Ⅰ型胶原修饰聚乳酸聚乙醇酸微球支架上骨髓间充质干细胞的黏附和成骨分化

背景：组织工程骨成骨功能终末细胞需要骨髓间充质干细胞在体外加以诱导或在体内以基因转染等技术加以诱导。 目的：研究Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球支架上骨髓间充质干细胞黏附和成骨分化的能力。 方法：制备聚乳酸聚乙醇酸微球支架,分离纯化雌性SD大鼠骨髓间充质干细胞。将培养至第3代骨髓间充质干细胞与未经处理的聚乳酸聚乙醇酸微球及Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球共同培养14 d,观察细胞在不同支架表面的黏附生长。 结果：扫描电镜及FDA-PI染色发现,骨髓间充质干细胞可在聚乳酸聚乙醇酸微球支架上生长,而与未修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球相比骨髓间充质干细胞更容易在Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球上黏附增殖。Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球有利于骨髓间充质干细胞的黏附、增殖,并且有一定诱导干细胞成骨分化的能力。     

转基因骨髓间充质干细胞移植与组织工程皮肤的血管化

背景：组织工程化皮肤移植后常因缺乏足够的血管化而导致低灌注和缺血损伤。利用转基因技术,可将血管生成调控因子基因导入目的细胞,使其表达某些调控因子,进而利于血管生成。 目的：观察转基因骨髓间充质干细胞移植促进组织工程皮肤血管化基因治疗的可行性。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-03/11在江西省南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。 材料：人骨髓间充质干细胞由试验者取自临床骨髓穿刺检查骨髓正常的患者。pShuttle-CMV/VEGF165 质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠。16只新西兰大白兔用于皮肤缺损模型的制作,分为基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组、真皮支架材料组进行移植。 方法: 采用密度梯度离心结合贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞,以pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染骨髓间充质干细胞。于兔背部两侧制备2 cm×2 cm 的正方形全层皮肤缺损3个,并分别以人血管内皮细胞生长因子165转染骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、不含细胞的真皮支架材料植入全层皮肤缺损创面。 主要观察指标：观察局部组织微血管密度变化及移植物成活率。 结果：术后7 d,3组创口周围皮肤均无明显红肿及炎症反应,移植物与创面接触紧密,基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组可见部分真皮泛红, 真皮支架材料组不明显,术后3周创面基本愈合,基因转染骨髓间充质干细胞组创面的毛细血管密度较骨髓间充质干细胞组、真皮支架材料组明显增高(P < 0.01),14 d时3组中基因转染骨髓间充质干细胞组血管密度仍最高,但3组数据无统计学差异。术后二三周基因转染骨髓间充质干细胞组移植物成活率最高(P < 0.01)。 结论：血管内皮细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植可改善和促进局部血管再生,促使新的毛细血管从创面长入移植的组织工程皮肤,从而促进组织工程皮肤的早期血管化及创面愈合。     

肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞异体移植修复烧伤创面

背景：经携带人肝细胞生长因子的重组腺病毒（adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor，Ad-HGF）修饰的骨髓间充质干细胞创面移植后，可分化为“修复细胞”，并能够在创面持续释放肝细胞生长因子。 目的：观察Ad-HGF基因转染的骨髓间充质干细胞异体移植对大鼠烧伤创面愈合的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物观察，于2006-02/2007-03在解放军兰州军区兰州总医院临床实验科和烧伤整形科实验室完成。 材料：Wistar大鼠40只，由解放军兰州军区兰州总医院动物实验科提供。Ad-HGF与携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒（adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor，Ad-GFP）颗粒均由哈小琴博士惠赠。 方法：取雄鼠10只，Percoll密度梯度离心法体外分离培养骨髓间充质干细胞，并行Ad-HGF转染。取雌鼠30只，随机分为未转染细胞组、Ad-HGF转染细胞组、Ad-GFP转染细胞组、Ad-HGF对照组、假伤组，6只/组。前4组大鼠复制背部深Ⅱ度烧伤模型，并分别于创面真皮层下方多点注射对应的细胞悬液或病毒悬液1 mL；假伤组大鼠背部剃毛后浸入37 ℃温水12 s模拟烧伤，同法注射等量生理盐水。 主要观察指标：对采集的创面标本行组织学观察和羟脯氨酸含量测定，采用免疫组化分析创面肝细胞生长因子的表达。 结果：苏木精-伊红染色结果显示，Ad-HGF转染细胞组移植后7 d创面表皮化优于其他组，至21 d再生表皮明显厚于其他组，并可见真皮钉脚下伸。胶原特殊染色结果显示，Ad-HGF转染细胞组移植后7，21 d创面中的胶原排列较其他组整齐。移植后7 d，Ad-HGF转染细胞组羟脯氨酸含量显著低于其他组（F=3.216，P < 0.01）。移植后21 d，Ad-HGF转染细胞组愈合创面中肝细胞生长因子的阳性表达位于真皮层，表达强度明显强于其他组。 结论：Ad-HGF基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞异体移植后，对烧伤创面愈合存在一定的促进作用。     

Ad-GFP修饰的间充质干细胞在肺气肿大鼠体内向肺部的定向迁移★

背景：近些年来应用相关干细胞及生长因子促进肺再生修复肺气肿病变的研究逐渐成为热点，那么通过干细胞携带相关外源生长因子基因能否更好的修复肺气肿病变值得关注。 目的：观察携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒(adenovirus vecto rmediated green fluorescence protein，Ad-GFP)转染骨髓间充质干细胞的效率、对细胞增殖的影响，及携带目的基因的间充质干细胞尾静脉移植在肺气肿大鼠肺部的定居情况。 方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离、培养间充质干细胞，流式细胞仪鉴定；在不同感染复数时，激光共聚焦显微镜检测转染效果及转染效率，MTT法检测转染48 h的细胞活性；Wistar大鼠16只，随机分为模型组和对照组，每组8只，采用单纯被动烟熏法制备肺气肿大鼠模型。通过尾静脉移植Ad-GFP修饰的间充质干细胞，于24 h后取大鼠肺组织做快速冰冻切片，在荧光显微镜下观察间充质干细胞在肺部的分布情况。 结果与结论：实验成功获得大鼠间充质干细胞，Ad-GFP成功转染间充质干细胞，且在MOI=200时，转染效率达到88.42%。在不同MOI下，Ad-GFP转染间充质干细胞对细胞增殖无影响(P > 0.05)。移植24 h后，模型组大鼠及对照组大鼠肺部可见到发绿色荧光的间充质干细胞，且模型组荧光强度明显强于对照组(P < 0.05)。提示导入目的基因可能不会影响骨髓间充质干细胞增殖和归巢特性。     

三维支架材料与脂肪干细胞的生物相容性

背景：构建组织工程化气管需要适合的三维支架。 目的：观察脂肪干细胞与聚乳酸-乙醇酸共聚物及聚三亚甲基碳酸酯共聚物支架的生物相容性。 方法：采用组织块法原代分离培养SD大鼠脂肪干细胞,行流式细胞术及多向分化能力鉴定。将脂肪干细胞分别种植于聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚乳酸-乙醇酸-三亚甲基碳酸酯共聚物支架中,扫描电镜观察细胞与支架的生物相容性。 结果与结论：脂肪干细胞种植于两种支架材料后生长速度快,扫描电镜观察可见脂肪干细胞呈球型,并伸展形成伪足,贴附于支架材料,细胞间相互连接成团。说明聚乳酸-乙醇酸共聚物与聚三亚甲基碳酸酯共聚物支架均具有良好的生物相容性,无细胞毒性,其多孔的三维立体状结构适合脂肪干细胞黏附生长。     

钙离子ATP酶2a基因修饰骨髓间充质干细胞移植改善慢性心力衰竭大鼠的心功能***☆

背景：目前仍缺乏有效手段修复心力衰竭后受损心肌，逆转心肌病理性重塑。作为一种新的治疗策略，用正常肌细胞和治疗性基因干预受损心肌正逐渐显示出其在改善心功能方面的优势。 目的：观察腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的有效性和稳定性。并以携带肌浆网钙离子ATP酶（sarcoplasmic reticulum Ca(2+) ATPase，SERCA2a) 基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞，治疗心力衰竭大鼠，比较SERCA2a基因治疗，骨髓间充质干细胞移植以及骨髓干细胞基础的SERCA2a基因治疗慢性心力衰竭大鼠的效果。 设计：随机对照实验。 单位：解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系。 材料：选取购于北京医科大学动物实验中心的4周龄雄性SD大鼠作为骨髓供体。选取体质量200~250 g雌性成年SD大鼠作为细胞移植和基因治疗受体。以雄性大鼠Y染色体sry基因鉴定供体移植细胞是否在雌性大鼠受体心肌内存活。实验所用Ad-SERCa2a，Ad-EGFP的构建由我科鲁小春博士完成；第3和8代骨髓间充质干细胞自行分离培养。 方法：实验于2004-07/2005-12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成。对30只雌性SD大鼠进行左冠状动脉结扎，制作急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠模型。将造模成功的29只大鼠随机分为4组：基因治疗组7只，干细胞移植治疗组7只，基因修饰的干细胞移植组8只，腺病毒空载体对照组7只，分别予以单纯SERCA2a基因、MSC移植、SERCA2a基因修饰的骨髓间充质干细胞移植及腺病毒空载体干预。分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，用携带SERCA2a及绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-SERCA2a-GFP）转染第3和8代骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：采用流式细胞仪检测不同代骨髓间充质干细胞的Ad-SERCA2a-GFP转染率。分别在治疗前及治疗后14，21 d采用超声心动图检测大鼠心功能。采用免疫组化法检测大鼠心脏Ⅷ因子表达；采用RT-PCR 和Western杂交检测SERCA2a的基因和蛋白水平表达，并按照说明书检测宿主SERCA2a功能活性。 结果：①转染率：腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的转染率超过80%，第3代骨髓间充质干细胞与第8代的转染率比较，差异无显著性意义（P > 0.05）。②大鼠心功能：治疗后14 d，与腺病毒空载体对照组相比，其余3组左室射血分数均明显升高（P < 0.01）。治疗后 21 d，与腺病毒空载体对照组相比，干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组大鼠室壁增厚；干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组左室射血分数和左室短轴缩短率改善率持续升高（P < 0.01），基因治疗组两指标改善率较治疗14 d时下降。与腺病毒空载体对照组相比，基因修饰的干细胞移植组左室前壁和室间隔收缩期纵向峰值速度显著升高（P < 0.01），左室前壁和室间隔舒张期纵向峰值速度亦呈现相同改善(P < 0.01)。③心肌SERCA2a的基因、蛋白水平表达和功能活性，以及Ⅷ因子表达：携带SERCA2a基因的骨髓干细胞在宿主心肌能有效地合成和表达有功能的SERCA2a蛋白。与腺病毒空载体对照组相比，基因修饰的干细胞移植组SERCA2a基因、蛋白表达和酶活性均显著增强。干细胞移植组心力衰竭大鼠心脏瘢痕区可观察到Ⅷ因子表达。 结论：①第3和8代骨髓间充质干细胞均具有高腺病毒转染率，骨髓间充质干细胞是基因治疗的良好细胞载体，其介导的SERCA2a基因治疗对衰竭心肌具有持续稳定的心功能改善作用。②骨髓间充质干细胞移植改善心功能的作用可能与促进血管新生有关。     

双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化

背景：碱性成纤维细胞生长因子可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和向神经细胞方向分化，并被认为是胶质细胞的分裂原。 目的：以双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化情况，及其向神经元样细胞和神经胶质细胞分化的趋势。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-07/2006-03在中南大学实验动物中心实验室完成。 材料：选用50只SD大鼠，按随机数字表法分为4组：假手术组（n=10），脑缺血/再灌注损伤模型组（n=10），骨髓间充质干细胞治疗组（n=15），碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗组（n=15）。 方法：除假手术组外，其余3组制备局灶性脑缺血再灌注模型。分别将骨髓间充质干细胞或碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞通过静脉移植至实验性脑缺血大鼠体内，脑缺血再灌注损伤组大鼠注入相同体积的DMEM培养基。 主要观察指标：应用5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白及5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双重荧光标记法观察移植细胞在脑内的存活和分化情况，比较各组大鼠脑缺血后的神经功能评分及脑梗死体积变化。 结果：移植7 d后，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞组大鼠脑内5-溴-2-脱氧尿苷阳性细胞数、5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白双标阳性细胞数均高于骨髓间充质干细胞治疗组（P < 0.05），两组间5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双标阳性细胞数差异无显著性意义（P > 0.05）。再灌注7 d后，静脉移植骨髓间充质干细胞和碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞均能改善脑缺血后大鼠的神经功能、减少脑梗死体积，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的作用明显优于骨髓间充质干细胞。 结论：碱性成纤维细胞生长因子诱导的骨髓间充质干细胞静脉移植后可在脑内缺血区存活，并分化为比例更合适的神经元和神经胶质细胞，发挥神经修复作用。     

肾上腺髓质素基因转染改善缺氧培养骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力*

背景：基因转染可以提高骨髓间充质干细胞在移植区的存活,但目前对肾上腺髓质素基因转染骨髓间充质干细胞在缺氧条件下增殖、凋亡及分泌情况的研究很少。 目的：观察肾上腺髓质素基因转染对骨髓间充质干细胞在缺氧及无血清培养条件下增殖、凋亡、分泌血管内皮生长因子的影响。 方法：贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞。用x-gal染色测含肾上腺髓质素基因的重组腺病毒Ad-ADM对骨髓间充质干细胞的感染率。骨髓间充质干细胞分为未转染组、空载体组、Ad-ADM转染组。在缺氧、无血清条件下进行骨髓间充质干细胞的培养,在缺氧0,3,6,9,12,16,20,24 h CCK-8法检测细胞增殖情况,ELISA法检测检测细胞上清液肾上腺髓质素及血管内皮生长因子表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况。 结果与结论：重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的转染率与病毒感染复数具有量效关系,病毒感染复数为150时细胞的感染率达95.4%。缺氧、无血清培养条件下,3组骨髓间充质干细胞均出现生长抑制、凋亡增加,但是肾上腺髓质素基因转染组于0,3,6,9,12,16 h细胞凋亡率显著低于其他两组(P﹤0.05)。缺氧 9,12 h,骨髓间充质干细胞分泌肾上腺髓质素及血管内皮生长因子达到高峰,且Ad-ADM转染组显著增高于其他两组(P﹤0.05)。提示在缺氧、无血清培养条件下 (<20 h),肾上腺髓质素基因转染可增强骨髓间充质干细胞抗凋亡能力,这可能与肾上腺髓质素、血管内皮生长因子表达增加有关。     

重组碱性成纤维细胞生长因子基因转染对于骨髓源性成骨细胞的

背景：碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,对骨髓间充质干细胞具有间接的成骨作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,与骨髓间充质干细胞作对比。 设计、时间及地点：对比分析基因转染效果实验,于2007-11-27/2008-12-01在南方医科大学珠江医院中心实验室和动物实验中心完成。 材料：2月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨细胞诱导。5周龄Wistar大鼠用于移植实验。牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒由中山大学中山医学院免疫教研室徐霖博士惠赠。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞,采用脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选。稳定转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓源性成骨细胞与磷酸钙胶原材料复合培养,植于Wistar大鼠后腿肌袋内,正常饲养2,4周后取出植入的复合材料,观察血管新生情况。 主要观察指标：碱性成纤维细胞生长因子转染前后骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性参数的比较以及骨髓源性成骨细胞转染碱性成纤维细胞生长因子前后新生血管数目的比较。 结果：利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达情况。从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性。重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达。转染的细胞有大量目的基因mRNA转录和目的蛋白表达。转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化。转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,碱性磷酸酶的分泌量无明显变化(P > 0.05),转染后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P < 0.01)。骨髓源性成骨细胞转染与未转染碱性成纤维细胞生长因子基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的骨髓间充质干细胞中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录。转染有外源性碱性成纤维细胞生长因子基因的复合材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多。 结论：稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较骨髓间充质干细胞更理想。外源碱性成纤维细胞生长因子基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因。     

新型组织工程化骨材料植入动物体内的成血管效应

背景：以生长因子、种子细胞、载体支架为基础的骨组织工程研究取得的成功,向人们展示了再造骨组织器官的美好前景,然而在临床应用方面往往效果不理想。其中很重要一个原因是组织工程骨很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效。 目的：新型组织工程骨修复材料植入新西兰兔桡骨缺损处观察其成血管作用。 方法：将聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物包裹碱性成纤维细胞生长因子制备成微球囊,然后与磷酸钙骨水泥混合,并与体外培养的同种异体骨髓间充质干细胞共培养制备新型组织工程骨修复材料。60只成年新西兰兔建立15 mm桡骨缺损模型后随机分成2组,实验组植入新型组织工程骨修复材料,对照组植入复合骨髓间充质干细胞的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物与磷酸钙骨水泥的混合材料。于术后4、8、12周,通过组织细胞形态学观察、核素骨扫描等手段,观察各个时期血管形成情况。 结果与结论：光镜下组织形态学观察结果及核素骨扫描结果示血管化程度是实验组优于对照组。 结果显示聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物-成纤维细胞生长因子/磷酸钙骨水泥材料复合骨髓间充质干细胞构建的新型组织工程骨修复材料在动物体内有较好的成血管效果。     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向

背景：在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有显著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果。骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想。 目的：观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成。 材料：清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供。腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增。 方法：胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组。各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100。 主要观察指标：转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色结果,Western blotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达。 结果：与未转染组比较,转染后7,14,21d Ad-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明显增高（P < 0.01）,且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著。Ad-BMP2转染组von Kossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达。Western blotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达。 结论：大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞。     

脂肪来源神经干细胞移植局灶性脑缺血模型大鼠的血管新生

背景：脂肪组织来源的神经干细胞移植可改善脑缺血大鼠神经功能,但其机制尚不明确。 目的：观察人脂肪组织来源神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后血管新生的影响。 方法：体外培养脂肪基质细胞,诱导分化为神经干细胞。60只健康雄性SD大鼠分为4组：正常组6只,假手术组6只,缺血对照组24只,移植治疗组24只。后两组线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注模型,又分为缺血2 h再灌注7,14,21,28 d组,每个时点各6只。假手术组不闭塞大脑中动脉。造模成功后24 h,移植治疗组经尾静脉移植人脂肪组织来源神经干细胞悬液,细胞浓度为2×109 L-1;缺血对照组经尾静脉注射生理盐水。免疫组织化学法进行微血管密度计数,观察脑缺血区血管增生情况。 结果与结论：免疫组织化学结果显示,与缺血对照组比较,移植治疗组缺血2 h再灌注7,14,21,28 d的微血管密度值均显著高于缺血对照组,差异有显著性意义(P < 0.05~0.01)。提示脂肪组织来源的神经干细胞移植可促进脑缺血区新生血管的形成。     

转染肝细胞生长因子基因的骨髓间质细胞治疗大鼠缺血性脑卒中的效果观察

目的探讨转染肝细胞生长因子（HGF）基因的骨髓间质细胞（MSCs）治疗大鼠缺血性脑卒中的效果。方法应用I型单纯疱疹病毒（HSV-1）载体经体外将HGF基因转染MSCs。制备鼠一过性大脑中动脉缺血模型,24 h后通过立体定向技术,分别将磷盐溶液（PBS）、转染MSCs和HGF基因的MSCs（MSC-HGF）移植入大鼠缺血脑组织。应用改良神经功能损伤严重性（mNSS）评分评价检测神经功能,应用2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色法测量缺血脑组织容积。结果相同病毒感染滴度下,MSCs细胞培养上清液HGF浓度是MSCs细胞内的15倍,而且随感染滴度升高而显著增高（P〈0.05）。治疗前各组大鼠mNSS评分无显著差异（P〉0.05）,治疗后4、7、14、21、28、35 d,MSC-HGF组较PBS组显著降低（P〈0.05）;治疗后14、21、28、35 d,MSC-HGF组较MSC组显著下降（P〈0.05）;治疗后14、21、28、35 d,MSC组较PBS组显著降低（P〈0.05）。治疗后3 d,MSC-HGF组缺血脑组织容积较PBS组显著减少（P〈0.05）,PBS组和MSC组、MSC组和MSC-HGF组之间均无显著差异（P〉0.05）;治疗后14 d,MSC-HGF组缺血脑组织容积较PBS组和MSC均显著减小（P〈0.05）,MSC组较PBS组也显著减少（P〈0.05）。结论 HGF基因经HSV-1载体体外转染MSCs可高效分泌HGF,转染HGF基因的MSCs治疗急性缺血性脑卒中有效,且较单纯MSCs治疗显著提高疗效。     

转染肝细胞生长因子的骨髓间质细胞治疗大鼠缺血性脑卒中

目的探讨转染肝细胞生长因子（HGF）的骨髓间质细胞（MSCs）治疗大鼠脑缺血的效果。方法制备大鼠一过性大脑中动脉缺血（MCAO）模型。MCAO后24h分别将磷酸盐溶液（PBS）、MSCs和转染HGF的MSCs（MSC—HGF）通过立体定向技术植人缺血脑组织。通过改良神经功能严重性评分（mNSS）评价神经功能,应用免疫组织化学染色分析脑组织HGF表达、缺血脑组织边缘带细胞凋亡及存活神经元。结果治疗后2周,MSC—HGF组mNSS明显低于PBS组和EMCs组（P〈0.05）。治疗后第1天MSC—HGF组病变脑组织中HGF蛋白表达明显高于PBS组和EMCs组（P〈0．05）。治疗后1周,与PBS组和EMCs组相比,MSC—HGF组在梗死边缘带凋亡细胞的百分比明显减少（P〈0．05）,存活神经元的百分比明显增加（P〈0.05）。结论转染HGF的MSCs治疗缺血性脑卒中具有抗细胞凋亡、神经保护作用。     

纤维蛋白胶对脂肪干细胞增殖和存活的影响

摘要 背景：尽管有很多生物支架材料被用于携带种子细胞，但纤维蛋白胶与脂肪干细胞二者在体外的共培养研究及种子细胞在支架材料中的增殖存活评价没有统一的标准。 目的：探讨纤维蛋白胶对体外培养的大鼠脂肪干细胞的增殖和存活性，为可注射组织工程化心肌治疗心肌梗死提供实验依据。 方法：分离培养大鼠脂肪干细胞，通过流式细胞术检测其免疫表型，将脂肪干细胞与纤维蛋白胶共培养，用噻唑蓝比色法及LIVE/DEAD荧光双染色检测脂肪干细胞在纤维蛋白胶中的增殖和存活性。 结果与结论：大鼠脂肪干细胞表型特征为CD90、CD105阳性，CD34、CD45阴性，噻唑蓝比色结果显示，纤维蛋白胶中的脂肪干细胞增殖活性高于常规培养组(P < 0.05)，LIVE/DEAD荧光双染色显示脂肪干细胞在纤维蛋白胶中生长良好，24，72 h的细胞存活率均在90%以上，死亡率小于7%。结果提示，大鼠脂肪干细胞在纤维蛋白胶中增殖和存活良好，可用纤维蛋白支架携带脂肪干细胞用于可注射心肌组织工程研究。 关键词：脂肪干细胞；纤维蛋白胶；细胞培养；增殖；存活 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.002     

大鼠脂肪和骨髓来源间充质干细胞的生物学特性比较

背景：除骨髓外,人们已从胎盘组织、脐带血肌肉组织、脂肪组织中分离到了间充质干细胞。 目的：比较大鼠脂肪和骨髓间充质干细胞生物学特性和免疫调节功能的差异。 方法：脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞分别来自BN大鼠的脂肪和骨髓。体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,进行细胞形态、表面标志、生长动力学、分化潜能鉴定;混合淋巴细胞反应比较两种细胞的免疫调节特性。 结果与结论：脂肪间充质干细胞与骨髓间充质干细胞光镜和透射电镜下形态相似,第3代的脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均高表达CD29,CD90,低表达CD34,CD45,CD11b;第3,4,5代脂肪间充质干细胞增殖速度明显快于骨髓间充质干细胞;两者都具有低免疫原性,可以抑制异基因抗原引起的T淋巴细胞增殖,且这种抑制作用与细胞数目成正相关,等量脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞抑制作用差异无显著性意义。结果证实脂肪间充质干细胞具有和骨髓间充质干细胞同样的低免疫原性和免疫调节功能。     

慢病毒载体介导血管生长素1基因修饰骨髓间充质干细胞对颈动脉粥样硬化的影响

背景：骨髓间充质干细胞易于被外源基因转染,且具有向损伤组织趋化聚集的特性,便于将目的基因导入其中并发挥治疗性作用,可以通过分化为血管内皮细胞修复损伤的血管内膜。 目的：探讨慢病毒载体介导的血管生长素1基因修饰骨髓间充质干细胞移植后,对大鼠颈动脉粥样硬化的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-02/2008-05在福建省高血压研究所及福建医大附属第一医院中心实验室完成。 材料：4周龄雄性SD大鼠32只,8只用于制备骨髓间充质干细胞,剩余24只随机分为3组：模型对照组、空载体组、血管生长素1转染组,8只/组。 方法：以重组慢病毒为载体构建血管生长素1基因工程干细胞,以绿色荧光蛋白为报告基因,调整细胞密度为(1.0~2.0)× 1010 L-1。3组大鼠均采用球囊损伤法+高脂饮食构建颈动脉粥样硬化模型,造模后即刻,空载体组将未感染的0.1 mL骨髓间充质干细胞悬液注入颈总动脉外膜,分3点注射;血管生长素1转染组同法注入等量重组慢病毒感染的骨髓间充质干细胞悬液,饲养2个月后处死大鼠,取颈动脉组织。 主要观察指标：Western blot法检测转基因干细胞中血管生长素1的表达,荧光免疫组织化学及苏木精-伊红染色检测动脉内膜/中膜面积比。 结果：24只大鼠均进入结果分析。血管生长素1转染组表达血管生长素1蛋白,另2组无血管生长素1蛋白表达。移植后2个月,荧光显微镜下空载体组、血管生长素1转染组动脉壁内均可见绿色荧光蛋白阳性细胞;各组均可见动脉内膜增生,斑块形成;与模型对照组比较,空载体组内膜面积/中膜面积值无明显变化(P > 0.05),血管生长素1转染组内膜面积/中膜面积值明显减小(P < 0.05)。 结论：经血管生长素1基因修饰的骨髓间充质干细胞移植可明显减轻动脉粥样硬化程度。     

肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗兔股骨头坏死

背景：课题利用实验室自主研制、已获国家SFDA批准临床试验的重组肝细胞生长因子腺病毒感染骨髓间充质干细胞,结合肝细胞生长因子的促血管新生和抗细胞凋亡以及间充质干细胞的成骨功能,通过细胞治疗的手段进行骨损伤修复。 目的：探讨肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对兔股骨头坏死骨缺损的治疗效果。 设计、时间及地点：细胞-材料学体内实验,于2007-09/12在北京放射与辐射医学研究所和解放军66400部队骨病专科医院完成。 材料：清洁级26~28周龄新西兰大白兔18只,由北京开源兔业养殖场提供。骨基质明胶为上海骁博科技发展有限公司产品。 方法：采用贴壁法分离培养兔自体骨髓间充质干细胞,体外鉴定成骨和成脂肪能力。18只兔均建立双侧股骨头坏死骨缺损模型,随机分为3组,6只/组,单纯材料组缺损区仅填塞骨基质明胶,细胞-材料组填塞复合骨髓间充质干细胞的骨基质明胶,基因修饰细胞-材料组填塞复合Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞的骨基质明胶,各组细胞用量为 107个/缺损,骨基质明胶用量为27 mm3/缺损,修复3个月后取材进行组织学检查。骨髓间充质干细胞和Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞经荧光染料二醋酸琥珀酰酯羟基荧光素标记后,氯化钴处理72 h,流式细胞学分析细胞增殖情况。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的诱导分化,骨髓间充质干细胞对兔股骨头坏死的修复效果,Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞抗低氧损伤能力。 结果：培养的细胞在适当诱导条件下可分化为成骨和成脂肪细胞。修复后3个月组织学分析显示,单纯材料组仅见疏松的纤维肉芽组织填充;细胞-材料组可见致密的纤维肉芽组织填充,其间有较多的新生血管,但未见新生骨组织;基因修饰细胞-材料组多为软骨样组织填充,周围可见新骨带形成。各组Lane-Sandhu骨组织学评分比较差异有非常显著性意义(P < 0.01),其中基因修饰细胞-材料组评分最高,即Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞具备最佳的骨修复能力。培养体系中加入氯化钴后,已增殖的Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞比例显著高于未感染骨髓间充质干细胞(P < 0.001)。 结论：在骨缺损模型中Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞具有更强的抗低氧损伤能力,其在体内成骨能力优于未感染的骨髓间充质干细胞,提示肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植是应用于缺血性骨坏死的有效治疗途径。     

羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上骨髓间充质干细胞的增殖与分化

摘要 背景：最近胶原蛋白作为细胞体外三维立体支架材料被大量用于组织工程,但胶原蛋白支架材料机械强度低,很难承受较大外力,为此将胶原蛋白与羟基磷灰石制成复合支架材料,探索复合支架的生物相容性和生物活性。 目的：验证大鼠骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的增殖与分化情况。 方法：贴壁法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,分别在平板、胶原支架、羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上,观察3种条件下细胞的生长状况,四甲基偶氮唑盐法检测其增殖情况。培养14,21 d后,考察细胞碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量。 结果与结论：发现骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上铺展良好,其增殖率显著高于纯胶原蛋白支架上培养的细胞,并高于平板培养细胞。骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量明显高于纯胶原蛋白支架,高于平板培养。结果提示,羟基磷灰石/胶原蛋白复合材料能促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,并诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。 关键词：胶原蛋白;羟基磷灰石;骨组织工程;骨髓间充质干细胞;支架 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.014