超抗原SEA诱导T细胞无能的作用机制探讨

目的 探讨超抗原诱导T细胞无能的分子机制。方法 采用ELISA的FACS，分别检测超抗原对诱导T细胞无能的过程中，IL－2，IL－10的产生和IL－2Rα链（CD25）的表达，并以^3H-TdR掺入法，测定无能T细胞对rhIL-2,PMA及ionomycin的应答能力，而L－10的产生则逐渐升高；CD25的表达与活化组相比较无显著差异。rhIL-2的加入可恢复T细胞增殖。PMA单独作用能诱导无能T细胞的部分增殖能力，但PMA＋ionomycin则能更大程度地恢复T细胞的增殖。结论 超抗原SEA对T细胞无能的诱导，可能与降低IL－2的水平和升高IL－10的水平有关。超抗原SEA的反复刺激对T细胞无能的诱导，可能是干扰了TCR信号途径的近端事件，导致Ras/MAPK途径和Ca/calcineurin途径受阻，而使IL－2基因不能转录所致。     

Fas／FasL在超抗原SEA诱导T细胞凋亡中的作用

目的超抗原能诱导 T细胞凋亡 ,但其作用机制尚未阐明 ,Fas系统与 Ca2 在其中的作用尚待进一步研究。方法超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)诱导人外周血建立的短期 SEA反应 T细胞系凋亡 ,1.8%琼脂糖凝胶 DNA电泳于不同时间观察凋亡的特征条带 ;FCM检测 Fas、Fas L 的表达量变化 ,Fura- 2 / AM荧光指示剂检测胞浆游离 [Ca2 ]i的变化。结果使用 FCM特异性检测凋亡亚 G0 / G1峰大小及 1.8%琼脂糖凝胶电泳检测凋亡 DNA梯状图谱证明 ,SEA能诱导短期 SEA反应 T细胞凋亡 ,其凋亡的时间与程度与 SEA的剂量有关。SEA1μg/ ml建立的短期 SEA反应 T细胞对 SEA1μg/ml的再次刺激 ,凋亡量随作用时间的延长而增多 ,在作用的第 16 h最高 ,达 5 8%。 FCM间接荧光染色法检测发现 ,Fas及Fas L 亦随 SEA作用时间的延长而表达增多 ,16 h时表达最多 ,分别为 92 %和 6 0 %。用 Fura- 2 / AM荧光指示剂检测 ,此时细胞胞浆 [Ca2 ]i已从刺激前的 (2 90± 33) nm ol/ L 上升到 (6 80± 16 ) nmol/ L。结论 Fas系统与 SEA诱导的 T细胞凋亡密切相关。换言之 ,Fas系统在超抗原诱导 T细胞凋亡中起作用 ,而胞浆 [Ca2 ]i升高与 SEA诱导的凋亡 T细胞 DNA断裂及其它凋亡形态变化有关。     

超抗原SEA对外周血T细胞的活化作用

目的 研究超抗原SEA对外周血T淋巴细胞的活化作用。方法 用SEA刺激人外周血T淋巴细胞,观察细胞的DNA合成、形态、IL-2的产生、细胞表型以及凋亡情况。结果 SEA对T淋巴细胞的促增殖作用的浓度为100mg/mL最强,在第2、3d达高峰;首次或多次刺激不改变T淋巴细胞的CD4^ CD8^ 的表型;首次刺激24h内未见明显凋亡;但再次刺激24h内即有明显凋亡;加入rhIL-22d凋亡现象消失。结论 超抗原SEA对T淋巴细胞的促增殖作用与其浓度、作用时间有关,并且SEA首次或多次刺激对CD4^ T淋巴细胞和CD8^ T淋巴细胞起同等的活化作用。     

超抗原SEA对K502细胞诱导脐带血单个核细胞上CD3ε链表达的影响

目的:探讨金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对K562细胞诱导正常人脐带血单个核细胞(MNCs)中CD3ε链基因表达的影响.方法:常规分离4例脐带血单个核细胞,分别与抗CD3单克隆抗体(mAb)、单纯K562细胞、单纯SEA以及SEA联合K<562细胞共培养,诱导MNCs活化增殖,并设空白对照组.刺激培养48h后,收集各组细胞提取mRNA并合成cDNA,以β2微球蛋白基因作为内参照,采用实时荧光定量PCR检测在各组MNCs中CD3ε链基因的表达,并根据公式2-△△ct对CD3ε链表达的差异倍数进行相对定量分析.结果:K562细胞组MNCs中CD3ε链基因表达的水平略有降低,抗CD3 mAb组、SEA组、SEA联合K562细胞组的诱导活化的MNCs中CD3e链基因的表达均有增强,而SEA联合K562细胞组MNCs中CD3ε链基因的表达明显高于单纯SEA组(P<0.01).结论:超抗原SEA可以增加K62细胞在体外诱导脐带血MNCs中CD3ε链基因的表达.     

超抗原SEA诱导T细胞失能体外实验模型的建立

目的 建立超抗原诱导T细胞失能的体外实验模型。方法 SEA刺激人外周血淋巴细胞,再加入外源性的rIL-2维持,建立短期SEA反应性T细胞系;进行Ficoll-Hypaque密度梯度离心获取经SEA多次刺激过SEA反应性T细胞;加入处理过的PBMC作APCs,建立超抗原SEA诱导T细胞的化组和失能组。结果 SEA和rIL-2共同作用可得到静息SEA反应性T细胞系;SEA反复刺激使T细胞处于一低反应状态,与活化组相比,其DNA合成能力明显下降,IL－2分泌显著减少,静息一段时间后,其增殖能力慢慢恢复。结论 超抗原SEA多次刺激诱导SEA反应性T细胞处于失能状态。     

超抗原SEA抗肿瘤研究进展

超抗原是指一些细菌或病毒编码的蛋白分子, 只需极低浓度即可激活大量的淋巴细胞克隆.作为一种强大的T细胞激活剂,超抗原成为肿瘤免疫治疗研究的热点之一.本文对其特性及目前的研究进展作一综述.     

超抗原SEA联合PML-RARа对外周血T细胞TCR Vβ亚家族基因表达的影响

目的 探讨超抗原SEA联合PML-RARa多肽对外周血T细胞TCR Vβ亚家族基因表达的影响.方法 分别将SEA、PML-RARa多肽以及SEA联合PML-RARa多肽与正常人外周血单个核细胞共同培养,20 d后收集增殖细胞,利用RT-PCR及基因扫描技术分析诱导后增殖T细胞TCR Vβ亚家族的利用和克隆性增殖的特点.结果 单纯SEA诱导后,T细胞表达了11个TCR Vβ亚家族,且仍为多克隆增殖.单纯PML-RARa多肽诱导后,T细胞限制性表达8个Vβ亚家族,其中、Vβ13、Vβ14表现出寡克隆或寡克隆趋势.PML-RARa多肽联合SEA共同诱导,其T细胞表达TCR Vβ亚家族依然呈明显的限制性,且Vβ13、Vβ14亚家族呈寡克隆、双克隆及寡克隆趋势.结论 SEA能协同PML-RARa多肽诱导的T细胞克隆性活化与增殖.     

超抗原诱导T细胞凋亡或增殖的体外研究

研究抗原递呈细胞在超抗原诱导人外周血特异性Ｔ细胞反应中的作用。方法金黄色葡萄球菌Ａ肠毒素刺激短期人外周血ＳＥＡ反应Ｔ细胞系的作用中,通过去除或加入Ａｐｃ观察细胞形态,ＦＣＭ检测细胞亚ＧＯ／Ｇ１峰大小及１．８％ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳观察凋亡特征条带。     

肠毒素C2第20和22位氨基酸对其超抗原活性的影响

目的:揭示突变蛋白SEC2(T20L/G22E)超抗原活性较野生型SEC2显著增强的潜在机制。方法:WST-1法检测突变蛋白SEC2(T20L/G22E)在体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖活性,进一步应用流式细胞术和荧光定量PCR技术分别检测CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖、特异性VβT淋巴细胞增殖以及相关细胞因子mRNA丰度变化。结果:与野生型SEC2相比,突变蛋白SEC2(T20L/G22E)能够在体外显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,但二者具有相似的特异性VβT淋巴细胞增殖谱,并且SEC2(T20L/G22E)能够较rSEC2激活更多携带有Vβ5.3、Vβ8.1及Vβ8.3的T淋巴细胞;进一步体内实验发现SEC2(T20L/G22E)能够较rSEC2激活更多外周血和脾脏中CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖及相关细胞因子的表达。结论:突变蛋白SEC2(T20L/G22E)超抗原活性增强的机制可能是用亮氨酸和谷氨酸替代原来20和22位上的氨基酸后提高了SEC2(T20L/G22E)与特异性TCR-Vβ的亲和力,进一步激活更多的SEC2特异性T淋巴细胞,最终引起T淋巴细胞亚型的显著性增殖,同时诱导更多与抗肿瘤、增殖相关的细胞因子的表达。     

转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定

目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因转染至肝癌细胞．方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因，将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN—SEA重组质粒，再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞，用RT—PCR和ELISA法鉴定．结果从产SEA标准菌株ATCCl3565中提取并扩增出SEA基因全长片段；SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN，经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致；将pLXSN—SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402，经筛选获得稳定表达的抗性单克隆．RT—PCR扩增出约800bD的基因片段，经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平．结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体，将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL－7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白．     

不同来源乙肝表面抗原的细胞免疫学对比研究

目的　研究不同来源乙肝表面抗原诱导CD8 抗原特异性的细胞毒T淋巴细胞反应(CTL)的差异及T细胞产生细胞因子的能力 ,从而对各种来源乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)的免疫原性有更充分的评价。方法　不同来源HBsAg分别免疫BALB c小鼠 ,于免疫后不同时间制备脾脏单个核细胞 (MNC) ,再以相应的HBsAg体外刺激 ,酶联免疫方法 (ELISA)测定细胞因子分泌水平 ;以Na2 5 1CrO4标记靶细胞 ,测定CTL反应活性 ;应用流式细胞仪分析T细胞亚群。结果　HM HBsAg免疫小鼠 10d后的脾细胞产生IFN γ水平最高 ,而在免疫后 2 0d和 2 5d ,IL 2的水平显著高于其它各组 ,CD3 分子脾淋巴细胞显著高于其它各实验组 (P <0 .0 5) ;plasma HBsAg免疫小鼠的脾淋巴细胞产生IFN γ和IL 2水平较低 ,但在免疫 2 5d对P815 HBs的杀伤性最强 ;HM HBsAg和SSC HBsAg免疫后CD4 CD8- 脾淋巴细胞比例显著增高 (P <0 .0 5) ;CD4- CD8 细胞所占百分比各组间及与空白对照组间差异无显著性 (P >0 .0 5)。结论　不同来源HBsAg诱导的细胞免疫反应类型和程度不同     

趋化性细胞因子受体在Tc1和Tc2亚群的差异表达

目的研究趋化性细胞因子受体在体外长期培养的人Te1和Tc2细胞系中的表达。方法将新鲜分离的PBMC在特定细胞因子及细胞因子抗体存在条件下，定向诱导为Ⅰ型和Ⅱ型T细胞系，用免疫荧光染色结合流式细胞术分析鉴定，并以膜表面及胞内三色流式细胞术检测趋化性细胞因子受体在不同T细胞亚群的表达。结果①在Ⅰ型和Ⅱ型T细胞整体水平上，CXCR4的表达水平接近，CXCR3和CCR5的表达在Ⅰ型T细胞明显高于Ⅱ型T细胞，CCR3在2种T细胞系的表达水平均较低，但在Ⅱ型T细胞的表达略高于Ⅰ型T细胞；②趋化性细胞因子受体在Tc1和Tc2亚群细胞的表达与上述结果类似，即CXCR的表达水平接近，CXCR3和CCR5的表达在Tc1高于Tc2，CCR3的表达水平较低，但在Tc2则略高于Tc1。结论趋化性细胞因子受体在Tc1和Tc2亚群的表达具有差异性。     

肾综合征出血热患者TH1/TH2、Tc1/Tc2亚群比例及有关细胞因子变化的研究

目的：探讨肾综合征血热（HFRS）患者TH1样和TH2样细胞平衡状态以及血清中细胞因子的变化，方法：收集HFRS患者和健康个体血清，采用夹心ELISA方法测定IFN－γ、IL－4和TNF－α的水平，分离PBMC，采用三色流式细胞术分析HFRS患者CD4^ T细胞和CD8^ T细胞中IFN－γ^ 和IL－4^ 细胞的百分率。观察HFRS患者TH1／TH2，Tc1/Tc2比例的变化，比较了不同病程和病情HFRS患者血清中上述指标的变化，结果：HFRS患者血清中TH1类和TH2类细胞因子水平均明显升高，其中IFN－γ和IL－4的平均水平显著高于健康个体（P＝0．016，P＝0．019）。HFRS患者PBMC中TH1、TH2、Tc1,Tc2细胞的平均百分率均高健康个体Tc细胞比例的改变较TH细胞明显，TH1样细胞的比例较TH2样细胞变化明显。发热期患者血清中IFN－γ、IL－4和TNF-α的水平明显升高于恢复期患者，发热期的重症患者的IFN－γ水平升高较轻症明显。结论：HFRS患者血清中IFN－γ和IL－4水平以及PMBMC中TH1、TH2、Tc1和Tc2细胞的比例均有所升高，发热期的患者和重症HFRS患者上述参数变化更明显，表明感染机体总体的免疫平衡偏向TH1类。     

趋化性细胞因子对人Tc1和Tc2细胞内Ca~(2+)浓度变化的影响

为了探讨趋化性细胞因子在体外对人Tc1和Tc2亚群细胞内Ca2 + 浓度变化的影响 ,从PBMC中分离纯化CD8+ T细胞 ,在特定细胞因子及细胞因子抗体作用下 ,体外定向诱导出能长期培养的Tc1和Tc2细胞系 ,用免疫荧光染色结合流式细胞术分析对其进行鉴定后 ,通过流式细胞术检测在趋化性细胞因子刺激前后 ,细胞内Ca2 + 浓度的变化。发现受SDF 1作用后 ,Tc1及Tc2细胞内Ca2 + 浓度变化均不明显 ,而IP 10刺激后 ,Tc1及Tc2细胞内Ca2 + 水平在短时间内明显上调 ,且在Tc1胞内的上升幅度远高于Tc2细胞 ,在MIP 1β刺激后 ,也观察到类似趋势 ;受Eotaxin刺激后 ,Tc1及Tc2细胞内Ca2 + 水平均有微小上升 ,在Tc2细胞内的上升幅度略高于Tc1细胞。说明Tc1和Tc2细胞受趋化性细胞因子作用后 ,细胞内Ca2 + 浓度有不同程度的变化 ,且与趋化性细胞因子受体的表达呈现一定的相关性。     

Th1/Th2、Tc1/Tc2亚群在乙肝肝硬化患者中的作用

目的 :探讨乙肝肝硬化患者外周血 (PBMC)中CD4 和CD8 T细胞内Th1和Th2类细胞的平衡状态 ,探明Th1、Th2类细胞在乙肝肝硬化中的作用。方法 :乙肝肝硬化患者CD4 T细胞和CD8 T细胞中IFN γ 和IL 4 细胞的百分率 ,观察乙肝肝硬化患者Th1 Th2、Tc1 Tc2比例的变化。结果 :乙肝肝硬化患者PBMC中CD4 ,CD8细胞 ,CD4 CD8比值与健康对照者相比无统计学差异 (P >0 0 5 ) ,Th1细胞及Tc1细胞百分率为 8 8% ,9 0 % ,较健康对照者 7 5 % ,7 7%升高 (P <0 0 5 )。结论 :乙肝肝硬化患者外周血T细胞亚群发生Th1类偏移 ,在乙肝肝硬化的发生和发展中可能起重要作用     

CTL体外杀伤效应的特异性和敏感性影响因素的研究

目的 观察影响CTL体外杀伤效应的特异性和敏感性的主要因素。方法 抗原OVA免疫小鼠C57BL／6，取免疫后小鼠脾细胞，先用ELISPOT法检测CTL的活化，然后抗原肽OVA257-264体外刺激免疫后的脾细胞5d，^51Cr释放法观察不同因素对CTL的体外杀伤效果的影响。结果 ELISPOT检测结果显示抗原免疫组产生了强CIL应答，而PBS免疫组没有应答。游离多肽的存在显著降低杀伤的效率，IL-2和Ficoll-Hypaque离心去除死细胞可提高体外杀伤的效率。ConA的存在可以使CTL体外非特异的杀伤靶细胞。结论 CTL体外杀伤实验中必需尽量去除游离多肽，以提高CTL杀伤的特异性和敏感性。     

人CD80—Linker—SEA重组毒素的设计及生物学特性预测

目的：构建人重组ＣＤ８０－Ｌｉｎｋｅｒ－ＳＥＡ毒素的真核表达载体并预测Ｌｉｎｄｅｒ的合理性和可行性。方法：应用核酸和蛋白质序列分析软件ＧｏｌｇＫｅｙ对融合基因及Ｌｉｎｋｅｒ部位翻译后在二级结构水平上的一些生物学特性,诸如柔性、抗原性、亲水性及表位等加以预测。结果：ＣＤ８０－Ｌｉｎｋｅｒ－ＳＥＡ融合基因的氨基酸序列经软件分析,并分别与ＣＤ８０与ＳＥＡ单独的分析结果相比较,发现在二级结构的水平未出现新的抗原性,同时在Ｌｉｎｋｅｒ部位具有很低的抗原性,亲水性没有改变,Ｌｉｎｋｅｒ部位呈中性,ＣＤ８０和ＳＥＡ具有原来各自的表位特征,无新的表位出现。结论：本研究通过计算机软件对ＣＤ８０－Ｌｉｎｋｅｒ－ＳＥＡ融合蛋白的预测,并与ＣＤ８０、ＳＥＡ各加以对比分析和比较,以利于在重组过程中有一个合理的设计,有可能最大程度的保留Ｃ     

Ceramide-independent CD28 and TCR signaling but reduced IL-2 secretion in T cells of acid sphingomyelinase-deficient mice

Ceramide generated by lysosomal acid sphingomyelinase (aSMase) has been proposed to contribute to CD28 co-stimulatory signaling pathways. We used an aSMase-deficient mouse line ( asmase ^{− / −} ) to elucidate the role of the aSMase in splenocytes stimulated with either a combination of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, the lectin concanavalin A (Con A) or the superantigen staphylococcal enterotoxin B. All stimuli were shown to induce IL-2 expression, Con A additionally triggered the expression of high-affinity IL-2 receptor. However, in asmase ^{− / −} mice secretion of IL-2 was significantly reduced, whereas the intracellular IL-2 levels were elevated. Proliferation of anti-CD3/anti-CD28 or Con A-stimulated aSMase-deficient splenocytes was reduced up to 50 % after 72 h in comparison to wild-type cells. We conclude that ceramide generated by aSMase is not involved in CD28 signal transduction, but rather a perturbation of the secretory system is responsible for the impaired proliferation of aSMase-deficient splenocytes.     

Differential reactivity of residual CD8+ T lymphocytes in TAP1 and β2-microglobulin mutant mice

TAP1 -/- and β2-microglobulin (β2m) -/- mice (H-2^b background) express very low levels of major histocompatibility complex (MHC) class I molecules on the cell surface. Consequently these mice have low numbers of mature CD8⁺ T lymphocytes. However, TAP1 -/- mice have significantly higher numbers of CD8⁺ T cells than β2m -/- mice. Alloreactive CD8⁺ cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses were also stronger in TAP1 -/- mice than in β2m -/- mice. Alloreactive CTL generated in TAP1 -/- and β2m -/- mice cross-react with H-2^b-expressing cells. Surprisingly, such cross-reactivity was stronger with alloreactive CTL from β2m -/- mice than with similar cells from TAP1 -/- mice. The β2m -/- mice also responded more strongly when primed with and tested against cells expressing normal levels of H-2^b MHC class I molecules. Such H-2^b-reactive CD8⁺ CTL from β2m -/- mice but not from TAP1 -/- mice also reacted with TAP1 -/- and TAP2-deficient RMA-S cells. In contrast, H-2^b-reactive CD8⁺ CTL from neither β2m -/- mice nor TAP1 -/- mice killed β2m -/- cells. In line with these results, β2m -/- mice also responded when primed and tested against TAP1 -/- cells. We conclude that the reactivity of residual CD8⁺ T cells differs between TAP1 -/- and β2m -/- mice. The MHC class I-deficient phenotype of TAP1 -/- and β2m -/- mice is not equivalent: class I expression differs between the two mouse lines with regard to quality as well as quantity. We propose that the differences observed in numbers of CD8⁺ T cells, their ability to react with alloantigens and their cross-reactivity with normal H-2^b class I are caused by differences in the expression of MHC class I ligands on selecting cells in the thymus.