结核分枝杆菌gyrA基因突变与氟喹诺酮类药物体外最低抑菌浓度的关系

目的 探讨结核分枝杆菌gyrA基因突变与氟喹诺酮类药物体外最低抑菌浓度(MIC)的关系.方法 收集640例痰结核分枝杆菌阳性临床分离株,用探针熔解曲线法筛选gyrA基因耐药决定区突变株,对其gyrA基因耐药决定区进行测序,并检测氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星及加替沙星对不同突变位点菌株的MIC,分析其差异.结果 探针熔...     

PCR-探针熔解分析法检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药基因突变的临床应用评价

目的评价PCR-探针熔解分析法(PMAA)检测结核分枝杆菌(MTB)氟喹诺酮(FQ)药物耐药性的临床应用价值。方法采用常规比例法和PCR-PMAA对509株MTB临床分离株进行FQ药物敏感性试验。对69株比例法和(或)PCR-PMAA法检测耐药以及440株两法检测均敏感的MTB菌株中抽取的55株菌株,进行FQ药物耐药相关基因gyrA和gyrBPCR-DNA测序。结果以常规比例法为标准,PCR-PMAA检测FQ药物耐药性的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值、符合率及约登指数分别为97.01%、99.55%、97.01%、99.55%、99.21%及0.97。比例法和(或)PCR-PMAA检测耐药的69株中,经DNA测序证实44株gyrA94位密码子GAC→AAC(D→N)或CAC(H)或GGC(G)或GCC(A)突变;4株gyrA91位密码子TCG→CCG(S→P)突变;19株gyrA90位密码子GCG→GTG(A→V)或AAG(K)突变;1株gyrB500位GAC→AAC(D→N)突变;1株在测序范围未见突变。55株两法检测均敏感样品DNA测序结果证实,gyrA和gyrB基因均未见耐药相关的基因位点突变。结论 ...     

结核分枝杆菌对氧氟沙星的耐受程度与gyrA基因突变的相关性分析

目的以氧氟沙星为例,探讨阈值的划分对实验室早期检测出耐氧氟沙星结核分枝杆菌的影响。结合DNA序列分析探讨gyrA基因点突变与结核分枝杆菌对氧氟沙星耐受程度的相关性。方法 （1）在含氧氟沙星改良罗氏培养基上检测101株结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星的敏感性。（2）测序以检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变的特征。结果 （1）52株耐氧氟沙星5.0μg/ml的临床分离株中,17株能在含氧氟沙星10.0μg/ml的改良罗氏培养基上生长（约占32.69%）,49株对氧氟沙星5.0μg/ml敏感的临床分离株中,有2株能在含氧氟沙星2.0μg/ml的改良罗氏培养基上生长（约占4.08%）。（2）基因扩增产物测序发现;耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变主要发生第90、91和94位点上,有10株在不同的gyrA基因位点上发生了碱基缺失或插入的变异,101株被检测的结核分枝杆菌临床分离株中,发生在第95位点的碱基突变率为100%。结论 （1）判定耐药结核分枝杆菌上、下限的阈值对耐药结核菌的早期检出具有重要的作用。（2）发生在耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因上的点突变是多变的,但与结核分枝杆菌对氧氟沙星的耐受程度没有明显的相关性。     

结核分枝杆菌喹诺酮类耐药基因研究进展

日益增多的耐喹诺酮类结核分枝杆菌给结核病疫情的控制带来了巨大挑战,深入研究结核分枝杆菌喹诺酮类耐受机制便成为应对挑战的关键.药物靶基因突变是导致结核分枝杆菌喹诺酮类耐受的主要因素,近年来该方面的研究逐步受到重视并取得了一些进展,本文特对此进行述评.     

针对gyrA基因突变的反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的研究

目的 建立快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的反向斑点杂交(reverse dot blot hybridization,RDBH)技术,并观察其效果。方法 针对结核分枝杆菌gyrA基因序列及常见的突变位点,分别设计1条野生型和7条突变型探针,建立RDBH技术,对临床分离结核分枝杆菌菌株进行喹诺酮耐药性检测,以比例法药敏试验和DNA测序做对照。结果 应用比例法药敏试验、DNA测序、RDBH三种方法分别检测59株喹诺酮耐药株和51株喹诺酮敏感株,与比例法相比,RDBH试验灵敏度和特异度分别为69.49%(41/59)、100%(51/51),符合度为83.63%;而RDBH与DNA测序结果比较,敏感度和特异度分别为97.56%(40/41),98.55%(68/69),符合度达98.18%。结论 RDBH技术检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药具有良好的灵敏度、特异度和符合度。     

浙江省杭州市结核分枝杆菌氧氟沙星耐药研究

目的 了解杭州市结核分枝杆菌对氧氟沙星的耐药情况及耐药菌株gyrA基因的突变特点。 方法 收集2010年4月至2012年6月杭州市各结核病定点医院分离培养的临床菌株,进行一线抗结核药物、氧氟沙星和卡那霉素敏感性检测,测定氧氟沙星耐药菌株gyrA基因的喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)序列。 结果 收集的1242株临床菌株中, 67株(5.39%)对氧氟沙星耐药,其中32株(47.76%)对氧氟沙星单耐药,23株为耐多药结核病(MDR-TB)菌株,占MDR-TB菌株的22.77%。选取55株耐药株进行gyrA序列分析,其中33株(60%)携带gyrA基因突变位点。突变位点包括第90和94位密码子,突变率分别为27.27%和32.73%。 结论 杭州市氧氟沙星单耐药患者的比例较高,MDR-TB患者中氧氟沙星耐药情况较严重,需加强结核患者的早期发现和用药管理。     

耐左氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因上新的突变位点

目的:分析耐左氧氟沙星结核分枝杆菌临床菌株gyrA基因的突变情况及其耐药机制.方法:用聚合酶链反应(PER)和DNA直接测序技术(DS)测定64株耐左氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因的QRDR(quinolone resistance-determining regions)序列.结果:64株耐药菌株有47株QRDR序列发生突变,其中45株为单位点突变,另2株为双位点突变;突变分布为70位突变2株、89位1株、90位12株、91位4株、94位30株,其中70位和89位为新发现的突变位点.结论:结核分枝杆菌喹诺酮类药物耐受现象与gyrA基因QRDR的突变有关,包括新发现的70位和89位突变.     

结核分枝杆菌耐药基因突变的研究

结核病在许多国家出现回升的一个主要原因是细菌耐药性问题 ,随着联合药物治疗的使用 ,又出现了耐多药结核分枝杆菌 (结核菌 ) ,使许多结核病 ,难以治疗 ,增加了死亡率[1] 。目前对于结核菌的耐药机制的研究已有了较大的进展 ,细菌内一些酶的基因突变或缺失是导致耐药的重要原因。随着分子生物学技术的发展 ,通过聚合酶链反应 (PCR)等方法对耐药基因进行快速检测 ,大大缩短了检测时间 (2～3d) ,为耐药结核菌的治疗提供参考。本研究通过PCR -SSCP ,PCR -测序技术检测结核菌临床分离株的katG、rpoB和rpsL基因序列 ,分析济南军区结核菌…     

喹诺酮类药物对结核分枝杆菌的耐药分析

结核分枝杆菌近10年来引起的人类感染日趋严重，其感染率和患病率增高，耐药性越来越强，给临床治疗带来困难。自从喹诺酮类药物用于治疗肺结核后，给耐多药结核的治疗带来了新的希望。随着喹诺酮类药物在临床上的广泛应用，其耐药情况日趋严重。因此，必须加强对结核分枝杆菌的快速培养和耐药性监测。我们对2003—2005年临床送检标本中分离培养的1008株分枝杆菌进行环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星的耐药情况进行分析，现报道如下。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变与其他抗结核药物耐药的相关性

目的 探讨不同抗结核药物对结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因突变的影响,以进一步准确理解结核分枝杆菌异烟肼耐药的分子机制。方法 在广州地区分枝杆菌菌株库中选择异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、克拉霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、丙硫异烟胺和对氨基水杨酸等11种抗结核药物的药敏性试验临床测定结果明确的结核分枝杆菌分离株进行katG、mabA-inhA、oxy RahpC、kasA和ndh基因测序,以结核分枝杆菌H37Rv标准序列为参照进行基因突变分析,应用卡方检验对比分析H^-(R/F/O)^-与H^-(R/F/O)⁺、H⁺R^-与H⁺R⁺、H⁺F^-与H⁺F⁺和H⁺O^-与H⁺O⁺几大菌群之间5种基因突变发生总频率的差异(其中R、H、F、O...     

结核分枝杆菌耐氧氟沙星临床分离株gyrA基因突变的研究

目的了解结核分枝杆菌(MTB)临床分离株对氧氟沙星的耐药性与gyrA基因突变的关系。方法对20株随机筛选的耐氧氟沙星MTB临床分离株行gyrA基因喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)序列测定。结果18株发现了有义突变,其中2株第91位密码子由TCG(丝氨酸)→CCG(脯氨酸),3株第90位密码子由CCG(甘氨酸)→GTG(缬氨酸),10株第94位密码子由GAC(天冬氨酸)→GGC(赖氨酸),2株第94位密码子由GAC(天冬氨酸)→GCC(甘氨酸),1株第94位密码子由GAC(天冬氨酸)→GTC(缬氨酸)。6例既往未应用过氟喹诺酮类药物抗结核治疗,2例曾在结核诊断前应用氟喹诺酮类药物经验性抗感染治疗1周,12例曾应用氟喹诺酮类药物抗结核治疗。结论gyrA基因突变是MTB对氟喹诺酮类药物产生耐药的机制之一;gyrA基因的有义突变主要发生在第90位、91位、94位密码子上。     

应用不同引物检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变对结果判定的影响

目的探讨以PCR-SSCP技术为基础,应用不同引物检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变以及固定/终止液的组成对判定结果可能会产生的影响。方法采用2对引物,经PCR-SSCP检测,利用银染显色的方法显现耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变的DNA单链位移。结果对比标准株H37Rv及H37Ra gyrA基因的单链带位置,在被测试的89株菌株中发生位置变化的;对氧氟沙星的耐药程度〉10μg/ml的分别有4株与14株,约占89株检测总数的4.49%和87.5%,对氧氟沙星的耐药程度介于≥2且≤10μg/ml之间的26株中,有与标准株gyrA基因的单链带位置发生改变的分别有20株与7株,约占89株检测总数的22.47%和7.87%;对氧氟沙星的耐药程度〈2μg/ml的47株中分别有2株与11株,约占89株检测总数的2.25%和12.36%。用含5.0%乙醇和4.5‰冰醋酸配比的固定/终止液可为利用银染法显现核酸凝胶分离DNA提供温和的反应环境,操作过程方便,观测效果较为理想。结论应用不同引物检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变会对结果的判定产生影响,采用含5.0%乙醇、4.5‰冰醋酸的固定/终止液可为应用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离核酸检测的银染着色法提供温和的反应环境,并产生清晰可辨的被检测标本的DNA单链条带。     

Molecular characterization of fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis: functional analysis of gyrA mutation at position 74

A PCR-sequencing assay was evaluated for direct detection of mutations in the quinolone resistance-determining region (QRDR) of gyrase A (gyrA) gene in fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens. As determined by gyrA QRDR analysis, complete concordance of genotypic and phenotypic fluoroquinolone resistance was demonstrated. Our results indicate that the assay is a rapid and reliable method for the diagnosis of fluoroquinolone-resistant tuberculosis, facilitating timely clinical management and public health control. Using the assay, we detected a novel gyrA Ala74Ser mutation in M. tuberculosis directly from sputum specimens. The functional effect of the Ala74Ser mutant was verified through the study of the DNA supercoiling inhibitory activity of fluoroquinolones against the recombinant gyrase. The drug-mediated gyrase-DNA cleavage complex model suggests perturbation of the gyrA-gyrA dimer interface caused by the Ala74Ser mutation probably disturbs the putative quinolone binding pocket and leads to the reduction of the drug binding affinity. A number of gyrA mutations (Glu21Gln, Ser95Thr, and Gly668Asp) were also characterized to be natural polymorphisms not associated with fluoroquinolone resistance.     

结核分枝杆菌mpt64基因突变研究

目的分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)mpt64基因突变情况。方法提取MTB标准株H37Rv和45株MTB临床株的DNA,扩增mpt64基因并进行序列分析。结果 MTB标准株H37Rv和44株MTB临床株的mpt64基因无突变,1株MTB临床分离株的mpt64基因存在63个碱基的缺失突变。结论结核分枝杆菌mpt64基因突变频率低。     

大肠埃希菌耐环丙沙星gyrA基因突变的研究

目的了解临床分离大肠埃希菌耐环丙沙星ｇｙｒＡ基因突变情况。方法用环丙沙星浓度梯度法试条检测临床分离大肠埃希菌最低抑菌浓度（ＭＩＣ），聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ｇｙｒＡ基因喹诺酮耐药决定区，扩增产物片段长度为６６８ｂｐ，用限制性内切酶ＨｉｎｆⅠ消化ＰＣＲ产物，行８％聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果共检测大肠埃希菌４１株，１４株ＭＩＣ在０．２５～０．５μｇ／ｍｌ的菌株，未检出耐药性突变位点；４株ＭＩＣ在１～２μｇ／ｍｌ的菌株（２株ＭＩＣ为１μｇ／ｍｌ、１株为１．５μｇ／ｍｌ，１株为２μｇ／ｍｌ）均出现ｇｙｒＡ基因突变；耐药菌２３株（１株ＭＩＣ为１６μｇ／ｍｌ，其余≥３２μｇ／ｍｌ）也均发生ｇｙｒＡ基因突变。结论临床分离大肠埃希菌对环丙沙星耐药性与ＨｉｎｆⅠ酶切位点突变密切相关，低水平耐药菌株ｇｙｒＡ基因发生突变具有一定临床意义。