成年大鼠急性脊髓损伤后Rho GTPases的失衡性表达及对轴突再生的影响

目的 观察成年大鼠急性脊髓损伤(SCI)后小G蛋白Rho GTPases Rac、Cdc42和Rho的表达变化及Rho-ROK下游底物MLC的过度磷酸化,探讨哺乳动物SCI后轴突再生过程中生长锥易于萎陷的可能机制.方法 成年SD大鼠36只随机分为SCI4、7、14、21d组,对照组和假手术组共6组,每组6只,SCI组制作Allen's脊髓打击模型并按时序取材,Western印迹检测Rac1、Cdc42和Rho A的表达变化以及MLC磷酸化程度变化,GST Pull down assay 检测RhoA活化程度变化.结果 在SCI后,大鼠脊髓挫伤部位Rac1和Cdc42的表达逐步升高并在第7天达到峰值,之后呈现下降趋势;与之形成对比的是RhoA的表达则无明显变化,但Rho的下游信号通道RhoA-ROK作用底物MLC磷酸化程度却逐步升高;RhoA活性测定则显示GTP-RhoA呈逐步增高趋势. 结论成年大鼠SCI后脊髓中枢轴突再生过程中存在Rho GTPases Rac、Cdc42和Rho的失衡性表达,这可能是外周微环境中吸引性和排斥性因素制约失衡的直接后果;Rho的活性持续异常升高可导致MLC磷酸化程度异常升高.这一变化可刺激肌动-肌球蛋白的收缩性,从而导致大鼠SCI后生长锥的萎陷和再生神经突起的回缩.     

大鼠脊髓中血红素氧合酶基因的表达及其意义

目的观察正常大鼠脊髓中血红素氧和酶(H0)的表达和分布。方法雌性SD大鼠10只，按体重配成5对。每对随机分为正常组和诱导组，后者予以42℃热水浸泡躯体20min。取其中3对大鼠胸腰段脊髓，提取RNA后进行北方印迹分析；2对做免疫组织化学检测。结果HO-1探针检测到1．8kb mRNA，诱导组的丰度数倍于正常组。HO-2探针检测到两组标本都表达两种同源mRNA(1．3kb和1．9kb)，表达量相仿。免疫组织化学显示HO-1阳性细胞主要分布于前角神经元，诱导鼠中间带也可出现；HO-2阳性细胞散布于整个灰质中。结论HO参与脊髓信号传导和应激反应。     

大鼠脊髓损伤后GDNFmRNA表达变化及意义

目的　探讨 GDNFm RNA在大鼠脊髓损伤后表达变化及其意义。方法　改良 Allen’s脊髓撞击 (10 g× 7.5 cm)致伤大鼠 T1 段脊髓 ,以 β- Actin为内参照物 ,应用半定量 RT- PCR方法 ,观察大鼠脊髓损伤前及损伤后不同时间 GDNFm RNA表达变化。结果　 GDNFm RNA在正常成年大鼠脊髓微量表达 ,脊髓损伤后 2 4h表达增加 5倍 ,72 h增加 2 0倍 ,7d增加 4倍 ,10 d仍高于正常水平。结论　脊髓损伤后早期 GDNFm RNA表达增加 ,是神经元自我保护作用的一种表现 ;损伤神经元修复需要大量 GDNF,应用 GDNF治疗脊髓损伤时应早期用药     

大鼠脊髓损伤后坐骨神经GDNFmRNA表达变化及意义

目的：探讨大鼠脊髓损伤后GDNFmRNA在坐骨神经的表达变化及其意义。方法：Allen's方法致大鼠T13段脊髓不完全损伤后，以β-Actin为内参照物，应用半定量RT-PCR方法，观察大鼠坐骨神经在脊髓损伤前、后不同时间GDFNmRNA表达变化。结果：脊髓损伤前GDNFmRNA在大鼠坐骨神经仅有微量表达，脊髓损伤后24h表达增加4倍，72h增加15倍，7d增加3倍，10d仍高于正常水平。结论：脊髓损伤后坐骨神经高表达GDNFmRNA，是神经元通过“胞体--轴突--靶器官”途径自我保护的一种反应形式，GDNF治疗脊髓损伤时应早期用药以获得最佳效果。     

慢病毒介导的shRNA干扰PTEN表达促皮层神经元轴突再生及脊髓损伤修复

 目的 观察慢病毒介导特异性短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）干扰第l0号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN）表达对皮层神经元轴突再生及脊髓损伤修复的影响。方法 体内实验和体外实验两部分各分四组：阴性对照组（DMEM）、空载慢病毒组（Lenti��control）、空白载体组（Lenti��scramble）、慢病毒介导shRNA组（Lenti��shRNA）。体外神经元转染72 h后,Western blot检测各组PTEN表达情况,免疫荧光检测神经元轴突再生能力;体内载体注射1周后,Western blot检测各组PTEN表达情况;6周后荧光显微镜观察皮质脊髓束穿越脊髓损伤局部周围增强绿色荧光蛋白荧光强度及突触素表达情况。采用大鼠脊髓损伤评分评价大鼠后肢运动恢复情况。结果 慢病毒介导shRNA组体外转染神经元后PTEN表达水平比阴性对照组下降83.75%±2.85%,与其他组比较具有统计学意义（F=4277,P< 0.05）;轴突长度（249.70±10.70）μm,大于阴性对照组（95.71±20.24） μm、空载慢病毒组（97.00 ± 22.82）μm及空白载体组（87.57±19.34）μm,差异具有统计学意义（F=84.74,P< 0.05）;每个神经元一级突起数量（5.800±0.359）个,大于阴性对照组（2.800±0.678）个、空载慢病毒组（2.900±0.389）个及空白载体组（3.000±0.877）个,其差异具有统计学意义（F=16.47,P< 0.05）;神经元突起穿越硫酸软骨素蛋白多糖基质的百分比20.60%±1.80%,大于阴性对照组6.70%±1.45%、空载慢病毒组5.50%±1.69%、空白载体组5.60%±1.77%,其差异具有统计学意义（F=94.90,P<0.05）。慢病毒介导shRNA注射大脑皮层运动区后,第6周大鼠脊髓损伤评分达（13.29±0.42）分,高于阴性对照组（7.00±1.48）分,空载慢病毒组（6.43±1.43）分,空白载体组（6.29±1.22）分,其差异具有统计学意义（F=44.85,P< 0.05）。皮层组织PTEN表达水平下降84.57%±1.87%,损伤中心尾端见绿色荧光,突触素染色阳性面积明显增大。结论 慢病毒介导shRNA下调PTEN基因表达后可明显提高脊髓损伤后轴突再生能力,促进神经功能修复。     

大鼠脊髓损伤后坐骨神经GDNFmRNA表达变化及意义

目的 探讨大鼠脊髓损伤后坐骨神经表达GDNFmRNA的变化及其意义。方法 Allen’s方法致伤大鼠T13段脊髓,造成不完全性脊髓损伤,截取坐骨神经,以β-Actin(β-肌动蛋白)为内参照物,应用半定量RT-PCR方法,观察大鼠坐骨神经在脊髓损伤前、后不同时间GDNFmRNA表达变化。结果 脊髓损伤前GDNFmRNA在大鼠坐骨神经仅有微量表达,脊髓损伤后24小时表达增加4倍,72小时增加15倍,7天增加3倍,10天仍高于正常水平。结论 脊髓损伤后坐骨神经高表达GDNF,是神经元通过“胞体—轴突—靶器官”途径自我保护的一种反应形式,GDNF治疗脊髓损伤时应早期用药。     

大鼠脊髓损伤后坐骨神经GDNFmRNA表达变化及意义

目的探讨大鼠脊髓损伤后坐骨神经表达GDNFmRNA的变化及其意义.方法 Allen's方法致伤大鼠T13段脊髓,造成不完全性脊髓损伤,截取坐骨神经,以β-Actin(β-肌动蛋白)为内参照物,应用半定量RT-PCR方法,观察大鼠坐骨神经在脊髓损伤前、后不同时间GDNFmRNA表达变化.结果脊髓损伤前GDNFmRNA在大鼠坐骨神经仅有微量表达,脊髓损伤后24小时表达增加4倍,72小时增加15倍,7天增加3倍,10天仍高于正常水平.结论脊髓损伤后坐骨神经高表达GDNF,是神经元通过"胞体-轴突-靶器官"途径自我保护的一种反应形式,GDNF治疗脊髓损伤时应早期用药.     

低温保存嗅神经鞘细胞移植对脊髓轴突再生的影响

目的观察低温保存(-120℃)的嗅神经鞘细胞(OECs)移植对脊髓轴突再生及神经功能恢复的促进作用。方法将分离培养的SD大鼠OECs冻存2周,复温后移植于12只成年SD大鼠T 10水平SCI模型的脊髓两断端,另12只对照组SD大鼠只注入DMEM。分别于移植后6、12周行下肢功能评价、MEP检测、组织学和免疫组织化学检查。结果实验组及对照组动物存活率均为75%。移植后6周,实验组及对照组动物下肢瘫痪,下肢记录不到MEP。组织学检查(每组各2只)见实验组OECs与宿主融合良好,细胞内及细胞周围有髓鞘碱性蛋白阳性物质存在,宿主再生轴突经近侧断端长入断端间组织;对照组远、近断端轴突变性,未见再生轴突。移植后12周,实验组2只动物(2/7)下肢出现肌肉收缩,2只(2/7)髋、膝关节能活动,5只记录到MEP;对照组动物(7/7)下肢功能无改善,记录不到MEP。组织学检查见实验组OECs明显减少,部分再生轴突穿过损伤区组织抵达脊髓远侧断端;对照组瘢痕形成,无轴突再生。结论低温保存的OECs移植后可在脊髓中存活,并产生髓鞘样物质,促进宿主脊髓轴突再生及神经功能部分恢复。     

应用RNA干扰技术抑制神经元E3B1基因表达及对轴突生长的影响

目的:探讨应用RNA干扰(RNAi)技术抑制神经元E3B1基因表达及其对轴突生长的影响.方法:选择针对E381(NCBI:NM-024397)RNAi的3个靶位点Abil1、Abil2、Abil3和1个不针对任何mRNA的RNAi靶位点(阴性对照)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,阳性对照),用带有neoR选择标志和GFP绿色荧光标志的真核表达载体pGenesil-1构建E381 RNAi质粒,分别转染培养的神经元,在荧光显微镜下观测转染率,经G418筛选得到单一的转染细胞,并用Western blot法检测各转染组神经元E3B1蛋白的表达情况,选出具有最佳抑制效应的siRNA转染神经元,加人轴突生长抑制物,观测轴突生长情况.结果:成功构建了RNAi质粒,各组细胞的转染率相近,均为34%左右.与阴性对照组相比,Abil1、Abil2和Abil3转染组细胞内E3B1 mRNA的表达都受到了不同程度的抑制,其中Abil3转染组细胞的E381 mRNA和蛋白的表达抑制最为显著,加入轴突抑制剂后Abil3转染组神经元轴突仍能继续生长.结论:应用RNA干扰技术能高效特异地抑制神经元E3B1基因的表达,E3B1基因的表达下调可促进神经元轴突的生长.     

甘草酸二铵对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后运动神经元Caspase-3表达的影响

目的:观察甘草酸二铵(DG)对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后脊髓前角运动神经元Caspase-3表达的影响.方法:60只大鼠随机分为3组,每组20只.两组采用手术夹闭大鼠左右肾动脉之间的腹主动脉30min致脊髓缺血,然后松开再灌注,其中一组在缺血前10min舌下静脉注射DG 20mg/kg(DG干预组),一组仅造成脊髓缺血损伤(损伤组);另一组打开腹腔后即关腹,不进行缺血再灌注(正常对照组).分别于术后3、24、72、168h处死大鼠取腰段脊髓行免疫组化染色,观察脊髓前角Caspase-3光密度变化情况;、168h处死动物前先采用Behrmann 5点评分法评定大鼠后肢功能.结果:损伤组与干预组72h时后肢功能评分分别为4.2±0.45分、5.8±1.1分:168h时分别为5±0分、6.2±1.3分,两组相同时间比较有显著性差异.Caspase-3表达位于脊髓前角运动神经元胞浆.术后3、24、72、168h,正常对照组前角运动神经元的平均光密度为0.13±0.04、0.15±0.06、0.13±0.06、0.15±0.06,损伤组为0.18±0.04、0.18±0.03、0.20±0.04、0.20±0.05,DG干预组为0.17±0.06、0.15±0.02、0.16±0.04、0.15±0.02,损伤组各时间点与对照比较均有显著性差异,DG干预组在24、72、168h与损伤组比较差异有显著性.结论:DG可下调凋亡信号转导通路中Caspase-3的表达水平,从而抑制脊髓前角神经元凋亡的发生.     

GPC3 mRNA在甲胎蛋白阴性肝癌中的表达及其意义

目的 探讨GPC3基因在甲胎蛋白阴性肝癌中的变化及其临床意义。方法 应用印迹法（Northern)杂交检测48例肝癌组织及其相应的癌旁肝细胞内GPC3mRNA表达的变化,其中肝细胞癌41例、肝内胆管细胞癌4例、大肠癌肝转移2例和肝局灶性结节增生1例,并结合各组织标本的病理学特点进行分析。结果 41例甲胎蛋白阴性肝细胞癌中,有30例肝癌组织可测出GPC3mRNA的表达（73.17%),而癌旁组织中均不表达。直径＞5cm的大肝癌GPC3的表达率显著高于直径≤5cm的小肝癌,低分化肝癌GPC3 的表达率显著高于高分化的肝癌。GPC3的表达与患者的年龄、性别、包膜完整性、癌栓形成、肝内转移及乙肝病毒感染状况均无明显相关性。GPC3mRNA在非肝细胞肝癌组织内均不表达。结论 GPC3mRNA在AFP阴性肝癌中特异性表达,可作为原发性肝癌的一个新的基因标志。GPC3mRNA在肝癌的发生发展中有重要作用。     

Fas配体基因在肾细胞癌中的表达及其意义

目的 探讨Ｆａｓ配体（ｒａｓ ｌｉｇａｎｄ,ＦａｓＬ）基因在肾细胞癌中的表达及临床临床。方法 应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）及免疫组织技术化学分别检测ＦａｓＬ ｍＲＮＡ及蛋白在５１例肾细胞癌中的表达。结果 ５１例肿瘤 ３２例ＦａｓＬ基因阳性表达。其中１、２、３级肿瘤中ＦａｓＬ的阳性表达率分别为２５．０％、６３．６％、８８．２％,１、２、３、４期肿瘤肿瘤中Ｆａｓｌ的阳性表达率分别为３１．６     

Survivin基因在人大肠癌中的表达及临床意义

目的:研究Survivin基因在大肠癌中的表达及临床意义.方法:应用反转录RT-PCR方法,检测了29例大肠癌组织中Survivin基因mRNA的表达.结果:发现正常大肠黏膜组织中Survivin基因不表达,肿瘤组织中Survivin 基因表达阳性率为72.4%(21/29).半定量分析结果显示,29例大肠癌组织中Survivin其表达的平均值为 0.61 ±0.39.Survivin基因表达与淋巴结转移,肿瘤分期及远处转移有关.但与年龄,肿瘤大小,分化程度无关.结论:提示Survivin基因在大肠癌病程中起重要的作用,对筛选大肠癌术后高危转移患者,加强随访诊治有一定参考意义.     

凋亡抑制基因Livin在膀胱癌中的表达及意义

目的探讨凋亡抑制基因Livin表达在膀胱癌(TCC)发生发展中的作用.方法采用RT-PCR方法检测36例TCC组织标本中Livin的表达.男31例,女5例.年龄26～82岁,平均64岁.临床分期T122例,T29例,T3 3例,T42例.病理分级Ⅰ级10例,Ⅱ级23例,Ⅲ级3例.初发25例,复发11例.单发19例,多发17例.12例正常膀胱组织标本作对照. 结果36例TCC中Livin阳性表达28例(78%),T1表达率82%(18/22),T2～T471%(10/14);Ⅰ级表达率70%(7/10),Ⅱ级83%(19/23),Ⅲ级67%(2/3);单发表达率79%(15/19),多发者77%(13/17);初发者80%(20/25),复发者73%(8/11).Livin表达与TCC临床分期和病理分级不相关,与肿瘤数量,复发次数不相关(P＞0.05).对照组12例标本中均不表达.TCC组和对照组Livin表达差异有统计学意义.结论Livin表达与TCC的发生有关,可作为TCC的分子标志物,可能成为TCC诱导凋亡治疗的新靶点.     

凋亡抑制基因存活素在膀胱癌中的表达及意义

目的　探讨膀胱癌组织中凋亡抑制基因存活素 (survivin)表达在膀胱癌发生发展中的作用。　方法　应用免疫组化 (SP)法 ,对 6 0例膀胱移行细胞癌组织标本中存活素的表达进行检测。男 4 8例 ,女 12例。平均年龄 5 9岁。病理分级Ⅰ级 16例 ,Ⅱ级 2 4例 ,Ⅲ级 2 0例。临床分期T113例 ,T2 15例 ,T3 2 1例 ,T411例。复发性膀胱癌 2 1例。 10例非肿瘤膀胱组织作对照。　结果　 6 0例膀胱癌组织中存活素阳性表达 36例 (6 0 .0 % ) ,10例非肿瘤膀胱组织存活素表达均为阴性。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级膀胱癌组织存活素阳性表达率分别为 37.5 % (6 / 16 )、6 6 .7% (16 / 2 4 )、70 .0 % (14 / 2 0 ) ,Ⅰ级与Ⅱ、Ⅲ级比较差异有统计学意义 (P <0 .0 1)。T1、T2 、T3 、T4期膀胱癌组织存活素阳性率分别为 5 3.8% (7/ 13)、6 0 .0 % (9/ 15 )、6 1.9% (13/ 2 1)、6 3.6 % (7/ 11) ,呈逐渐增高趋势 ,但组间两两比较差异均无统计学意义 (P>0 .0 5 )。复发性膀胱癌存活素阳性率为 80 .9% (17/ 2 1)。　结论　存活素与膀胱癌发生发展有关 ,检测膀胱癌组织中存活素表达可能对判断膀胱癌预后有一定意义。     

谷氨酸对培养大鼠皮层神经细胞损伤作用的研究

目的 探讨谷氨酸对体外培养的大鼠皮层神经细胞的损伤作用。方法 在对体外新生大鼠(0-ld)大脑皮层神经细胞进行原代培养的基础上,分组加入不同浓度的谷氨酸,作用10分钟,24小时后测定细胞死亡率、乳酸脱氢酶(LDH)活性及超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果 培养大鼠皮层神经细胞在谷氨酸50μmol／L作用10分钟后,细胞死亡率和LDH活性明显增加,SOD活性显降低,神经细胞MDA含量则明显增高。结论 谷氨酸可损伤培养大鼠皮层神经细胞,这种作用在某种程度上是由氧自由基介导的。     

Expression from a Dlx gene enhancer marks adult mouse cortical GABAergic neurons.

In this paper we analyse the expression pattern of a zebrafish dlx4/6 enhancer/reporter construct in embryonic transgenic mice. We show that the pattern of LacZ/beta-galactosidase in cells that tangentially migrate from the ganglionic eminences to the cerebral cortex is identical to that of various subpallial markers, namely Dlx and GAD genes, that are known to label this population. Because beta-galactosidase activity persists long after expression of the Dlx genes and the transgene becomes undetectable, we were able to analyse the beta-galactosidase-positive cell population of the mature cortex through X-gal staining and immunohistochemistry. We show that this population is largely identical with the adult cortical and hippocampal interneuron population, providing further evidence for their subpallial origin.     

丙泊酚诱导大鼠原代培养皮层神经元凋亡

目的探讨丙泊酚对原代培养皮层神经元凋亡的影响及可能机制。方法原代培养7d的大鼠皮层神经元,随机分为两组:对照组(给予相同容积的20%脂肪乳剂)和丙泊酚组(丙泊酚终浓度为500μmol/L),上述药物处理12h后,采用MTT法检测两组神经元存活率,Hoechst33258核染色法检测神经元的凋亡,罗丹明染色检测线粒体膜电位,Western blot法检测神经元cyt-c和cleaved-caspase-3蛋白含量。结果丙泊酚组皮层神经元存活率(54.4%±6.4%),明显低于对照组(99.8%±4.1%)(P0.05);神经元凋亡率(46.5%±5.3%),明显高于对照组(7.2%±0.9%)(P0.05),线粒体膜电位(59.6%±4.3%)明显低于对照组(99.9%±5.7%)(P0.05);cyt-c蛋白含量(0.38±0.03),明显高于对照组(0.15±0.02)(P0.05),cleaved-caspase-3蛋白含量(0.46±0.04)明显高于对照组(0.13±0.02)(P0.05)。结论丙泊酚可诱导发育期原代培养皮层神经元凋亡,其机制可能与抑制线粒体膜电位,增加cyt-c和cleaved-caspase-3蛋白含量有关。