PCR和蛋白Western blot检测。结果诱导hBMSCs成骨分化时,成骨性靶基因碱性磷酸酶(alkalinephosphatase liver/bone/kidney,ALPL)、PDGF-α多肽(PDGF-αpolypeptide,PDGF-A)和BMP-2的mRNA和蛋白表达在多数时间点同对照(0 h)相比增加(BMP-2在12 h和1 d时下降),1～7 d变化最为显著。不同时间点的miRNA、靶基因mRNA和蛋白表达水平存在差异,其中hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p miRNA含量的变化趋势与各自靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白表达水平总体上成负相关(P<0.05),hsa-miRNA-221与其靶基因PDGF-A的变化趋势无明显负相关关系(P>0.05)。结论诱导hBMSCs成骨分化过程中,hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p对其相应靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白存在密切调控关系。     

瘦素对hBMSCs成骨分化的作用及机制研究

目的 探讨瘦素(leptin,LEP)对hBMSCs成骨分化的作用及机制. 方法 采用全骨髓法培养hBMSCs,取第3代hBMSCs分为A、B、C、D、E、F组,待细胞贴壁后各组分别加入400、200、100、50 ng/mL LEP、100 ng/mL BMP和普通培养基2 mL进行培养.于培养后7 d行ALP染色、21 d行矿化结节染色,倒置相差显微镜观察染色结果 ;并于培养后7、14、21 d,检测各组ALP活性、骨钙素(osteocalcin,OCN)水平,筛选LEP的最佳诱导浓度;B、E、F组细胞培养7 d后,采用RT-PCR检测成骨相关基因:核心结合因子(core-binding factor α1,Cbfα1)、ALP、Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导培养7 d,ALP染色结果 显示,A、B、C、D、E组细胞胞浆均呈蓝色阳性着色,F组呈弱阳性;诱导培养21 d,矿化结节染色结果 显示,A、B、C、D、E组细胞染色呈阳性,F组呈阴性.B组培养后7、14、21 d,ALP、OCN活性低于E组,但显著高于其余各组,差异均有统计学意义(P<0.05),200 ng/mL LEP为最佳浓度.B、E、F组细胞培养7d,F组Cbfα1、ALP、Col Ⅰ、OCNmRNA均不表达;B、E组各产物mRNA均有表达,但B组低于E组. 结论 LEP可促进hBMSCs成骨分化,其机制可能为LEP促进了成骨相关基因的表达.     

成纤维细胞成骨潜能的体外培养研究

本研究采用新西兰种家兔皮肤的成纤维细胞进行体外培养，通过活体相关显微缩时录像，体视显微镜摄影，ＨＥ染色以及组织化学染色等技术做系列观察。发现成纤维细胞在体外培养条件下，不仅能产生粘多糖，胶原等基质成分，而且还能提供钙盐沉积。培养中期，成纤维细胞培养液显示Ａ１Ｐ阳性反应；培养后期，培养液与成纤维细胞都可显示Ａ１Ｐ阳性反应。     

体外诱导成纤维细胞成骨活性表达的研究

目的探讨成纤维细胞(fibroblast,FB)体外成骨表达的诱导因素,为其能否成为骨组织工程的种子细胞提供理论依据.方法分离和纯化新西兰兔肉芽组织FB,按1×105/ml分别接种于含纤维结合蛋白(fibronectin,FN)10、20、40、60、80μg/ml条件培养液中(实验1～5组),对照组为不含FN的无血清培养液.于培养14 d后,行细胞组织学观察及钙化结节形成率、趋骨性四环素荧光标记、3H-TdR标记、骨钙素测定及3H脯氨酸标记,检测FB成骨表型表达的标志.结果组织学观察实验组发现FB由梭形逐渐趋向多突形和圆形,细胞核偏向一侧,细胞重叠成多层结构;其表面有钙盐堆积,逐渐呈云雾状物质,经不断融合和扩大形成不透光的结节.干预培养14 d钙化结节形成率:对照组15.35%±3.45%,实验1～5组分别为53.73%±9.49%、75.21%±9.80%、98.34%±15.20%、61.83%±10.04%、45.11%±8.70%,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);实验3组与其它各实验组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).趋骨性四环素特异性标记为新生骨组织;FB增殖活性,实验3、4、5组7 d时,实验2、3、4组14 d时与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).实验1～5组FB分泌骨钙素,实验2～5组3H-脯氨酸掺入量高于对照组,7、14d时与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论适量的FN可以促进FB增殖、胶原蛋白的合成及骨钙素分泌,FN可以诱导FB成骨表达,适宜浓度为40～60μg/ml.     

皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用

本实验采用新西兰家兔背部中厚皮片，通过组织培养获得成纤维细胞。成纤维细胞经传代培养８天时，发现标本中有不透光的骨小结节形成。培养３７天时，发现一些小结节扩大、延伸，形成骨小梁样结构；也有骨小片状结构形成。经四环素活体标记后，这些结节在蓝紫光荧光显微镜下显示金黄色荧光，表明它们是新生骨组织。该结构的钙盐染色、胶原染色也都呈阳性，充分反映骨结构中的钙及胶原成分，以及皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用     

自身骨泥成骨活性的实验研究

目的：观察长管状骨钻孔产生的骨泥的成骨活性。方法：选健康家兔２２只,桡骨中段连续钻孔采集骨泥,植入兔股四头肌。２周取５只兔做ＥＣＴ检查,１、２、３周分别做组织学检查、Ｅｌｉｖｉｓｉｏｎ二步法免疫组化染色及碱性磷酸酶测定。结果：自身骨泥具有良好的异位诱导成骨活性。植入区放射性浓聚程度明显高于对侧正常组织（Ｐ＜００５）。植入１周软骨生成,３周网织骨形成。组织碱性磷酸酶活性明显高于正常肌肉（Ｐ＜００１）,免疫组化发现细胞及组织ＢＭＰ强阳性。结论：长管状骨钻孔产生的自身骨泥具有诱导成骨作用,可做为需少量植骨的植骨材料。     

辛伐他汀对人牙髓干细胞成骨活性的影响

目的：研究辛伐他汀对人牙髓干细胞成骨活性的影响.方法：将体外分离培养的人牙髓干细胞分别接种于含有不同浓度辛伐他汀的矿化培养液中诱导培养,测定碱性磷酸酶活性及骨唾液酸蛋白基因的表达情况.结果：与对照组比较,适宜浓度辛伐他汀（1×10^-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L）促进人牙髓干细胞的成骨活性作用更为明显,差异具有统计学意义（P＜0.05）,当辛伐他汀浓度为1×10-7mol/L时,促进作用最显著.结论：适宜浓度的辛伐他汀可以有效促进人牙髓干细胞的成骨活性.     

锶对磷酸镁骨水泥理化性质及成骨活性影响的研究

目的 探讨锶(Sr)对磷酸镁骨水泥(magnesium phosphate cement,MPC)的理化性质及成骨活性的影响及体外动物实验模型大面积骨缺损的修复作用.方法 将不同质量百分数的Sr添加到由重烧氧化镁和磷酸二氢钾组成的MPC中,制备一种新型的锶/磷酸镁复合骨水泥(Sr-MPC).分别对Sr-MPC凝固时间、...     

体外负压培养对骨髓间充质干细胞成骨活性的影响

目的：探讨体外负压培养对骨髓间充质干细胞（bone marrow derived stroma cells,BMSCs）成骨活性的影响。方法：取第3代BMSCs分为实验组和对照组,实验组进行间歇性负压培养,设置压力为17kPa,每次30min,每日4次,干预2周;对照组于普通CO2培养箱中常规培养。倒置显微镜下观察细胞形态,检测ALP活性,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原的表达,RT-PCR检测2周后以及终止负压后1、2、3d骨保护素（osteoprotegerin,OPG）mRNA和骨保护素配体（osteoprotegerin ligand,OPGL）mRNA表达水平。结果：诱导2周后,BMSCs呈现出显著的成骨细胞特性,与对照组比较,ALP活性显著增加,Ⅰ型胶原表达阳性,实验组细胞OPG mRNA表达水平显著提高,OPGL mRNA表达水平显著降低,且差异均有统计学意义（P〈0.05）。负压终止后3d,两组细胞OPG mRNA和OPGL mRNA表达水平差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：体外负压培养可以提高BMSCs成骨活性。     

成骨诱导的兔骨髓基质干细胞成骨活性的表达及维持

目的观察成骨诱导的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)体内、外环境下成骨活性的表达及维持。方法观察BMSCs在体外成骨诱导培养条件下的成骨分化特性;构建兔BMSCs与活骨组织共培养模型模拟体内“成骨环境”,将成骨诱导的MSCs置于共培养及普通传代培养条件下进行传代培养,观察经成骨诱导的BMSCs在体外及模拟体内的培养条件下细胞的表型维持情况。结果药物成骨诱导培养的BMSCs,其ALP活性及骨钙素均显著高于普通培养组(P<0.05);经过诱导培养的BMSCs,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性。RT-PCR法半定量测定Ⅰ型胶原mRNA,成骨诱导培养的Ⅰ型胶原mRNA表达量明显高于普通传代培养对照组。药物成骨诱导后的细胞在体外普通传代培养传5代后,细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素水平及Ⅰ型胶原表达稳定维持在较高水平,保持其成骨细胞的表型;在共培养条件下,ALP活性、骨钙素水平Ⅰ型胶原表达保持在高水平,且ALP活性、骨钙素水平在大部分时间点均高于普通传代培养。结论药物成骨诱导培养呈现促BMSCs向成骨方向转化的特点,能使ALP、骨钙素及Ⅰ型胶原表达短期内达到高水平;经成骨诱导的BMSCs在体外或模拟的体内传代培养条件下,均能维持成骨表型,保持成骨活力。     

体外负压培养对人BMSCs BMP -2、VEGF mRNA表达水平的影响

[目的]探讨体外负压培养对人骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived stroma cells,BMSCs)骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA表达水平的影响。[方法]取第3代BMSCs分为实验组和对照组,实验组进行间歇性负压培养,设置压力为17 kPa,30 min/次,4次/d,干预2周;对照组于普通CO2培养箱中常规培养。免疫组织化学染色检测BMP-2、VEGF的表达水平,RT-PCR检测2周后以及终止负压后1、2、3 d BMP-2、VEGF mRNA表达水平。[结果]诱导2周后,BMSCs呈现出显著的成骨细胞特性,与对照组比较,实验组细胞BMP-2、VEGF mRNA表达水平显著提高,且差异均有统计学意义(P<0.05),负压终止后3 d,两组细胞BMP-2 mRNA表达水平无明显差异(P>0.05),VEGF mRNA却在负压培养终止后的3 d内与对照组比较仍有显著差异(P<0.05)。[结论]体外负压培养可以提高BMSC...     

成人间充质干细胞体外成骨的初步研究

目的 建立一种分离和培养成人骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的方法,观察成人MSCs体外成骨潜能。方法 用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,并在含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养。通过传代培养扩增MSCs。为促进成人MSCs体外成骨性分化,第5传代培养时加入成骨性添加剂,培养第4、12天分别用流式细胞仪分析成人MSCs表面分子的表达,并用碱性磷酸酶组化染色和Von Kossa染色。结果 成人MSCs是骨髓黏附细胞中有相应细胞表面蛋白表达和形态均的一细胞群。成骨性添加剂可作用于传代培养的成人MSCs,表现为培养皿表面有相互连接的结节状聚合体、碱酶染色阳性细胞数量增多、Von Kossa染色可见钙化的基质沉积。结论 所建立的成人MSCs的分离和培养条件可分选出骨髓黏附细胞中一组独特的细胞群,成人MSCs具有体外成骨潜能。     

rhBMP-2体外诱导骨质疏松大鼠BMSCs成骨及VEGF表达的研究

目的:观察骨形态发生蛋白-2对骨质疏松时骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成骨及成骨因子VEGF表达的影响,为骨质疏松证的防治提供新的方法。方法:将20只6月龄,体重(300±20) g雌性SD大鼠双侧卵巢切除,术后3个月利用双能X线骨密度仪测量大鼠全身骨密度并与术前比较,确保造模成功,并运用全骨髓贴壁法培养骨质疏松大鼠BMSCs,倒置相差显微镜下观察BMSCs形态。随机把骨质疏松大鼠BMSCs 第2代(p2)细胞分成实验组和对照组,分别加入完全培养基(含rhBMP-2)、成骨诱导液进行成骨诱导。2周后茜素红染色法检测各组细胞钙结节的形成,酶标仪测定碱性磷酸酶活性及RT-PCR法检测VEGF的表达量。结果:(1)大鼠全身骨密度:手术前后大鼠全身骨密度分别为(0.179±0.007),(0.158±0.006) g/cm²,差异有统计学意义(t=4.180,P<0.05).(2)茜素红染色:BMSCs(P2)成骨诱导2周后实验组染色效果明显强与对照组。(3)碱性磷酸酶活性:BMSCs(P2)成骨诱导2周后碱性磷酸酶活性实验组明显高于对照组,分别为(15.62±1.27),(8.62±0.93) μg/prot,差异有统计学意义(t=7.709,P<0.01).(4)BMSCs(P2)成骨诱导2周后VEGF表达:实验组明显高于对照组,分别为3.723±0.143,0.950±0.072,差异有统计学意义(t=29.462,P<0.01).结论:rhBMP-2能提高去卵巢骨质疏松大鼠BMSCs的体外成骨能力,可促进成骨因子VEGF的表达,调控VEGF的表达可能是骨形态发生蛋白-2参与骨代谢的机制之一。     

联合rhBMP-2与成骨细胞诱导骨髓基质细胞成骨分化的实验研究

目的探讨rhBMP-2和成骨细胞联合诱导骨髓基质细胞(BMSCs)的成骨分化能力。方法应用全骨髓贴壁法分离培养4周龄SD大鼠的BMSCs,通过改进酶消化法结合反复贴壁法培养1日龄SD乳鼠成骨细胞。实验分为4组:rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组、单纯培养液组。倒置相差显微镜及扫描电镜观察细胞生长情况;分别收集第3、6、9天细胞培养液上清液定性及定量测定碱性磷酸酶并进行统计学分析。结果 rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组均检测出成骨细胞生成,其中,rhBMP-2+成骨细胞诱导组碱性磷酸酶含量明显大于前两组,差异有统计学意义(P0.05)。结论rhBMP-2、成骨细胞、rhBMP-2联合成骨细胞均能提供成骨微环境,并在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化,rhBMP-2联合成骨细胞对BMSCs的成骨分化具有更优的诱导能力。     

体内构建组织工程骨的示踪观察：CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性研究

目的探索组织工程骨体内成骨时,CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性,为种子细胞的体内转归研究提供标记方法。方法分离比格犬BMSCs,成骨诱导至第2代,用荧光染料CM-DiI进行细胞标记。荧光倒置显微镜观察标记后的细胞形态,MTT比色法测定标记前后BMSCs的增殖状况,检测标记前后Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、骨形态发生蛋白（BMP-2）、骨钙素（BGLAP）和骨黏连蛋白（SPARC）的表达。最后,CM-DiI荧光标记后的BMSCs与β-TCP复合共培养后植入比格犬背部皮下,8周后取材,荧光显微镜下观察BMSCs体内转归,HE染色观察异位成骨情况。结果CM-DiI标记后早期细胞呈现红色荧光,48 h后荧光增强,72 h内荧光强度无明显减弱。BMSCs在CM-DiI标记前后细胞形态基本一致,两组间细胞的增殖率无明显差别;标记后RT-PCR检测Col-Ⅰ、BMP-2、BGLAP、SPARC表达,显示标记后的BMSCs亦可向成骨方向分化。扫描电镜检测到标记后细胞在β-TCP上增殖良好,细胞基质分泌丰富。细胞-支架复合物植入比格犬皮下,8周后荧光显微镜观察到标记细胞仍存在,且HE染色可见支架孔隙中有类骨基质沉积。结论CM-DiI对BMSCs的生长增殖、成骨分化无明显影响,对体内组织工程骨中BMSCs的示踪时间可长达8周,可用作体内细胞的长效示踪剂。     

从BMSCs探讨“肾主骨生髓”理论指导下中医药治疗骨质疏松症的研究

摘要：骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是在一定条件下能够向成骨细胞分化的多能干细胞，其增殖分化与中医“肾主骨生髓”理论及骨质疏松症(osteoporosis, OP)关系密切，大量研究表明传统补肾中药诱导BMSCs增殖分化治疗OP疗效显著。本文以中医“肾主骨生髓”理论为指导，探讨“肾藏精-主骨生髓-BMSCs-OP”之间的科学内涵，并探讨“补肾生髓”理论指导下传统补肾中药通过诱导BMSCs成骨分化与OP的关系，结合补肾中药及复方诱导BMSCs治疗OP的现代医学研究，为进一步探索有效的中医药治疗方案及发挥中医药独特优势提供依据。     

Fresh bone marrow introduction into porous scaffolds using a simple low‐pressure loading method for effective osteogenesis in a rabbit model

Recent advances in tissue engineering techniques have allowed porous biomaterials to be combined with osteogenic cells for effective bone regeneration. We developed a simple low‐pressure cell‐loading method using only syringes and stopcocks, and examined the effect of this method on osteogenesis when applied to the combination of highly porous β‐tricalcium phosphate (β‐TCP) and fresh autologous bone marrow. Both block and granule β‐TCP scaffolds were used to prepare implants in three different ways: without bone marrow as a control, with bone marrow that was allowed to penetrate spontaneously under atmospheric pressure (AP group), and with bone marrow that was seeded under low pressure (ULP group). These implants were transplanted into rabbit intramuscular sites, and the samples were examined biologically and histologically. The penetration efficiency of the block implants after marrow introduction was significantly higher in the ULP group than in the AP group. In the transplanted block samples, alkaline phosphatase activity was significantly higher in the ULP group at 2 weeks after implantation, and significantly more newly formed bone was observed in the ULP group at both 5 and 10 weeks compared with the AP group. Similar results were observed even in the experiment using β‐TCP granules, which are smaller than the blocks and frequently used clinically. Because of its convenience and safety, this low‐pressure method might be a novel, effective treatment to promote osteogenesis with bone marrow in clinical bone reconstruction surgeries. © 2008 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 27:1–7, 2009     

Modulation of osteogenesis in human mesenchymal stem cells by specific pulsed electromagnetic field stimulation

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are a promising candidate cell type for regenerative medicine and tissue engineering applications by virtue of their capacity for self‐renewal and multipotent differentiation. Our intent was to characterize the effect of pulsed electromagnetic fields (PEMFs) on the proliferation and osteogenic differentiation of hMSCs in vitro. hMSCs isolated from the bone marrow of adult patients were cultured with osteogenic medium for up to 28 days and exposed to daily PEMF stimulation with single, narrow 300 µs quasi‐rectangular pulses with a repetition rate of 7.5 Hz. Relatively greater cell numbers were observed at late stages of osteogenic culture with PEMF exposure. The production of alkaline phosphatase (ALP), an early marker of osteogenesis, was significantly enhanced at day 7 with PEMF treatment in both basal and osteogenic cultures as compared to untreated controls. Furthermore, the expressions of other early osteogenic genes, including Runx2/Cbfa1 and ALP, were also partially modulated by PEMF exposure, indicating that osteogenesis in hMSCs was associated with the specific PEMF stimulation. Based on ALP and alizarin red S staining, the accumulation of ALP protein produced by the hMSCs as well as calcium deposits reached their highest levels at day 28. Our results indicate that extremely low‐frequency PEMF stimulation may play a modulating role in hMSC osteogenesis. Taken together, these findings provide insights on the development of PEMF as an effective technology for regenerative medicine. © 2009 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res     

淫羊藿苷对衰老骨髓间充质干细胞成骨的影响

目的 探究淫羊藿苷（icarrin,Ica）对D-半乳糖(D-gal)诱导的衰老骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨的影响及机制。方法 通过全骨髓贴壁法提取BMSCs,采用流式细胞术及成骨、成脂诱导分化鉴定细胞。通过CCK8法检测D-gal及Ica处理BMSCs的最适浓度,用D-gal诱导BMSCs衰老,药物干预48 h;6SA-β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况;碱性磷酸酶试剂检上清液ALP水平;RT-PCR和Western Blot分别检测BMSCs中衰老相关P16、P53、P21及成骨相关Foxo3a、β-catenin的蛋白表达。结果 BMSCs表面标志物CD44和CD90表达大于95%;CD34、CD45表达小于5%,且能被定向诱导分化出钙结节及脂滴,鉴定细胞为BMSCs。CCK8检测出30 mg/mL为D-gal的最适浓度,10-8、10-10 mol/L为Ica最适浓度。Ica能减少衰老BMSCs中P16、P53、P21 mRNA的表达;降低Foxo3a mRNA和蛋白表达,增加β-catenin mRNA和蛋白的表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 D-gal能够诱导构建出衰老BMSCs模型;Ica增加了衰老BMSCs上清液中的ALP含量、降低了衰老BMSCs中 P53的表达水平,可能通过调节成骨相关信号通路Foxo3a/β-catenin表达,起到对衰老BMSCs成骨分化能力的改善作用。