日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫筛选及其生物信息学分析

目的筛选新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子,并对其进行生物信息学分析。方法以血吸虫病人血清筛选日本血吸虫15d肝期童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,将结果通过Internet送入NCBI GenBank进行同源性比较并利用蛋白质分析软件进行生物信息学分析。结果经3轮筛选,共获15个阳性克隆,对其进行测序,获得11个基因,其中5个为编码日本血吸虫线粒体的基因,1个为编码日本血吸虫肌球蛋白的基因,其他5个分别为编码SjCHGC05315、SjCHGC01371、SjCHGC04782、SjCHGC05166、SjCHGC09769的基因。结论从日本血吸虫肝期童虫cDNA文库中筛选到一批日本血吸虫基因,为血吸虫病新的诊断候选分子的研究提供了材料。     

日本血吸虫童虫cDNA文库免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定

用日本血吸虫感染14 d的小鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,将获得的7个阳性克隆进行核苷酸序列同源性分析,结果显示其中一个克隆所测序列与日本血吸虫HSP70有很高的同源性（分值score=650）,另有2个克隆所测序列分别与已报道的日本血吸虫FABP（score=229）和含锌指结构的CDGSH型蛋白样蛋白（score=246）明显同源,其余4个未找到已知的同源序列,为新基因。4个新基因序列已被GenBank接受（登录号为EU121231、202646、202647和202648）。     

日本血吸虫(中国大陆株)虫卵cDNA文库的构建

应用定向克隆方法，将日本血吸虫虫卵ｃＤＮＡ片段重组入噬菌体载体λｇｔ１１Ｓｆｉ－Ｎｏｔ的ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切位点之间。所构建的基因表达文库的容量为１．０７×１０７重组子。经含有ＩＰＴＧ及Ｘ－Ｇａｌ的颜色选择平皿测定，初步提示重组效率达１００％。     

日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库的免疫筛选及PCR初步鉴定

用成虫抗原免疫免血清筛选构建于表达载体λgt11的日本血吸虫成虫cDNA文库，再以多聚酶链反应（PCR）技术鉴定免疫筛选的阳性克隆。结果，对cDNA表达库中随机选取的约6.2×104个噬菌斑进行了筛选．初筛时共挑出52个可能的阳性斑，经两次复筛后，有25个噬菌仍呈阳性反应；以阳性噬菌斑DNA为模板，经PCR扩增均可获得一定大小的片段，从564bp到1200bp不等。这样能快速大量地筛选cDNA文库，便于高效地获得有价值的重组抗原基因克隆。     

日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建

目的 构建日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。 方法 用Trizol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA，分离纯化mRNA，经随机引物反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头，再用EcoRⅠ和HindⅢ消化，使其成为两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。收集300 bp以上的双链cDNA片段，与T7Select 10-3b载体连接，经体外包装后，以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。通过滴度测定及PCR技术鉴定文库质量，用7种特异性引物以PCR法从文库中钓取目的基因以检测文库的代表性。 结果 原始文库的库容量为4.98×10⁶ pfu，扩增后文库滴度为3.85×10¹¹ pfu/ml。对随机挑取的96个噬菌斑进行PCR鉴定，重组率为93.8%，其中95.6%的插入片段大于300 bp。7种特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。 结论 构建了日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。     

日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定

目的　免疫法筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,S j) 15d肝期童虫cDNA表达文库 ,并进行鉴定 ,以获得S j疫苗候选抗原分子。方法　采用紫外线照射致弱尾蚴免疫的兔血清 ,对S j中国大陆株 15d肝期童虫cDNA文库进行免疫学筛选 ,选取部分阳性克隆进行插入片段的核苷酸序列分析 ,将结果通过Internet送入NCBIGenBank进行同源性比较 ,并将发现的新基因送入GenBank登录。结果　对大约 10 4个噬菌斑进行了初筛 ,共获得 4 9个阳性克隆 ,复筛了其中的 12个克隆 ,获得 8个持续阳性反应克隆。对 6个克隆的核苷酸序列测定及同源性分析表明 ,2个为编码S j线粒体的基因 ,另外 4个为S j未知基因 ,新基因序列已被GenBank接受 ,并获得进入编号。 结论　从S j肝期童虫cDNA文库中筛选到一批S j基因 ,其中部分为未知基因 ,为血吸虫新的疫苗候选分子的研究提供了材料。     

日本血吸虫童虫文库免疫筛选及其高丰度表达膜蛋白初步鉴定

目的 获得新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子并对其鉴定。 方法 免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库，对获得的阳性克隆进行测序分析，设计引物体外扩增目的蛋白基因，将其亚克隆入原核表达载体pET28a中，并转化大肠埃希菌BL21，进行诱导表达，最后用Western blotting鉴定。 结果 获得34个阳性克隆，选择其中24个进行测序，其中13个是日本血吸虫相对分子质量（Mr）为22 600膜相关蛋白（Sj22.6）基因。Sj22.6基因在体外被成功扩增，并被亚克隆入pET28a中进行表达。Western Blotting 结果显示，菌体表达的条带可以被感染兔血清以及血吸虫患者血清识别。 结论 Sj22.6膜相关蛋白基因在童虫cDNA文库中可以被高频率筛出，融合蛋白Sj22.6成功地在BL21中表达并具有免疫反应性。     

日本血吸虫童虫保护性单克隆抗体的建株和鉴定

本研究获8株抗日本血吸虫(中国大陆株)童虫的单克隆抗体,从中确定一株具有体内保护性功能的单克隆抗体(编号为N15D9),其保护率范围为14-39％。经间接免疫荧光法和ELISA试验检测,N15D9能与尾蚴、3h龄机械转化童虫和5d龄肺童虫的表膜抗原反应。经3h龄机械童虫可溶性抗原的免疫印迹法分析,N15D9能识别132、96和10kDa抗原分子。     

人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库的构建及鉴定

目的　构建人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库。方法　从人大肠癌组织中提取总RNA ,RT PCR反转录合成cDNA第 1链 ,用长距离PCR技术合成cDNA第 2链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段后与λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装 ,构建成cDNA噬菌体表达文库。转染E .coliXL1 Blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,确定文库容量大小 ,测定重组率。用EXTagTM酶做PCR和SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小。结果　构建成含 2 .39× 10 6pfu/ml重组子的人大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 97.5 %。插入的外源cDNA片段大小为 5 0 0bp～ 4kb ,平均长约 1.4kb。 结论　成功构建高质量人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,适合于免疫筛选cDNA克隆的人大肠癌相关抗原基因。     

人胰岛细胞瘤cDNA文库的构建

采用一种简单高效的互补脱氧核糖核酸（ｃＤＮＡ）克隆技术制备人胰岛细胞瘤的ｃＤＮＡ文库。方法的主要过程如下：以人胰岛细胞瘤的Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋－ＲＮＡ为模板，以含ＮｏｔＩ切点的ｏｌｉｇｏ－（ｄＴ）１５为引物，在反转录酶作用下合成第一股单链ｃＤＮＡ；用Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ除去Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋－ＲＮＡ，并以Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ和Ｔ４ＤＮ     

伊氏锥虫cDNA表达文库的构建

目的构建伊氏锥虫cDNA表达文库。方法利用DEAE-纤维素柱从小鼠血液中纯化伊氏锥虫,Trizol法提取总RNA,采用poly(A)Quik mRNA Isolation kit分离纯化mRNA。运用cDNA Synthesis Kit合成cDNA,以XR-λZAP为载体,构建伊氏锥虫cDNA表达文库。结果伊氏锥虫cDNA表达文库重组率为98%,滴度为0.9×106pfu/ml,扩增后滴度为1×109pfu/ml结论成功构建伊氏锥虫cDNA表达文库,为伊氏锥虫免疫相关因子的基因筛选奠定了基础。     

细粒棘球蚴cDNA文库的构建和免疫筛选

目的 构建细粒棘球蚴原头节的λZAPⅡcDNA文库,并对构建的文库进行免疫筛选.方法 采集感染细粒棘球蚴的绵羊育囊中的原头节,用Trizol试剂抽提总RNA,用mRNA纯化试剂盒纯化mRNA作为模板合成cDNA,并对其进行末端平端化、EcoR Ⅰ接头连接和磷酸化及Xho Ⅰ酶切,然后应用Sepharose CL-2B分离柱对其进行分级分离,收集大于500 bp的cDNA片段,使用GigapackⅢGold试剂盒将合成的cDNA连接到λZAP-Ⅱ载体,并将重组载体包装到λZAP-Ⅱ噬菌体中,构建细粒棘球蚴cDNA文库.用囊型棘球蚴病患者混合血清对所构建的文库进行免疫筛选,并用NCBI中的Blast模块及其它生物信息软件对筛选出的阳性克隆进行生物信息学分析.结果 成功构建了细粒棘球蚴原头节λZAPⅡcDNA文库,文库的滴度为1.8 ×105噬菌斑形成单位(plaque forming unit,pfu)/ml,插入片段长度范围在1.0～4.0 kb间,平均插入片段长度为2.6 kb,插入效率为93.8％.对所构建的文库进行免疫筛选,共筛选到5个阳性克隆,其中有2个为细粒棘球蚴新发现基因,新发现基因存在众多B细胞表位.结论 成功构建了细粒棘球蚴原头节λZAPⅡcDNA文库,初步免疫筛选得到2个新发现基因,生物信息学分析预测它们具有潜在的诊断价值.     

人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建

目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库。方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA．合成双链cDNA，经RsaI酶切后，将胰腺癌双链cDNA分为两组，分别加上不同的接头，再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段。将该差异表达片段克隆至T／A载体，并转化大肠杆菌TOP10F’，经蓝白斑筛选后，再用PcR方法筛选阳性克隆，从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库。结果文库扩增后得到257个白色克隆，随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析，其中47个克隆有插入片段．克隆阳性率为94％，片段大小主要集中在300～600bp之间。结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库，为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础。     

广州管圆线虫成虫cDNA文库构建

目的　构建广州管圆线虫成虫cDNA文库。方法　提取广州管圆线虫成虫总RNA ,用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA ,然后通过长距离PCR方法合成双链cDNA并扩增 ;PCR产物与λTripIE× 2载体连接并包装 ,建成未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库扩增及测定扩增文库的滴度。结果　经测定 ,未扩增文库滴度为 9 7× 1 0 6 pfu/ml,重组效率达 99 2 %以上 ,文库扩增后滴度达 9 1 3× 1 0 9pfu/ml。结论　已成功构建了广州管圆线虫成虫cDNA文库     

镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA文库的构建

目的 为了筛选抗蜱及蜱传疾病基因工程疫苗的抗原候选分子,构建了镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA表达文库。方法 用Frizol试剂提取镰形扇头蜱半饱血雌蜱总RNA,经反转录合成cDNA第一链,应用长链PCR(LD-PCR)扩增方法,合成双链cDNA。双链cDNA(ds cDNA)在Sfi I内切酶的作用下,形成两端分别带有Sfi I A和Sfi I B的粘性末端。经CHROMA SPIN-400柱纯化,收集500bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有Sfi工A和Sfl I B末端的λTriplEx2噬菌体载体,经体外包装后,以XL1-Blue为受体菌构建cDNA噬菌体表达文库。结果 经测定,库容量为4.2×106,重组率为96％。扩增后的文库滴度为2.04×1010pfu/ml。通过对文库中随机挑选的15个克隆进行序列分析,获得一个编码线粒体ATP酶第6亚基蛋白的全长cDNA序列。结论 结果显示,镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA表达文库已构建成功。     

粉尘螨cDNA文库的构建

目的构建粉尘螨cDNA表达文库。方法提取粉尘螨总RNA和mRNA,以NotIdT18作为引物反转录合成第一链,置换法合成第二链。加EcoRI接头,经NotI酶切后,应用定向克隆技术将相应dscDNA片段插入λExCell/NotI/EcoRI/CIP载体的NotI和EcoRI双酶切位点间,经包装、转染宿主菌,构建成cDNA文库。检测文库库容量和重组效率,并采用PCR方法对插入片段大小进行分析。结果已成功构建一个含4.8×105个重组子的cDNA表达文库,重组率为100%,插入片段大小平均约1.2kb。结论所建文库容量及插入片段大小适合对粉尘螨特异性重组变应原的进一步研究。