干扰Itk表达抑制CVB3感染小鼠的炎症反应

目的 研究在病毒性心肌炎小鼠模型上敲减Itk蛋白的表达对小鼠炎症反应的影响.方法 BALB/c小鼠尾静脉注射表达Itk-shRNA的质粒后感染CVB3,第4天后观察Itk基因的抑制情况、小鼠存活率,PBMC增殖率及部分炎症性细胞因子的分泌水平.结果 Itk-shRNA转染至小鼠体内后脾细胞中Itk基因的mRNA水平与空白对照组及转染shRNAnon的对照组相比,敲减率约40％(P＜0.05).与转染shRNAnon组相比,Itk-shRNA组中Itk基因表达的抑制导致小鼠PBMC增殖活性降低约41％,小鼠的存活率提高(P＜0.05).Itk-shRNA组血清中细胞因子水平降低.结论 抑制Itk表达能有效降低小鼠PBMC的增殖,同时减少炎症相关细胞因子的分泌,提高小鼠的存活率.     

胆固醇缺乏对Jurkat细胞增殖的影响

利用间接免疫荧光染色、荧光探针标记、免疫细胞化学染色及免疫印迹等实验方法 ,从细胞增殖转化功能、细胞膜脂质流动性、蛋白酪氨酸激酶 (PTK )活性以及细胞周期调控蛋白表达的变化等方面探讨了胆固醇缺乏对Jurkat细胞的功能影响及其分子机制。结果显示 :经去脂血清培养基培养的Jurkat细胞加洛伐他丁处理 3d后 ,细胞膜脂流动性明显增大 ,细胞生长速度明显下降 ,细胞增殖受抑 ,PTK活性及细胞周期素D1(cyclinD1)、周期素依赖性激酶 4 (CDK4 )蛋白的表达明显降低 ,加入低密度脂蛋白可以部分逆转上述变化。结果提示 ,无论是内源性还是外源性胆固醇的缺乏都能使Jurkat细胞膜脂流动性发生变化 ,细胞PTK活性下降 ,cyclinD1、CDK4蛋白表达降低 ,推测这一变化与细胞增殖受抑有直接关系     

两种SYK蛋白异构体在乳腺癌中的表达及其对细胞侵袭力的影响

目的： 探讨2种SYK蛋白异构体在乳腺癌中的表达和各自对乳腺癌细胞侵袭力的影响。方法： 采用Western blotting方法检测乳腺癌细胞MB435、ZR75.1、MB46、T47D和MCF 7中SYK的表达；采用SYK(-)的乳腺癌细胞系MB435构建表达SYK(L)或者SYK(S)的稳定细胞株，采用体外细胞侵袭力试验检测SYK(L)和SYK(S)对细胞侵袭力的影响。结果： SYK(L)和SYK(S)在大部分乳腺癌细胞系中同时表达；采用Fugene 6转染和G418筛选方法成功构建SYK(L)或SYK(S)稳定细胞株；SYK(L)在乳腺癌细胞中表达可以抑制细胞的侵袭力，SYK(S)对细胞的侵袭力没有影响。结论： 2种SYK蛋白异构体在乳腺癌细胞系中普遍同时表达；只有SYK(L)可以抑制乳腺癌细胞的侵袭性。     

弱恒磁场对人脐静脉及兔主动脉内皮细胞增殖的影响

目的：研究弱恒磁场对人脐静脉内皮细胞及兔主动脉内皮细胞增殖的影响，并对其机制进行探讨。方法：体外培养的第2-4代人脐静脉内皮细胞及3-8代兔主动脉内皮细胞，分为对照组、磁场组及磁场+酪氨酸激酶抑制剂组。磁场磁感应强度为0.5 Gs, 作用时间为48 h。用[³H]-TdR法及MTT法测定细胞增殖。结果：磁场组细胞增殖显著高于对照组及磁场+酪氨酸激酶抑制剂组（P<0.05）；酪氨酸激酶抑制剂genistein完全阻断了磁场的促增殖作用，磁场+酪氨酸激酶抑制剂组细胞增殖与对照组无明显区别（P>0.05）。结论：0 5 Gs的恒磁场可以促进人脐静脉及兔主动脉内皮细胞的增殖，这一作用依赖于酪氨酸激酶途径。     

pGenesil-siHBV X 对 HepG2.2.15 细胞 HBV 表达和复制的抑制效果研究

 目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA（siRNA）表达载体质粒pGenesil-siHBV X 对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil- siHBV X。分别用培养液（空白对照）、脂质体Metafectene、pGenesil 空载体、pGenesil-siHK（阴性对照）、pGenesil-siAFP（特异性对照）、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24 h，取各组细胞培养上清液，用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量，用化学发光法检测AFP含量，用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。 结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达，且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后，pGenesil-siHBV X组细胞上清液中 HBsAg、 HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为（6.26 ± 1.07）ng/ml 、（0.13 ± 0.05）Ncu/ml和（3.01 ± 0.40）×107拷贝/ml，与空白对照组的（22.50 ± 1.39）ng/ml、（1.12 ± 0.11）Ncu/ml和（12.33 ± 1.28）×107拷贝/ml比较，差异有统计学意义（t值分别为12.80、12.21、9.71，P < 0.05）；pGenesil-siHBV X 转染不影响细胞对AFP的表达（t = 0.18，P = 0.86）。结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2. 15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。     

人酪氨酸激酶6原核表达载体的构建、表达、纯化与鉴定

目的构建人络氨酸激酶6(PTK6)与His融合蛋白重组表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,并对重组蛋白进行纯化。方法通过PCR在编码PTK6的cDNA序列两端添加EcoR I和BamH I酶切位点,双酶切后将编码PTK6的cDNA序列亚克隆至原核表达载体PHUE构建重组蛋白表达载体PHUE/PTK。重组载体经鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞。IPTG诱导重组蛋白表达。收集菌体裂解后,用尿素洗涤和溶解包涵体。溶解上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化产物。结果成功构建人PTK6重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为55 000,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度大于80%的目的重组蛋白。结论人PTK6 His融合蛋白的纯化为多克隆及单克隆抗体的制备以及结构和功能的研究奠定了基础。     

高表达衔接蛋白Src羧基端激酶结合蛋白对Jurkat细胞形态及功能的影响

背景：衔接蛋白分子的联动和协同有效调控T细胞的信号转导,形成级联放大或限制,最终实现T细胞复杂的免疫功能。蛋白分子Src羧基端激酶结合蛋白正是衔接蛋白的一种,其主要是通过负反馈调节Src家族激酶活性。而这种负反馈调节作用依赖于Src羧基端激酶结合蛋白的Y317,可能涉及Src羧基端激酶的SH2结构域。 目的：探索衔接蛋白Cbp对Jurkat细胞形态及功能的作用。 方法：构建仅表达增强绿色荧光蛋白的融合蛋白和Src羧基端激酶结合蛋白-增强绿色荧光蛋白的融合蛋白的病毒颗粒。将Jurkat细胞分为未转染组、阴性对照组和Src羧基端激酶结合蛋白组,后2组转染仅表达增强绿色荧光蛋白的病毒和转染Src羧基端激酶结合蛋白-增强绿色荧光蛋白的病毒。 结果与结论：细胞转染效率大于95%, Src羧基端激酶结合蛋白定位于细胞膜上。转染Src羧基端激酶结合蛋白-增强绿色荧光蛋白病毒的Jurkat细胞,皱缩细胞增多,大小均一性较差,细胞坏死凋亡的数量增加,细胞中Src羧基端激酶结合蛋白基因表达上调,Src羧基端激酶表达下降,而酪氨酸蛋白激酶表达增加。提示Jurkat细胞转染Src羧基端激酶结合蛋白后,可使细胞存活率下降,细胞信号转导功能减弱。  中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

十字孢碱对宫颈癌细胞中Btk表达的影响

目的 探讨十字孢碱对宫颈癌细胞生长及酪氨酸激酶 Btk(tyrosine kinase)基因和蛋白表达的影响.方法用不同浓度的十字孢碱处理宫颈癌 HeLa 细胞24 h,采用 MTT 比色法分析 IC50.用不同浓度十字孢碱处理 HeLa 细胞 24 h,Real-time PCR检测酪氨酸激酶Btk mRNA表达的变...     

RNA干扰技术抑制Polo-like激酶1表达对A549细胞的影响

目的： 观察RNA干扰技术能否有效抑制非小细胞肺癌细胞株A549细胞中Polo-like激酶1（Plk1）的表达水平，以及抑制后对A549细胞生长的影响。方法： 运用脂质体法，以Plk1为靶点，构建能产生siRNA的质粒载体psiRNA-hH1-Plk1并转入A549细胞。RT-PCR检测Plk1 mRNA表达的变化、Western blotting检测Plk1、cyclin B1、p53蛋白的表达变化、细胞计数分析细胞增殖、流式细胞术分析细胞周期变化和凋亡、免疫荧光染色检测α微管蛋白的表达。结果： psiRNA-hH1-Plk1质粒能特异地抑制Plk1基因的表达并使其活性下降，致使cyclin B1及p53蛋白的表达水平升高，微管聚集障碍或形成单极的纺锤体；A549细胞增殖减慢，出现G2/M期阻滞和凋亡。结论： 上述结果提示针对Plk1基因的RNA干扰有望用于肿瘤的基因治疗。     

慢病毒靶向携带survivin-siRNA抗肺腺癌裸鼠体内研究

目的探讨慢病毒载体介导survivin-siRNA对人肺腺癌裸鼠移植瘤的体内抑瘤活性。方法参考siRNA的设计策略,构建表达survivin-siRNA的慢病毒载体;于各BALB/C裸鼠右侧腋窝皮下接种人肺腺癌A549细胞悬液,构建人肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型,肿瘤组织局部注射survivin-siRNA的慢病毒载体,观察肿瘤的体积及随时间变化的生长曲线;通过碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色检测细胞凋亡情况;流式细胞术检测肿瘤细胞周期变化。结果慢病毒载体介导survivin-siRNA对裸鼠人肺腺癌A549的抑瘤率为46.07%;经过PI和Annexin-V染色区分凋亡早晚期的细胞为30%~35%,荧光显微镜下观察肿瘤细胞凋亡;G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例则明显减少。结论慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌A549的survivin基因的表达,有效激发细胞凋亡。     

Itk蛋白在人PBMC增殖和细胞因子产生中的作用研究

利用RNA干扰的方法抑制人外周血单个核细胞(PBMC)中Itk基因的表达,探讨其抑制Itk后对人PBMC增殖和炎症性相关细胞因子产生的影响。设计针对Itk基因的siRNA序列,与外源表达Itk的pEGFP-C1-hItk质粒共转染至HeLa细胞,筛选出有效的干扰序列;利用电转染的方法将有抑制Itk作用的siRNA转染至人PBMC,检测Itk抑制状态,同时观察细胞增殖率及炎症性细胞因子产生水平的变化。实验表明,Itk-siRNA有效地抑制了Itk蛋白的表达;Itk受到抑制后细胞增殖率明显低于对照组(P0.05);几种重要炎性细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-5、IL-10和IL-4产生水平下降。实验验证了Itk蛋白在人PBMC增殖和炎性细胞因子产生方面的重要作用。     

外周血T细胞亚群及细胞因子对外源性哮喘IgE生成的作用

对３０例哮喘患者及３０例健康成年人的外周血，采用单克隆抗体（ＭｃＡｂ）间接免疫荧光法测定Ｔ细胞亚群；ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法测定ＩｇＥ、ＩＬ－４；ＦＩ２细胞株，生物学方法测定ＩＬ－２；ＩＬ－６依赖细胞株７ＴＤ１，掺入法测定ＩＬ－６；用抗人ＣＤ２３的ＭｃＡｂ测定ＣＤ２３。为研究Ｔ细胞、细胞因子对哮喘ＩｇＥ生成调节机理及细胞因子在哮喘发病过程中的作用。结果显示：发作期ＩｇＥ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＣＤ２３、ＣＤ８~＋、ＣＤ４／ＣＤ８~＋比值较对照组及缓解期有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。缓解期ＩｇＥ与对照组之间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）；ＣＤ８＋、ＣＤ４／ＣＤ８比值，ＣＤ２３与对照组之间有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。ＣＤ２３、ＣＤ４、ＩＬ－６三组间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。结果表明，ＩｇＥ合成增加是哮喘发作的关键，Ｔ细胞对日细胞合成ＩｇＥ的调节是通过细胞因子实现的，细胞因子又参与气道炎症过程。     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞产生促炎因子的调节作用

研究α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞产生促炎因子的调节作用,探讨α-MSH的抗炎与免疫调节机制。用不同浓度α-MSH处理ECV304细胞,或在LPS/TNF-α处理的同时加不同浓度的α-MSH培养ECV304细胞。用ELISA检测上清中TNF-α和IL-8,以Greiss法测定NO,RT-PCR检测组织因子(TF)mRNA,Westernblot检测TF蛋白表达。结果显示,α-MSH抑制ECV304细胞产生NO、TNF-α,但促进IL-8的释放。LPS或TNF-α能上调ECV304细胞表达TF mRNA,而α-MSH抑制这种上调作用,并抑制ECV304细胞表达TF蛋白。上述结果提示α-MSH可通过调节血管内皮细胞表达促炎因子而发挥抗炎和免疫调节作用。     

细胞因子对HLA-B27启动子的调节作用及其在强直性脊柱炎发病机制中的意义

目的： 构建含HLA-B27启动子的HeLa稳定转染细胞株，观察7种细胞因子对HLA-B27启动子及其上游NF-κB及ISRE顺式作用元件活性的调节作用，探讨强直性脊柱炎（AS）等B27相关疾病的发生机制。方法:转染HeLa细胞，抗生素筛选单克隆构建含HLA-B27启动子的稳定转染细胞株。构建HeLa-B27稳定细胞株和HeLa-NF-κB稳定细胞株，在瞬时转染pISRE-luc的HeLa细胞中加入白细胞介素1α（IL-1α）、 白细胞介素1β（IL-1β）、 肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素α（IFN-α）、干扰素β（IFN-β）、 干扰素γ（IFN-γ）和转化生长因子β（TGF-β），观察7种细胞因子对B27启动子及其上游NF-κB和ISRE作用元件的调节作用。另外在HeLa-B27 稳定细胞株培养液中同时加入3种细胞因子单克隆抗体和相应细胞因子，观察其对启动子活性的调节作用。结果:TNF-α、IFN-α、IFN-β 和 IFN-γ 均能明显增强HeLa细胞B27启动子活性。细胞培养96 h 后，IFN-β为最强的启动子诱导剂（5.4倍，P<0.05）；细胞培养8 h 内，TNF-α、IL1-α 和 IL1-β,可诱导NF-κB的活性增加30倍左右（P<0.05），IFN-α 和IFN-β 可诱导ISRE的活性增加12倍左右（P<0.05），抗TNF-α 抗体对于I类IFN 增加的B27 启动子活性没有明显的抑制作用。结论：TNF-α和IFN 可通过结合于B27 启动子中各种转录因子结合元件调控HLA-B27启动子的转录活性，IFN-β 可能在强直性脊柱炎等B27 相关的脊柱关节病的发病机制中起着重要作用。     

RNA干扰抑制肝星状细胞CTGF表达对细胞外基质分泌的影响

目的：利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，筛选有效的抑制序列后，研究其对HSC-T6中TGF-β₁、CTGF及细胞外基质表达的影响。方法:1.分别设计3对针对CTGF的有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，构建重组体成功后转染HSC-T6，24 h后通过RT-PCR及Western blotting分析HSC-T6 CTGFmRNA及蛋白表达水平，筛选出有效抑制CTGF表达的序列。2.将已构建并筛选出有最高抑制效率的pEGFP-CTGFshRNA转染HSC-T6 ，培养24、48 h后用RT-PCR和/或Western blotting检测各组细胞中TGF-β₁、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达;放免法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量。结果:将构建成功的3组pEGFP-CTGFshRNA转染肝星状细胞后，筛选出两组能高效抑制CTGF表达的序列; pEGFP-CTGFshRNA能明显抑制HSC-T6 CTGF、Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白的表达，降低上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量(P<0.01或P<0.05)，而对TGF-β₁的基因表达则无影响。结论:pEGFP-CTGFshRNA能高效抑制肝星状细胞中CTGF及细胞外基质的表达;CTGFshRNA介导的RNA干扰有望对慢性肝病所致肝纤维化具有治疗潜力。     

PIAS3敲低对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究PIAS3敲低对人前列腺癌细胞系DU145细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法构建PIAS3shRNA表达质粒pSilencer4.1/PIAS3,转染DU145细胞。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡。结果测序证实PIAS3shRNA表达质粒构建成功。转染后DU145细胞PIAS3蛋白表达明显下调。MTT分析显示PIAS3敲低促进细胞增殖,并存在剂量-效应关系。流式细胞术分析显示:PIAS3敲低后S期细胞比例增加,G0/G1期细胞比例减少,凋亡细胞比例减少。结论PIAS3敲低促进体外前列腺癌细胞增殖,抑制其凋亡。     

Ebastine inhibits T cell migration, production of Th2-type cytokines and proinflammatory cytokines

BACKGROUND: Cytokine imbalance and cellular migration to inflammatory sites are critical components of allergic diseases. Redirecting cytokine imbalance and inhibiting cell migration therefore represent important therapeutic strategies for the treatment of these disorders. OBJECTIVES: To study the in vitro effect of ebastine, a novel non-sedating H1 receptor antagonist, on cytokine secretion and migration of activated T cells, as well as production of pro-inflammatory cytokines by macrophages. METHODS: Peripheral T cells obtained from healthy volunteers were cultured in wells coated with the combination of anti-CD3 monoclonal antibody (mAb) and anti-CD26 mAb, anti-CD3 mAb and anti-CD28 mAb, or anti-CD3 mAb with PMA, in the presence or absence of ebastine. T cell proliferation and the production of cytokines were measured by [3H]thymidine incorporation assay and ELISA, respectively. In addition, transendothelial migration of T cells and production of pro-inflammatory cytokines by macrophages were examined. RESULTS: Ebastine inhibited T cell proliferation and the production of IL-4, IL-5, IL-6, and TNF-alpha by T cells under each co-stimulatory condition tested, whereas it exhibited no effect on the production of IL-2 or IFN-gamma. In addition, T cell migration and the production of such pro-inflammatory cytokines as TNF-alpha and IL-6 by macrophages were inhibited by ebastine. CONCLUSIONS: These results indicate that ebastine has a specific inhibitory effect on Th2-type cytokine production. Moreover, ebastine inhibited T cell migration and pro-inflammatory cytokine production by T cells and macrophages, suggesting that ebastine might be useful for the treatment of T cell-mediated allergic inflammatory disorders, including asthma, atopic dermatitis, and Th2-type autoimmune diseases.     

Post-translational and cell type-specific regulation of CXCR4 expression by cytokines

We have investigated the regulation and function of the chemokine receptor CXCR4 on neutrophils. CXCR4 is hardly detectable on neutrophils in the peripheral blood. However, overnight culture strongly up-regulates CXCR4 expression on the cell surface. The functional activity of CXCR4 on cultured neutrophils was confirmed by stromal cell-derived factor (SDF)-induced migration and up-regulation of the integrins CD11b and CD11c. CXCR4 surface expression on neutrophils but not on lymphocytes and monocytes is rapidly down-regulated after stimulation with TNF-alpha and IFN-gamma, resulting in significantly decreased SDF-induced functional responses of neutrophils. In contrast to surface expression, CXCR4 mRNA expression was several-fold increased in cytokine-stimulated neutrophils, suggesting a post-translational regulation. By confocal microscopy we demonstrate that CXCR4 is internalized after stimulation with TNF-alpha and IFN-gamma. Tauhe down-modulation of CXCR4 surface expression in response to TNF-alpha and IFN-gamma was fully reversible after cytokine removal. Further, CXCR4 down-modulation could be completely blocked by hypertonic sucrose and significantly reduced by chlorpromazine indicating the involvement of clathrin-coated pits. Internalization of CXCR4 by cytokines in a cell type-specific manner is a novel and functionally important mechanism of chemokine receptor regulation.