PCR及GMS染色法对肺孢子虫肺炎的临床诊断价值

目的 评价PCR及六胺银（GMS）染色法对肺孢子虫肺炎（PCP）的临床诊断价值。方法用PCR及GMS染色法检测临床拟诊PCP患者及非PCP患者的痰液标本，比较两种方法的敏感性和特异性。结果在40例临床拟诊PCP患者的痰标本中，用PCR方法检测肺孢子虫DNA，结果均为阳性，其中有12例患者用SMZ治疗后复检，PCR全部转阴；而用GMS染色镜检，阳性率仅为35．0％（14／40）。20例非PCP呼吸道感染者的痰液PCR和GMS染色镜检结果均为阴性。结论用GMS染色法诊断PCP，特异性高但敏感性差；PCR的敏感性高于GMS染色法，适于临床筛查和疗效考核。     

肺孢子虫感染大鼠模型的建立及ITS巢式PCR检测敏感性研究

目的 建立肺孢子虫感染大鼠模型并探讨ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫DNA的敏感性. 方法 大鼠分为实验组和对照组,实验组从第1周开始用每周2次每次每只皮下注射地塞米松1 mg的方法诱导,共8周,并分别在首次注射后第2、4、6、8周解剖大鼠制作肺印片、肺组织匀浆液及支气管肺泡灌洗液(BAL)涂片,并进行六亚甲基四胺银(Gomori's methenamine silver,GMS)染色镜检;对照组不作激素注射,并分别在0周和第10周剖杀染色检查.同时分别提取大鼠BAL和肺组织的肺孢子虫DNA进行巢式PCR扩增,比较GMS法和ITS巢式PCR检测的敏感性. 结果 实验组从第6周开始染色镜检,可见少量肺孢子虫包囊,第8周肺印片、肺组织匀浆液均检测到包囊,检出率为100%(10/10),BAL的检出率为80%(8/10),对照组则均未检出.用ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR法均能检测出实验组第8周大鼠BAL和肺组织卡氏肺孢子虫DNA,阳性率为100%(10/10),对照组均为阴性.比较BAL标本、肺印片和肺组织匀浆液GMS染色法的检出率,BAL最低,肺组织匀浆液最高.其中20%(2/10)大鼠的BAL标本用GMS染色法未能检出,但用巢式PCR方法均能成功扩增.结论成功用地塞米松诱导法建立了肺孢子虫大鼠感染模型;ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫敏感性高、特异性强,可推广应用于临床诊断肺孢子虫肺炎.     

实验动物肺孢子菌隐性感染状况调查

目的调查实验动物肺内肺孢子菌隐性感染情况,为其质量监测及选择标准提供依据。方法从本校实验动物部培育的3种6个品系普通级实验动物中随机抽取大鼠、小鼠和兔,取肺脏制成印片标本,分别用姬姆萨(Giemsa)和改良的六亚甲基四胺银(GMS)染色,镜检肺孢子菌的包囊型和滋养体型;用PCR方法检测肺孢子菌特异性DNA。结果①大鼠Giem-sa染色和改良的GMS法阳性率分别为22.6%(12/53)和30.2%(16/53);PCR检测阳性率为49.1%(26/53)。②小鼠Giemsa染色检查全为阴性;GMS染色法检查阳性率为8.5%(8/94)。③用Giemsa和GMS染色检查日本大耳白兔,结果全为阴性。④对比3种动物不同品系的肺孢子菌感染率,GMS染色大鼠、小鼠两者差异显著(P<0.05)。Wistar和SD两种品系大鼠间无显著性差异(P>0.05);昆明株,BALB/c和C57BL/6三个品系小鼠间感染率无显著性差异(P>0.05)。⑤3种检查方法对比:PCR,GMS和Giemsa的阳性率分别为49.1%(26/53),13.6%(24/177)和6.8%(12/177),三者间检出率存在显著性差异(P<0.05)。结论肺孢子菌在普通级实验大鼠及小鼠体内的隐性感染现象较为普遍,其中大鼠的感染率明显高于小鼠。PCR灵敏性高于Giemsa和GMS染色法。     

PCR及GMS染色法对肺孢子虫肺炎的临床诊断价值

目的评价PCR及六胺银(GMS)染色法对肺孢子虫肺炎(PCP)的临床诊断价值。方法用PCR及GMS染色法检测临床拟诊PCP患者及非PCP患者的痰液标本,比较两种方法的敏感性和特异性。结果在40例临床拟诊PCP患者的痰标本中,用PCR方法检测肺孢子虫DNA,结果均为阳性,其中有12例患者用SMZ治疗后复检,PCR全部转阴;而用GMS染色镜检,阳性率仅为35.0%(14/40)。20例非PCP呼吸道感染者的痰液PCR和GMS染色镜检结果均为阴性。结论用GMS染色法诊断PCP,特异性高但敏感性差;PCR的敏感性高于GMS染色法,适于临床筛查和疗效考核。     

肺孢子菌感染或定植与呼吸系统疾病的相关性探讨

目的 检测呼吸疾病患者肺内肺孢子菌基因阳性率,探讨肺孢子菌定植或感染的影响因素及其与呼吸系统疾病的相关性。方法 设计3对特异性引物,构建检测肺孢子菌16S rRNA基因的LAMP反应体系。通过对大鼠感染模型的肺孢子菌基因检测,验证其敏感性和特异性;通过对临床呼吸疾病患者痰液样本肺孢子菌基因的检测,分析肺孢子菌感染或定殖与呼吸系统疾病的相关性及其影响因素。结果 本研究建立的LAMP方法检测肺孢子菌16S rRNA基因的最低检测极限为50 copies/mL;与念珠菌等8种呼吸道病原体不发生交叉反应。共收集和检测98例呼吸疾病患者痰标本,肺孢子菌基因总检出率为63.3%(62/98)。合并呼吸道感染者63例,非合并感染者35例,肺孢子菌基因阳性率分别为60.3%和75.0%,χ²检验两者差异有统计学意义。肺部影像学有改变者肺孢子菌基因检出率为72.5%,肺部影像学无改变者检出率为53.19%,χ²检验两者具有显著性差异。COPD和非COPD患者肺孢子菌基因检出率分别为53.2%和71.2%,χ²检验两者无显著性差异;COPD急性发作期和稳定期阳性率分别为66.8%和46.9%,χ²检验两者差异无统计学意义。CD4⁺ T淋巴细胞数降低患者肺孢子菌基因检出率80.0%;CD4⁺ T 淋巴细胞数正常者的检出率为60.27%,χ²检验两者差异具有统计学意义。1,3-β-D-葡聚糖血含量升高和含量正常患者的肺孢子菌基因检测结果显示,χ²检验两者差异无统计学意义。结论 呼吸疾病患者中肺孢子菌基因检出率较高。两者是否有直接的因果关系尚需进一步研究。合并其他细菌感染者肺孢子菌基因阳性率较低,其机制有待于进一步研究。CD4⁺ T细胞数降低者肺孢子菌基因阳性率升高,符合肺孢子菌为机会感染的特点。     

肺癌患者耶氏肺孢子菌的隐性感染研究

目的检查肺癌患者的耶氏肺孢子菌(Pneumocystisjiroveci,P.jiroveci)的隐性感染情况,为癌症患者的化疗、肺孢子菌肺炎的预防提供参考依据。方法收集了50份未接受化疗的肺癌患者的肺癌旁肺组织标本及其相关信息,采用Giemsa、GMS病原学染色法和PCR扩增技术检测该组患者P.jiroverci的自然隐性感染率。并对感染者的年龄及性别进行了相关性分析。结果Giemsa、GMS、PCR三种方法检测到P.jiroveci的隐性感染率分别为Giemsa法2%;GMS法10%;PCR法为16%。X2检验结果显示三种不同检测方法的检测结果具有显著性差异(P<0.05)。对患者的年龄及性别的相关性分析结果表明,该组患者的P.jiroveci隐性感染情况无性别及年龄相关性。结论肺癌患者携带P.jroveci病原体,感染率为16%,提示这类患者存在发生肺孢子菌肺炎和成为传染源的潜在危险。对比本实验采用的三种检测方法,以PCR技术较为敏感。     

聚合酶链反应方法检测诱导排痰标本对卡氏肺孢子虫肺炎的诊断价值

目的 评价聚合酶链反应方法检测诱导排痰标本中卡氏肺孢子虫DNA对卡氏肺孢子虫肺炎（PCP）的诊断意义。方法 分别用姬姆萨和六胺银（GMS）两种染色方法和mt-rRNA-PCR方法检测痰液中的卡氏肺孢子虫。结果 化学染色法检测16例临床拟诊PCP的患者痰标本。结果 8例阳性,20例非PCP患者痰标本均为阴性,化学染色方法的敏感性和特异性分别为50％和100％。PCR方法检测16例临床拟诊PCP患者痰液中卡氏肺孢子虫,14例阳性,20例非PCP患者痰标本均为阴性,mt-rRNA-PCR方法的敏感性和特异性分别为88％和100％。结论 姬姆萨和GMS两种细胞化学染色方法联合检测痰标本卡氏肺孢子虫,特异性高,但敏感性偏低。mt-rRNA-PCR检测痰标本中卡氏肺孢子虫DNA方法敏感性高于化学染色法且特异性高,更适于临床应用。     

血清半乳甘露聚糖检测诊断侵袭性肺曲霉病的实验研究

目的评价血清半乳甘露聚糖（GM）检测对侵袭性肺曲霉病（IPA）的诊断价值。方法清洁级健康成年SD大鼠90只，按随机区组设计分为烟曲霉感染组、白假丝酵母菌感染组、毛霉感染组、肺炎链球菌感染组、烟曲霉口咽定植组，每组18只。气管插管滴人法建立大鼠侵袭性肺部真菌感染和细菌感染动物模型。经鼻腔和口咽滴人法建立烟曲霉口咽定植动物模型。分别于接种完成后第3天、第7天、第12天处死大鼠，取心脏血，采用Platelia Aspergillus（法国Bio—Rad公司）试剂盒检测血清GM，取肺组织行组织病理学检查。多组间比较采用单因素方差分析，实验数据经SPSS统计软件处理。结果除曲霉定植组外，光镜下各组大鼠肺组织均见明显炎症反应，真菌感染大鼠在肺组织中可见真菌菌丝或孢子。烟曲霉、白假丝酵母菌、毛霉、肺炎链球菌感染组和烟曲霉口咽定植组大鼠血清GM的吸光度指数均值分别为1．69±0．29、0．89±0．46、0．87±0．39、0．77±0．34和0．90±0．49，烟曲霉感染组与其他4组分别比较，差异明显。以吸光度指数为1．5作为诊断阈值诊断IPA的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为78．6％、87．5％、57．9％和94．9％；以吸光度指数为1．5时，第3天、第7天和第12天血清GM检测诊断IPA的敏感性分别为60％、80％和100％。结论GM检测可区分IPA与白假丝酵母菌感染、毛霉感染、肺炎链球菌感染和烟曲霉口咽定植；GM检测诊断IPA的敏感性随感染时间的延长而增加；以吸光度指数为1．5作为诊断阈值诊断IPA的敏感性、特异性较理想。     

绵羊肺腺瘤病毒的巢式RT—PCR技术检测

目的为能够更加准确、敏感的检测绵羊肺腺瘤病（sheep pulmonary adenomatosis SPA）。方法本试验通过外源性绵羊肺腺瘤病毒的囊膜基因env的TM区和长末端重复序列LTR的U3区分别设计特异性的内外侧引物,运用巢式RT-PCR的方法进行检测,同时与普通RT—PCR进行比较。结果测得的绵羊肺腺瘤病毒的env基因和U3区序列与Gen—Bank中发表的外源性绵羊肺腺瘤病毒基因序列（AF105220）同源性分别为100％和98％。特异性试验结果表明本试验设计的env基因和LTR的U3区的内外侧引物不能从健康绵羊、小鼠、家兔的肺组织以及感染了SPA羊的肾、肝、脾的RNA中扩增出条带。敏感性试验结果表明,env基因和LTR的U3区的巢式RT—PCR诊断方法最低能检测出的标准模板RNA量分别为48fg和48pg,而普通的RT—PCR,env基因及LTR的U3区的最低检出量分别为0．48ng和4．8ng,得出巢式RT—PCR的敏感性高于普通RT—PCR,同时env基因的敏感性高于LTR的U3区的敏感性。结论以上试验说明巢式RT—PCR技术对于检测绵羊肺腺瘤病具有很高的敏感性和实用性。     

肺孢子菌动物模型的建立及病原学和分子生物学检测技术研究

目的 目的 建立肺孢子菌动物模型, 并对肺孢子菌病原学和分子生物学检测技术进行研究。方法 方法 SD和Wistar大 鼠随机分为实验组和对照组, 实验组大鼠皮下注射地塞米松, 对照组皮下注射生理盐水。诱导8周后处死全部大鼠, 收 集其支气管肺泡灌洗液 （BALF） 和肺组织, 分别做涂片和肺印片, 染色后镜检。用FTA卡采集所有大鼠的BALF进行PCR 检测。对PCR产物进行测序, 利用BLAST软件将测序结果与GenBank数据库中的鼠源性肺孢子菌进行比对, 确定菌 种。结果 结果 共采集肺组织标本和BALF 各34份, 病原学检测显示实验组总感染率为29.2% （7/24）, 对照组感染率为0; 其 中SD和Wistar大鼠实验组感染率分别为25.0% （3/12） 和33.3% （4/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.31）; 实验组SD大鼠肺印 片和BALF 肺孢子菌阳性检出率分别为25.0% （3/12） 和16.7% （2/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.34）。实验组Wistar大鼠 肺印片和BALF 肺孢子菌阳性检出率分别33.3% （4/12） 和16.7% （2/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.24）。用PCR方法共检 测28份大鼠BALF样本, 实验组阳性检出率为91.7% （26/28）, 对照组均为阴性。对PCR产物进行测序分析, 发现其与 GenBank 已登录的大鼠源肺孢子菌 （JX499145、 GU133622、 EF646865） 的同源性均为100%。结论 结论 通过皮下注射地塞米 松可以建立肺孢子菌动物模型, SD大鼠与Wistar大鼠在作为肺孢子菌动物模型的选择上无显著差别。在早期感染阶 段, 适宜用PCR法进行肺孢子菌检测, 病原形态学检测漏检率高。     

1341例疑似肺孢子菌肺炎非HIV阳性患者病原学诊断分析

目的探讨六亚甲基四胺银(gomori’s methenamine silver,GMS)染色镜检法和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测肺孢子菌肺炎(pneumocystis pneumonia,PCP)患者标本的阳性率,为临床提供更有利的实验室支持依据。方法采集1341例疑似PCP患者的深部诱导痰或支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid,BALF)标本,GMS镜检法和PCR法相结合检测肺孢子菌,任何一种方法检测阳性,即判断为PCP。结果共285例诊断为PCP,其中114例为GMS染色镜检法阳性,282例为PCR法检测阳性,111例为2种检测方法双阳性,3例为GMS染色镜检法单独阳性(均为肾移植术后BALF样品),171例为PCR方法单独阳性。深部诱导痰标本中,GMS染色镜检法和PCR法阳性检出率分别为5.1%和16.2%(P<0.05);而BALF标本二者的阳性检出率分别为23.3%和42.2%(P<0.05)。未知原因发热合并肺炎患者和器官移植后接受免疫抑制剂治疗者有更高的阳性检出率。结论 PCR法检测PCP阳性率高于GMS染色镜检法,PCR法检测与GMS染色镜检法结合诊断PCP对临床具有较高指导价值。     

耐红霉素肺炎链球菌的分子生物学研究

目的研究耐红霉素肺炎链球菌的分子生物学特点。方法社区获得性肺炎呼吸道标本分离的肺炎链球菌共45株,进行抗生素药物敏感性试验,对耐药菌株采用PCR方法检测红霉素的耐药基因ermA/ermB/mefA,同时采用脉冲场凝胶电泳技术和青霉素结合蛋白基因多态性追踪耐药菌株之间的同源性,以获得耐药菌株的分子流行病学特点。结果45株肺炎链球菌中对红霉素耐药24株,均为多耐药肺炎链球菌;青霉素耐药14株,其中11株（78.6%）同时耐红霉素。22株（92%）的红霉素耐药株为MLS表型,即同时耐克林霉素,2株为M型耐药。经PCR扩增,20株（83.3%）具有ermA/B基因,6株（25.0%）同时有erm和mef基因,2株（8.3%）只有mef基因,2株未能检测到erm或mef基因。脉冲场凝胶电泳和青霉素结合蛋白基因多态性检测未发现不同地区相同的耐药克隆株。结论erm基因编码的核糖体突变是肺炎链球菌耐红霉素的主要机制,本研究未发现不同地区相同的耐药克隆株。     

肺炎嗜衣原体菌体抗原的制备及应用

目的制备肺炎嗜衣原体（Chlamydophila pneumoniae,Cpn）菌体抗原,纯化后建立ELISA方法,用于血清Cpn抗体的检测。方法应用进口Cpn毒株感染Hep-2细胞,利用吖啶橙染色和直接免疫荧光染色判断Cpn感染细胞,制备Cpn抗原。用初步纯化的Cpn抗原建立ELISA方法检测人血清特异性抗体。结果吖啶橙染色和直接免疫荧光检测显示,Cpn成功感染Hep-2细胞。提取Cpn抗原,用ELISA检测84份病人血清特异抗体,阳性率为52.4%,ELISA试剂盒法的阳性率为51.2%,差异无统计学意义（P〉0.05）。用Cpn菌体抗原ELISA检测209份病人血清,阳性率59.3%（其中心血管疾病患者血清138份,阳性率58.0%;呼吸系统疾病患者血清71份,阳性率62.0%）;检测84份健康者血清,阳性率2.4%,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论Cpn菌体抗原ELISA检测血清抗Cpn抗体可用于判断Cpn感染;病人血清Cpn抗体阳性表明,某些心血管和呼吸系统疾病患者的致病原因可能与肺炎嗜衣原体感染有关。     

基于GroEL基因的实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立及评价

目的 建立一种敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于检测临床标本中的恙虫病东方体。方法 根据恙虫病东方体GroEL蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。并从灵敏度、特异度、重复性及临床标本的检测能力等方面对本方法进行综合评价。结果 建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性,可检测出恙虫病东方体Gilliam、Karp、Kato和Kawasaki株。建立的标准曲线循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈现良好的线性关系(r=0.99),灵敏度分析显示样品最低检出浓度为21.8拷贝/μL。批内及批间重复性实验变异系数均小于1.5%,显示本方法具有良好的重复性。对本实验室保存的82份临床标本进行检测,并与常规巢式PCR方法比较,本方法检测出26份阳性标本中的25份,检出率为96.15%。结论 本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可用于临床病人及暴发疫情的实验室快速检测。     

荧光定量聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的建立检测肺炎支原体的荧光定量PCR法,并与市售试剂盒和传统巢式PCR法的检测性能进行比较。方法设计针对肺炎支原体社区获得性肺炎呼吸窘迫综合征毒素基因的特异性引物,构建含相应目的片段的质粒作为标准品,采用SYBR Green染料法进行实时定量PCR,并绘制标准曲线。通过检测其他细菌和170例儿童临床咽拭子样本,比较新建荧光定量PCR法、市售试剂盒和传统巢式PCR法在临床应用中的差异。结果新建荧光定量PCR法和巢式PCR法能够检出的肺炎支原体标准株DNA最低模板量为10拷贝,市售试剂盒检出最低模板量为102拷贝。在特异性实验中3种方法均可区分肺炎支原体和其他菌种。在检测的170例儿童临床咽试子样本中,新建荧光定量PCR法、市售试剂盒和传统巢式PCR法的阳性率分别为60.00%、50.00%和53.53%。新建荧光定量PCR法与市售试剂盒的结果具有高度相关性(r=0.953),2种方法的总符合率为86%,Kappa值为0.729。新建荧光定量PCR法与传统巢式PCR法的结果总符合率为90%,Kappa值为0.797。结论新建荧光定量PCR法与市售试剂盒相比灵敏性更高,特异性相同,成本低;与传统巢式PCR法相比操作简单,耗时短且污染少,具有良好的科研和临床应用前景。     

疟疾巢式PCR检测方法的优化应用

目的结合疟疾检测工作实际,对疟疾基因检测的巢式PCR方法进行优化应用,以提高疟疾检测效率。方法通过采用PCR预混液、内引物一步扩增、重新设计针对卵形疟多个亚种的新引物,在疟疾巢式PCR的基础对反应体系、反应条件和卵形疟原虫特异性引物进行优化。对优化后的方法进行特异性和敏感性分析,并用巢式PCR和优化后的方法同时对疟疾阳性血样和疟疾送检血样进行检测,对检测结果进行比较分析。结果优化后的方法特异性较好,敏感性可达pg至fg级。两种方法同时检测疟疾阳性血样的结果表明,优化后的方法PCR扩增产物的产量无明显变化,非特异性扩增明显减少,卵形疟不同亚种的检出率提高,总体特异性提高。对111份疟疾送检血样的实测结果表明,巢式PCR的敏感性和虫种特异性分别为94.57%和86.96%,优化后方法的敏感性和虫种特异性均为93.48%,两种方法敏感性差异无统计学意义(P0.05),但优化后的方法特异性明显提高(P0.05)。结论优化后的PCR检测在保持常规巢式PCR方法敏感性的基础上提高了特异性,同时因其实验环节减少而节省了检测成本、提高了检测效率。     

两种方法检测肺炎支原体的对比研究

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应与快速培养法检验肺炎支原体的临床效果。方法选取我院收治的肺炎支原体肺炎患儿186例,以及同期非肺炎支原体肺炎患儿131例,同时行两法检测肺炎支原体,对比临床诊断。结果实时荧光定量聚合酶链反应与快速培养法检测肺炎支原体相比,在灵敏度、阳性预测值、假阴性率以及诊断符合率方面略高(P>0.05);但前者在特异度、假阳性率方面则明显优于后者(P<0.05)。两法联合应用,灵敏度、阴性预测值、诊断符合率高于单用(P<0.05),但特异度低于前者(P<0.05)。两种检测方法检测结果也并不完全一致,一致率为72.56%。结论两种检测方法对肺炎支原体检测各有优点,应考虑联合应用。