同种异体脱钙骨基质的组织工程学特性

背景:由骨衍生的支架材料无论形态学和力学特征,具有合成材料无可比拟的优势,脱钙骨基质具有和自体骨最接近的三维结构,同时以Ⅰ型胶原为主,胶原是细胞黏附和生长的良好支架。目的:从组织工程学角度研究同种异体脱钙骨基质的生物学特性,探讨其作为软骨组织工程支架材料的可行性。方法:据Urist描述的方法制备青紫蓝兔同种异体脱钙骨基质,扫描电镜观察脱钙骨基质的超微结构,测定其孔径、孔隙率和降解率,测定同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞的黏附率,兔体内植入法评价同种异体脱钙骨基质的组织相容性。结果与结论:脱钙骨基质呈多孔海绵状三维结构,孔径在210～320μm之间,孔隙率为92%,体外降解12周降解率达90%以上,脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养第2,4,6天的黏附率分别为(51.50±2.30)%,(94.13±2.14)%和(87.24±1.75)%。兔体内植入6周后脱钙骨基质周围界面未引起明显的炎症和排斥反应,并形成软骨样结构和少量骨组织。说明脱钙骨基质具有适宜的三维多孔结构,降解时间和软骨形成时间同步,同种异体脱钙骨基质与种子细胞黏附率高,与细胞组织相容性好,能满足软骨组织工程对支架材料的要求,是理想的软骨组织工程的支架材料。     

新型组织工程椎间盘纤维环支架的制备与性能检测

背景：以组织工程技术修复退变椎间盘,目前的研究多集中在如何修复摘除的髓核组织,然而髓核组织工程方法无法完整重建椎间盘的结构和功能,所以相应的纤维环组织工程被认为是组织工程椎间盘治疗策略的主要限制因素之一。 目的：制备天然猪脱细胞脱钙骨基质明胶,并验证其作为组织工程椎间盘纤维支架的可行性。 方法：取猪股骨近端松质骨,用环钻钻取直径10 mm、内径5 mm、厚3 mm的中空环状骨,高压水枪冲洗,进行脱脂、脱钙、脱细胞等相关处理,制成环状的支架材料。对材料进行大体、组织学、光镜、扫描电镜观察,并对支架的吸水率、孔隙率、生物力学参数等进行检测。分离培养犬骨髓间充质干细胞,采用MTT法分析支架浸提液毒性。 结果与结论：支架为乳白色,中空环状,质地柔软的多孔结构。苏木精-伊红染色示组织无细胞结构残留。光镜及扫描电镜示支架孔隙均匀,孔隙相通,平均孔径为(401.4±13.1) μm,孔隙率为(62.12±1.52)%,吸水率为(409.77±11.34)%。生物力学结果示支架的弹性模量为(47.75±6.32) kPa。MTT法显示不同浓度支架浸提液与对照 DMEM 培养液吸光度值比较,差异无显著性意义(P > 0.05),支架无细胞毒性。提示猪脱细胞脱钙骨基质明胶去细胞彻底,具有良好的孔径、孔隙率及生物力学强度,并且无毒,具备良好的生物相容性,可作为组织工程椎间盘纤维环支架材料。     

新型脱细胞骨基质材料的制备及理化评估

背景：传统的结构性天然骨脱细胞的方法存在许多不足之处。 目的：用新的理化方法对结构性骨块进行脱细胞处理制作新型骨支架材料的可行性,并检测其理化性能。 方法：以股骨头负重区结构性骨块为原料,高压水枪冲洗,继而利用Triton-100、脱氧胆酸钠等进行脱细胞等理化处理,制备新型脱细胞骨基质材料,并对支架进行大体、组织学、扫描电镜、Micro-CT观察、生物力学等相关检测。 结果与结论：新型脱细胞骨基质材料保留了骨的细胞外基质成分,脱细胞彻底,扫描电镜及Micro-CT观察显示支架具备三维多孔网状结构系统,具有天然骨的孔径和孔隙率;生物力学测试脱细胞组支架的弹性模量为(552.56±58.92) MPa,强度为(11.34±3.49) MPa,与新鲜骨的弹性模量及强度比较,差异无显著性意义(P > 0.05),可作为骨组织工程支架的良好载体。     

羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性

背景:羟基丁酸-羟基辛酸共聚体[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyoctanoate),PHBHOx]是一种新型的多聚羟基烷酸类材料,具有优良的可塑性、生物相容性、生物可降解性等性能,但同其他酯类材料相似,PHBHOx亲水性能较差,单纯PHBHOx材料支架细胞黏附性能明显不足。目的:观察羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性。方法:取新鲜猪膝关节表面透明软骨,采用非离子型去污剂TritonX-100、低渗Tris-HCl以及Dna酶和Rna酶等进行脱细胞处理。低温粉碎后与PHBHOx以不同比例复合,采用溶剂浇铸-颗粒沥滤技术制备支架。分离培养猪关节软骨细胞,进行细胞-支架黏附实验并通过MTT比色法和扫描电镜观察软骨细胞在支架上的黏附存活情况。结果与结论:PHBHOx/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附率较对照组显著提高,软骨细胞在支架上黏附紧密,生长良好。提示复合脱细胞软骨基质可以明显提高单纯PHBHOx支架的细胞黏附性能。     

脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相半月板支架的制备及其生物相容性的研究

目的成功制备脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相半月板支架,并与半月板纤维软骨细胞结合研究其生物相容性。方法联合利用湿法粉碎、差速离心等物理方法和胃蛋白酶等化学方法制备脱细胞半月板细胞外基质,利用改良Urist法制备脱钙骨基质,并利用灌注、冷冻干燥等方法分别制备脱细胞半月板细胞外基质支架、脱钙骨基质支架以及脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架等三种不同的支架,并从组织学、分子生物学、生物力学等方面研究三种支架的异同;原代培养兔半月板纤维软骨细胞,并将P3代的纤维软骨细胞分别种植在以上三种支架上,利用扫描电镜、死/活细胞染色等观察细胞生长情况,并分别在3、7、14 d时检测纤维软骨细胞的增殖情况以及分泌胶原和糖胺多糖的含量。结果物理化学联合法脱细胞可以去除半月板中绝大部分的细胞成分,并且很好地保留正常半月板细胞外基质的胶原以及糖胺多糖成分;脱细胞半月板基质支架、脱钙骨基质支架以及脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架三种支架均具有良好的孔隙率,合适的孔径大小,扫描电镜结果显示纤维软骨细胞可以很好地在支架上生长,死/活细胞染色结果显示三种支架均可以维持良好的细胞活性,但是脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架具有更好的生物力学特性,脱细胞半月板基质支架和脱钙骨基质/脱细胞半月板基质双相支架在促进纤维软骨细胞增殖和维持细胞表型方面要比单纯脱钙骨基质支架更优。结论脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架具有较好的生物力学特性,良好的生物相容性,可以促进纤维软骨细胞增殖,同时也可以维持纤维软骨细胞的表型,是一种可以应用于组织工程半月板再生的支架。     

天然可降解脱钙骨基质材料复合脂肪干细胞的三维培养

背景:脱钙骨基质是一种常用的组织工程支架材料,脂肪干细胞是近年来发现的一种成体干细胞,二者均可自体取材,二者复合培养的研究还未见报道。目的:观察脂肪干细胞与脱钙骨基质复合后三维培养的生长、增殖情况。方法:无菌切取兔腹股沟皮下脂肪垫,采用Ⅰ型胶原酶搅拌消化法分离培养原代脂肪干细胞,系列传代传至第3代,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况,免疫荧光细胞化学染色检测细胞表面抗原的表达。切取兔髂骨,制备脱钙骨基质。取第3代脂肪干细胞,与脱钙骨基质复合后共培养,1周后扫描电镜观察细胞黏附和生长情况,2周后石蜡包埋切片进行苏木精-伊红染色。结果与结论:自兔皮下脂肪分离培养获得的脂肪干细胞增殖迅速,第3代脂肪干细胞表面抗原CD44呈阳性表达,CD34为阴性;制备的脱钙骨基质为三维立体多孔结构,具有良好的可塑性,并有一定的机械强度。复合培养后电镜扫描、苏木精-伊红染色显示,细胞在脱钙骨基质表面和孔隙内黏附生长良好,并能继续增殖和分泌胞外基质。结果提示脂肪干细胞与脱钙骨基质复合共培养生长增殖良好,并能分泌细胞外基质。     

脱钙骨基质与生物蛋白胶复合载体修复兔关节软骨缺损

背景:应用组织工程学方法修复软骨组织缺损,需要有合适的载体,在发挥承载作用的同时对软骨细胞起到良好的固定作用。目的:观察利用脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体修复实验性兔关节软骨缺损的可行性及有效性。方法:制备脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体。建立兔关节软骨缺损模型,编号后,将42只新西兰大白兔随机分为3组:载体复合细胞组(n=15):兔膝关节软骨缺损区植入含有软骨细胞的脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体;单纯载体组(n=15):植入不含细胞的复合载体;空白对照组(n=12):不进行任何植入处理。依照分组,分别于术后4,8,12周取材,进行大体、组织学、甲苯胺蓝染色观察,并做Wakitani评分,观察各组动物关节缺损修复效果。结果与结论:载体复合细胞组12周时可以修复膝关节软骨的缺损,并且以透明软骨组织为主,修复效果明显强于单纯载体组与空白对照组;Wakitani评分在各个时间均优于其他两组(P0.05)。提示脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体负载软骨细胞可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损。     

脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养关节腔内的成软骨活性

背景：将骨髓间充质干细胞附着到支架材料上再植入关节软骨缺损处,细胞不但不消失,而且可形成新的软骨。 目的：观察同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养在关节内的成软骨活性。 方法：在54只青紫蓝兔单侧膝关节制作关节软骨全层缺损模型,随机分组：实验组在缺损处植入自体骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质复合物,对照组缺损处仅植入同种异体脱钙骨基质,空白对照组未植入任何物质。 结果与结论：植入后12周,实验组缺损处修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟,修复组织与软骨下骨结合牢固;修复组织的细胞为透明软骨样细胞,柱状排列,Ⅱ型胶原染色阳性,与周围软骨及软骨下骨整合良好,且实验组组织学评分优于对照组和空白对照组 (P < 0.01)。对照组缺损处修复组织呈纤维样,与周围软骨未结合,空白对照组缺损区无修复组织,两组均无Ⅱ型胶原染色阳性表达。表明同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养后植入膝关节可形成软骨样组织,有效修复关节软骨缺损。     

应用猪主动脉脱细胞基质制备新型组织工程血管支架:生物相容性及力学性能评价(英文)

背景:组织工程血管构建的关键依赖于理想的支架。猪血管作为组织工程血管构建材料已有广泛应用,但其较高的免疫原性及较差的力学强度限制了该材料作为组织工程支架的应用。目的:应用猪主动脉脱细胞基质制备一种新的具有良好机械性能及生物相容性的组织工程血管支架。方法:对猪主动脉进行脱细胞处理和热交联改性制备脱细胞血管基质支架,采用苏木精-伊红染色及生物力学分析评估其脱细胞效果及血管基质的力学性能。将人脐静脉血管内皮细胞接种于脱细胞血管基质支架中进行体外培养,评估其生物相容性。结果与结论:用1%的TritonX-100溶液处理猪主动脉84h可完全脱除血管细胞,同时不破坏血管基质结构;经真空下120℃热交联处理12h,脱细胞基质的拉伸断裂强度得到明显提高,达到1.70MPa。在该改性血管基质支架上接种人脐带静脉内皮细胞体外培养7d,扫描电镜显示内皮细胞呈现典型的血管内皮层状结构。表明猪主动脉经过脱细胞处理能够维持血管基质完整,冷冻干燥和真空热交联处理可有效提高其拉伸强度,且对血管内皮细胞具有良好的相容性。     

兔纤维环干细胞与猪脱细胞纤维环基质的生物相容性

背景:脱细胞纤维环基质和纤维环干细胞均来源于纤维环组织,二者复合构建的组织工程复合物可能具有更好的生物相容性。目的:将兔的纤维环干细胞和猪的脱细胞纤维环基质进行体外共培养,观察细胞在脱细胞基质支架上的生长状态。方法:制备猪脱细胞纤维环基质,通过扫描电镜和DAPI染色观察材料制备效果,傅里叶红外光谱仪鉴定基质的成分;分离和培养兔纤维环干细胞,将第1代纤维环干细胞种植于脱细胞纤维环基质表面,行细胞骨架染色,倒置免疫荧光显微镜和扫描电镜下观察细胞形态,并绘制细胞生长曲线。结果与结论:制备成的猪脱细胞纤维环基质呈白色半透明状,扫描电镜下为纤维网状结构,DAPI染色显示无细胞残留,红外光谱分析显示脱细胞纤维环基质主要成分是胶原蛋白。细胞在支架材料上生长第1,3,7天的细胞骨架染色显示细胞很好的黏附于支架表面,生长状态良好,表明脱细胞纤维环基质有着良好的生物相容性,纤维环干细胞在其表面生长良好。     

纤维蛋白胶对骨髓间充质干细胞黏附作用的影响

目的：探讨纤维蛋白胶（FG）对骨髓间充质干细胞（MSCs）黏附作用的影响,以提高组织工程骨（TEB）成骨能力。方法：将成骨诱导后人MSCs体外与同种异体的脱钙骨基质（DBM）复合构建组织工程骨,根据DBM中是否加入FG分为两组,A组加入FG,B组未加入FG。于构建后10h计算细胞黏附率,24h后用荧光显微镜观察MSCs在支架材料上的黏附情况,3d、7d用扫描电镜观察比较两组种支架材料的MSCs生长与增殖的差异。结果：体外构建10h后,A组的细胞黏附率为（95．3±9．2）％,B组为（89．2±8．7）％,两者之间差异具有统计学意义（P〈0．05）。24h后荧光显微镜下见A组上黏附的细胞数量明显多,部分呈簇状和团状较均匀地密布;而B组细胞数量较少,呈散在非均匀分布。构建后3dA组网孔间出现细胞外基质,至第7d基质变得稠密;B组细胞外基质较少。结论：纤维蛋白胶与MSCs具有良好的组织相容性,能明显促进MSCs的黏附生长。     

复合CTLA4的脱钙骨基质抑制T淋巴细胞免疫能力和增强骨髓间充质干细胞迁移能力的体外作用研究

目的分析复合细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)的脱钙骨基质(DBM)对T淋巴细胞免疫能力和骨髓间充质干细胞(BMMSCs)迁移能力的体外调控作用。方法通过特殊负压灌注装置将纤维蛋白凝胶复合CTLA4溶液灌注到DBM,构建复合CTLA4的DBM,并通过扫描电镜观察其微观形态。分离外周血单核细胞(PBMCs),通过植物血凝素(PHA)激活T淋巴细胞来构建免疫激活微环境。将复合CTLA4的DBM在培养基中孵育5、10、20、30、40 d,ELISA检测CTLA4的浓度,由此计算CTLA4的累积释放率。将PHA预处理的PBMCs与复合CTLA4的DBM进行Transwell共培养,ELISA检测培养基中IL-2和IFN-γ的含量。分离BMMSCs,Transwell共培养法分析复合CTLA4的DBM对BMMSCs增殖和迁移能力的影响。结果复合CTLA4的DBM结构完整有序,具有良好的三维网络结构。复合材料中CTLA4在5、10、20、30、40 d的累积释放率分别为(11.3%±1.9%)、(27.9%±3.7%)、(48.4%±3.6%)、(62.8%±3.8%)和(83.0%±2.5%)。与单纯的DBM相比,与复合CTLA4的DBM共培养可显著减少培养基中IL-2(P=0.0004)和IFN-γ(P=0.0007)的含量,增强BMMSCs的增殖能力(P=0.0006)和迁移能力(P=0.0004)。结论复合CTLA4的DBM在体外环境下具有抑制T淋巴细胞免疫能力和增强BMMSCs迁移能力的作用。     

A composite demineralized bone matrix – Self assembling peptide scaffold for enhancing cell and growth factor activity in bone marrow

The need for suitable bone grafts is high; however, there are limitations to all current graft sources, such as limited availability, the invasive harvest procedure, insufficient osteoinductive properties, poor biocompatibility, ethical problems, and degradation properties. The lack of osteoinductive properties is a common problem. As an allogenic bone graft, demineralized bone matrix (DBM) can overcome issues such as limited sources and comorbidities caused by invasive harvest; however, DBM is not sufficiently osteoinductive. Bone marrow has been known to magnify osteoinductive components for bone reconstruction because it contains osteogenic cells and factors. Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are the gold standard for cell seeding in tissue-engineered biomaterials for bone repair, and these cells have demonstrated beneficial effects. However, the associated high cost and the complicated procedures limit the use of tissue-engineered bone constructs. To easily enrich more osteogenic cells and factors to DBM by selective cell retention technology, DBM is modified by a nanoscale self-assembling peptide (SAP) to form a composite DBM/SAP scaffold. By decreasing the pore size and increasing the charge interaction, DBM/SAP scaffolds possess a much higher enriching yield for osteogenic cells and factors compared with DBM alone scaffolds. At the same time, SAP can build a cellular microenvironment for cell adhesion, proliferation, and differentiation that promotes bone reconstruction. As a result, a suitable bone graft fabricated by DBM/SAP scaffolds and bone marrow represents a new strategy and product for bone transplantation in the clinic.     

魔芋葡甘聚糖/透明质酸共混膜的体外细胞生物相容性

背景：高分子材料透明质酸与魔芋葡甘聚糖均可用于防治术后粘连。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞与魔芋葡甘聚糖-透明质酸共混膜复合培养的生物相容性。 方法：取第3代兔骨髓间充质干细胞与魔芋葡甘聚糖-透明质酸共混膜体外复合培养,倒置显微镜和扫描电镜观察复合程度,MTT法检测细胞增殖。体外定向外诱导魔芋葡甘聚糖-透明质酸共混膜上的骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,油红O染色检测其分化效果。 结果与结论：骨髓间充质干细胞与魔芋葡甘聚糖-透明质酸共混膜修复材料复合良好,倒置显微镜和扫面电镜观察均可见细胞在共混膜上良好黏附与增殖;体外定向诱导魔芋葡甘聚糖-透明质酸共混膜上的骨髓间充质干细胞可向脂肪细胞分化,具有成脂潜能。说明魔芋葡甘聚糖-透明质酸共混膜与骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性。     

Effects of preparation methods on the bone formation potential of apatite-coated chitosan microspheres

To investigate the effects of preparation methods on the bone formation potential of apatite-coated chitosan microspheres, coacervate precipitation method and emulsion cross-linking method were chosen to prepare chitosan microspheres, and then apatite coatings were deposited using simulated body fluid. Rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) were seeded on these microspheres. Cell adhesion, proliferation, and differentiation potential were monitored. For in vivo analysis, some cell/microsphere constructs were implanted in the subcutaneous pockets of male Wistar rats. After 3, 6, 12 weeks, the samples were retrieved and stained with hematoxylin and eosin (HE). Some cell/microsphere constructs were implanted in the calvarial defects of rats. Micro-CT and HE analysis were performed to analyze the new bone formation. It was found that BMSCs on apatite-coated emulsion cross-linked microspheres (EM1) exhibited better proliferation and differentiation than cells on apatite-coated coacervate-precipitated microspheres. The in vivo results showed that no bone was observed in ectopic areas. While in calvarial defects, both histological slices and Micro-CT images demonstrated that a substantial amount of new bone was formed in the EM1/BMSCs construct. These data suggest that preparation methods do exert great influence on the in vitro cell behaviors and in vivo orthotopic bone regeneration of apatite-coated chitosan microspheres. Appropriate method should be considered when preparing chitosan microspheres for bone tissue engineering scaffold.     

物理联合化学或化学方法处理去抗原异种松质骨支架与骨髓间充质干细胞的细胞相容性**

背景：研究证明去抗原异种松质骨支架具有良好的理化性能和三维立体多孔结构,但应用于临床还需要考虑其安全性和生物相容性。 目的：比较物理联合化学及化学方法处理去抗原异种松质骨支架与羊骨髓间充质干细胞的细胞相容性。 方法：用梯度密度离心法分离培养羊骨髓间充质干细胞,四甲基偶氮唑盐比色法检测物理联合化学及化学方法处理去抗原异种松质骨支架材料对骨髓间充质干细胞增殖的影响。取第3代骨髓间充质干细胞,接种在两种支架上共同培养,倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在两种支架材料上的形态、黏附、生长和增殖情况。 结果与结论：物理联合化学组细胞毒性为0或1级,细胞能在材料上良好地黏附、增殖、生长,细胞活性未受到支架材料的影响。化学组细胞毒性为3级,细胞在材料上生长受到抑制,支架孔隙内无细胞黏附。提示经过物理联合化学处理的去抗原异种松质骨支架材料与羊骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性;单纯经过化学处理的支架材料生物相容性较差,不符合生物材料安全性标准。     

Differentiation of mesenchymal stem cells in chitosan scaffolds with double micro and macroporosity

Bone Marrow mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into osteoblasts to regenerate damaged bone tissue using tissue engineering techniques. In this study, we examine the use of chitosan scaffolds with double pore structure prepared by an innovative method that combines freeze gelation (that produces micropores) and particle leaching out technique (that produces interconnected spherical macropores) seeking to enhance the osteogenic differentiation of goat bone marrow stromal cells (GBMSCs). The double pore architecture of the scaffold was characterized by scanning electron microscopy (SEM), microcomputed tomography and confocal laser scanning microscopy. The obtained hierarchical pore structure allowed very efficient seeding of GBMSCs that are able to occupy the whole volume of the scaffold, showing good adhesion and proliferation. GBMSCs were differentiated into osteoblasts as indicated by alkaline phosphatase activity and osteocalcin expression. The results of this study demonstrate that chitosan scaffold may be promising biomaterial for bone regeneration.