TRPV4对高血压小鼠胸主动脉内皮细胞钙离子稳态的调节作用

目的:探讨瞬时受体电位香草素亚型4（transient receptor potential vanilloid type 4,TRPV4）在高血压小鼠胸主动脉内皮细胞中对于钙离子稳态的调节作用。方法:通过高盐饮食诱导小鼠高血压模型,分别在细胞和组织水平上使用钙离子荧光探针Flou-4/AM标记胸主动脉内皮细胞内钙,测定在TRPV4特异性激动剂GSK1016790A刺激下高盐饮食组和普通饮食组中细胞的钙离子浓度变化。结果:在胸主动脉内皮细胞的细胞和组织水平上通过使用GSK1016790A特异性激活TRPV4通道,普通饮食组和高盐饮食组细胞内钙离子浓度均增高（P<0.05）,但和普通饮食组相比较,高盐饮食组在GSK1016790A刺激下钙离子荧光强度增幅低于普通饮食组（P<0.05）。结论:TRPV4参与了小鼠胸主动脉内皮细胞钙稳态的调节,通过激活TRPV4,促进内皮细胞外钙离子内流进入胞内,从而维持细胞内钙离子的稳态,而在病理模型,高盐饮食诱导的高血压状态下,TRPV4调节小鼠胸主动脉内皮细胞钙内流的作用受损。     

猪肺动脉内皮细胞培养液对离体大鼠心脏的影响

为了探讨心肌再灌注损伤时,内皮细胞的损伤与心肌损伤之间的因果关系。本实验收集经缺氧再给氧处理的培养猪肺动脉内皮细胞培养液灌流Langendorff大鼠心脏(实验组),观察其对心脏功能与生化指标的影响,并设立相应的对照组。在20—30min的观察期内,与对照组比较实验组的冠脉灌注压(CPP),冠脉流出液中磷酸肌酸激酶(CPK)与乳酸脱氢梅(LDH)显著升高;心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)与ATPase活性明显下降,丙二醛(MDA)水平略高,心率(HR)减慢,心律失常,室内压最大上升速率( dp/dt_(max))降低;室内压最大下降速率(-dp/dtmax)与室内压(LVSP)无明显差异。结果表明:经缺氧再给氧处理的培养猪肺动脉内皮细胞培养液可引起离体大鼠心脏损伤,因此提示,心脏内皮细胞的损伤可能是心肌再灌注损伤的起因。     

小牛肺动脉内皮细胞的克隆培养

利用肿瘤细胞具有分泌刺激内皮生长的因子，将人肺腺癌Ａ５４９细胞培养液与新鲜培养液１：１混合制备内皮细胞克隆培养液，采用有限稀释法对原代小牛动脉内皮细胞克隆培养，使长期培养内皮细胞纯度达到１００％，而细胞的增殖能力及分泌ＮＯ的能力无明显改变。     

人腹膜微血管内皮细胞的原代培养

目的 分离和培养人腹膜微血管内皮细胞.方法 取非炎症且非转移性肿瘤患者施行腹部外科手术的大网膜组织,经Ⅰ型胶原酶消化,两次筛网过滤、离心等步骤获取人微血管段,接种24 h待内皮细胞从微血管段爬出贴壁后,去除微血管段获得内皮细胞进行传代培养.组织形态学观察及免疫组化法鉴定所培养的细胞.结果 运用此法进行的原代培养,血细胞在换液和传代过程中被去除,成纤维细胞污染被减至最少;组织形态学观察显示内皮细胞呈铺路石样生长,免疫组化鉴定表明Ⅷ因子阳性;证实所培养的细胞为人腹膜微血管内皮细胞,其纯度较高,生长状态良好.结论 实验成功分离和培养了人腹膜微血管内皮细胞,为体外研究腹膜透析的病理生理学改变,提供了细胞来源.     

人腹膜微血管内皮细胞的原代培养

目的分离和培养人腹膜微血管内皮细胞。方法取非炎症且非转移性肿瘤患者施行腹部外科手术的大网膜组织,经Ⅰ型胶原酶消化,两次筛网过滤、离心等步骤获取人微血管段,接种24 h待内皮细胞从微血管段爬出贴壁后,去除微血管段获得内皮细胞进行传代培养。组织形态学观察及免疫组化法鉴定所培养的细胞。结果运用此法进行的原代培养,血细胞在换液和传代过程中被去除,成纤维细胞污染被减至最少;组织形态学观察显示内皮细胞呈铺路石样生长,免疫组化鉴定表明Ⅷ因子阳性;证实所培养的细胞为人腹膜微血管内皮细胞,其纯度较高,生长状态良好。结论实验成功分离和培养了人腹膜微血管内皮细胞,为体外研究腹膜透析的病理生理学改变,提供了细胞来源。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的 建立稳定的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)体外培养模型,并对其生物学特性进行初步研究.方法 取Sprague-Dawley大鼠脑组织,通过匀浆、酶消化和梯度离心获得纯化的脑微血管段后,接种于涂布明胶的培养瓶进行原代培养;培养的细胞采用相差显微镜形态学观察、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定;采用跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance, TEER)检测单层细胞通透性;Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法测定细胞生长曲线.结果 细胞从贴壁的脑微血管段周围长出,呈短梭形和多角形,区域性单层生长,5～7 d细胞融合,经Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学检测证实培养的细胞是血管内皮细胞,原代培养的脑微血管内皮细胞表现出很强的屏障特性,随着传代次数的增加脑微血管内皮细胞的跨内皮阻抗减弱.结论 提示该方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养,原代培养的脑微血管内皮细胞是研究脑部微血管和血脑屏障的可靠技术手段.     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的探索一种简便可行的脑微血管内皮细胞(brainmicrovascularendothelialcells,BMECs)的培养方法,为研究BMECs在脑血管疾病中的重要作用提供技术支持.方法分离出生后1～4 d内的Wistar大鼠乳鼠大脑皮质,用植块法培养BMECs;用倒置显微镜观察BMECs的形态以及从皮质块细胞迁出的过程;通过形态学观察及第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光细胞化学法对培养细胞进行鉴定.结果大脑皮质块植块法培养的大鼠BMECs呈单层贴壁生长,细胞形态以长梭形、多角形、三角形、四边形为主,呈典型的"铺路石"样征象,第3代细胞经免疫荧光染色,第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,阳性率达95%以上.结论植块法具有经济、简便、要求条件不高,可成功培养高纯度的脑微血管内皮细胞的优点.     

人脐静脉内皮细胞的原代培养

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便的体外培养方法。方法采用不同浓度的Ⅱ型胶原酶(0.05%,0.1%和0.2%)对HUVEC进行灌注,并分别孵育不同的时间(10min,13min,15min和18min)进行消化,观察细胞的形态、数量以及生长融合情况。结果采用0.1%的胶原酶消化10-13min为最佳条件,经光学显微镜观察培养的细胞数量较多,生长、繁殖状态良好,培养3d左右细胞可达到融合状态。结论本实验建立的胶原酶法消化HUVEC培养方法简便,细胞获得量较多且生长状态良好。     

大鼠肺动脉内皮细胞的简易培养鉴定

目的：探索一种简单的方法培养大鼠肺动脉内皮细胞（ＲＰＡＥＣｓ）方法：分离大鼠肺动脉，将共切成步块，使其内皮面贴于培养瓶，用含有２０％新生牛血清，肝索９０μｇ／ｍｌ，Ｌ－谷氨酰胺４ｍｍｏｌ／Ｌ，青霉素１００ｕ／ｍｌ和链霉素１００ｕｇ／ｍｌ的ＲＰＭＩ－１６４０培养基培养，结果：培养２４ｈ后ＲＰＡＥＣｓ从动脉块游出，７２ｈ后将动脉块移去，ＲＰＡＥＣｓ于６～１０ｄ融合成单层细胞，这些细胞具有规律的鹅卵石样     

颅通定对猪肺动脉平滑肌细胞胞浆游离钙浓度的影响

采用钙荧光探针Fura－2／AM观察了颅通定对培养的猪肺动脉平滑肌细胞胞浆游离钙浓度（[Ca2＋]i）的影响。结果发现：颅通定可显著抑制高钾和BayK8644所致的[Ca＋]i增加，并且有剂量一效应关系，对静息状态[Ca2＋]i无明显影响，其作用与维拉帕米相似，但较弱。提示：颅通定降低平滑肌细胞[Ca2＋]i的作用与其抑制电压依赖性钙通道有关，此为其降压作用机制之一。     

细菌脂多糖对骨髓瘤细胞胞浆游离钙的影响

以钙离子荧光指示剂Quin 2测定胞浆游离钙,研究细菌脂多糖对骨髓瘤细胞胞浆游离钙浓度的影响。骨髓瘤细胞与脂多糖孵育后,胞浆游离钙浓度显著增高,植物血凝素升高胞浆游离钙浓度的作用受到明显抑制。十四脂酰佛波乙酸酯对骨髓瘤细胞胞浆游离钙浓度无影响,但对植物血凝素升高胞浆游离钙浓度的作用有明显抑制。提示脂多糖引起细胞钙平衡失调,并干扰细胞钙信号的产生。     

17β-雌二醇诱导内皮型一氧化氮合酶活性增高及其与细胞内钙的关系

目的　研究 17β -雌二醇 (E2 )对新生小牛主动脉血管内皮细胞 (BAECs)中内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)活性的长期基因效应 ,并进一步探讨胞内钙信号途径在其中的作用。方法　采用培养的BAECs,同位素法测定eNOS的活性 ;Westernblot检测eNOS蛋白表达 ;荧光分光光度计法检测E2 对细胞内钙的影响。结果　 (1)E2 (0 .0 0 1,0 0 1,0 .1,1μmol/L)作用于BAECs 4 8h ,使eNOS活性分别增加 130 %± 2 7% ,178%± 19% ,14 2 %± 2 0 % ,14 4 %± 2 7%。E2 激活eNOS活性的作用被雌激素受体拮抗剂Tamoxifen(0 .1μmol/L)所阻断 ;(2 ) 0 .0 1μmol/LE2 作用于BAECs 1h对eNOS蛋白表达无明显影响 ,而作用 2 4h和 4 8h分别使eNOS蛋白表达增加了 2 76 %± 36 %和374 %± 2 0 % ;Tamoxifen明显抑制E2 处理 4 8h后诱导的eNOS蛋白表达 ,抑制率为 6 6 5 %± 7 4 % ;(3) 0 .0 1μmol/LE2 作用BAECs 4 8h ,分别使静息 [Ca2 + ]i增加了 70 .3± 2 1.5nmol/L ,使 10mmol/LATP诱导的BAECs[Ca2 + ]i峰值增加了 2 4 0 .2± 6 8 2nmol/L ,ATP诱导的 [Ca2 + ]i增加值 (峰值与静息值之差 )增加了 170 .5± 4 8.9nmol/L。结论　雌激素可通过长期基因效应而激活eNOS ,至少部分通过核ER介导 ,并与胞内钙动员有关     

低氧对肺动脉内皮细胞一氧化氮合酶及细胞间黏附因子-1表达的影响

目的通过检测低氧状态血管内皮细胞一氧化氮合酶（eNOs）及细胞间黏附因子（ICAM1）表达的变化．探讨低氧对血管内皮细胞功能的影响。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及Western blot测定低氧条件下不同时间点大鼠动脉内皮细胞中eNOS、ICAM-1 mRNA及蛋白质的表达变化情况。结果同常氧组相比，低氧1h时eNOS、IcAM-1 mRNA及蛋白表达无变化．而6、12、24h时eNOS、ICAM-1mRNA及蛋白表达明显升高（P〈0.05），但eNOS mRNA与ICAM-1mRNA的表达变化在同一时间点并不一致。结论低氧状态下血管内皮细胞eNOS与ICAM-1表达升高，可能参与了低氧性肺血管疾病的发病机制。     

钙通道、钙调蛋白拮抗剂对内康素-1分泌的影响

观察钙通道、钙调蛋白拮抗剂对人脐带静脉内皮细胞分泌内皮素-1（ET－1）的作用，结果表明钙通道拮抗剂异搏定（5．5×10－6及5．5×10-5mol／L）、硫氮办公酮（2．4×10-4mol／L）和钙调蛋白拮抗剂氯丙嗪（3．1×10-5及3．1×10-4mol/L）、小檗胺（1．6×10-5及1．6×10-4mol／L）均能明显抑制内皮细胞分泌ET－1，提示ET－1的分泌或释放受钙通道及细胞内钙调蛋白的调节。此外，硝酸甘油也明显抑制ET－1的分泌，提示一氧化氮有抑制ET－1分泌的作用。     

低氧诱导猪肺动脉内皮细胞间质转化的鉴定及其生物学意义

目的原代培养猪肺动脉内皮细胞,探讨缺氧环境对肺动脉内皮细胞的影响,为肺部疾病提供体外研究模型。方法将猪原代肺动脉内皮细胞分为两组分别置于常氧和低氧环境中培养1、4和7 d,采用免疫荧光法、Western blot及RT-PCR检测各组细胞内皮细胞和间质细胞特异性标志蛋白及mRNA表达。结果常氧组肺动脉内皮细胞呈现典型的鹅卵石样排列,低氧培养的内皮细胞出现长梭形外观。免疫荧光法观察发现低氧培养的内皮细胞开始表达间质细胞抗原α-SMA,且随着低氧时间的延长,α-SMA表达量逐渐增多(P<0.01)。Western blot结果显示与常氧组相比,低氧组内皮细胞VE-cadhrein蛋白表达逐渐下降,α-SMA蛋白表达逐渐上升,RT-PCR结果与此一致。结论低氧促进内皮细胞向间质细胞转化,可能参与体内多种疾病的发生。     

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进

目的 改进SD大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)原代培养方法,以获得纯化的大鼠PMVECs。方法 对组织块法培养PMVECs过程中的组织取材、植块贴壁、培养基配制、传代培养进行改进包括:在麻醉前提前注射肝素钠;利用腹腔放血,待大鼠停止呼吸后剪开胸腔;改进操作以及试剂中加入双抗以降低污染率;原代培养48 h即取出组织块;进行再次消化去除成纤维细胞;异硫氰酸标记的植物凝集素（FITC-BSI）鉴定培养的PMVECs。培养后在倒置显微镜下观察细胞形态。结果 原代培养的细胞呈现为多角形或短梭形,呈单层铺路石样排列的典型结构。随着细胞传代或培养条件的改变,细胞形态发生变化,可呈长梭形,漩涡状排列。FITC-BSI结合实验呈绿色荧光,阳性率达到90%以上。结论 通过改进分离及培养方法可获得生长状态良好、纯度高且能够稳定传代培养的PMVECs。     

磷脂酶A_2对培养的小牛肺动脉内皮细胞的损伤及氯喹的保护作用

本研究观察了磷脂酶A_2(PLA_2)对培养的小牛肺动脉内皮细胞的损伤作用和氯喹的保护作用。结果发现:PLA_2可使膜通透性升高,硝酸镧颗粒在胞浆内沉着的数量和范围随PLA_2浓度增加和作用时间延长而增加,乳酸脱氢酶释放率、培养液血管紧张素转化酶活性、培养液和细胞内二醛含量显著高于正常对照组、PLA_2 +氯喹组和氯喹组。氯喹对PLA_2造成的细胞损伤有保护作用。     

大鼠肺动脉平滑肌细胞膜钙激活氯通道与细胞质钙的关系及意义

目的观察大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）膜钙激活氯通道（ClCa）与细胞质钙的关系及意义。方法大鼠PASMCs获取采用急性酶分离法。荧光光度法检测细胞质内游离钙离子浓度（[Ca^2＋]i）；全细胞膜片钳技术测定PASMCs钙激活氯电流（ICl（Ca））；等长张力测定法观察ClCa阻滞剂尼氟灭酸（NFA）和Indaryloxyacetic acid（IAA-94）对大鼠肺动脉张力的影响。结果环匹阿尼酸（CPA）和苯福林（PE）均可引起[Ca^2＋]i升高；升高的[Ca^2＋]i可以引出ICl（Ca）；NFA和IAA-94可以舒张CPA、PE引起的肺动脉环收缩。结论生理条件下大鼠PASMCs的ClCa是钙依赖性的；细胞外Ca^2＋内流及细胞质内Ca^2＋释放均可激活该通道，其参与了血管活性药诱导的肺动脉收缩。