凝血酶对大鼠血管平滑肌细胞血小板源性生长因子基因表达的影响

为了研究凝血酶对血管平滑肌细胞血小板源性生长因子基因表达的影响 ,探讨凝血酶刺激血管平滑肌细胞增殖的机制 ,通过培养SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞 ,以3 H -TdR掺入率作为评价凝血酶促血管平滑肌细胞增殖的指标 ;用反转录聚合酶链反应检测凝血酶对血管平滑肌细胞血小板源性生长因子A链mRNA表达的影响 ;用Dotblot检测凝血酶对血管平滑肌细胞血小板源性生长因子B链mRNA表达的影响。结果表明 ,凝血酶促血管平滑肌细胞增殖呈浓度依赖性和时间依赖性 ,血管平滑肌细胞在基础状态下可检测到血小板源性生长因子A和B链mRNA表达 ,凝血酶刺激血管平滑肌细胞后 2h血小板源性生长因子A链mRNA表达开始增加 ,4～ 6h达高峰 ,持续 12h ,2 4～ 48h恢复正常。提示凝血酶对血管平滑肌细胞具有较强的促增殖作用 ,凝血酶促血管平滑肌细胞的增殖作用部分可能是通过诱导血管平滑肌细胞血小板源性生长因子A链mRNA的表达来实现的。     

凝血酶与血管平滑肌细胞增殖研究进展

凝血酶是血管平滑细胞表达的选择增殖促进剂，其作用通过血管平滑肌细胞表达的选择性受体所介导。凝血酶受体的激活导致细胞内信号传递和内源性血小板源生长因子A链和碱性纤维母细胞生长因子的产生。凝血酶抑制剂可阻断凝血酶受体的激活、细胞内信号传递和凝血酶诱导的血小板源生长因子A链和碱性纤维母细胞生长因子表达。凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖可被抗血小板源生长因子和碱性纤维母细胞生长因子抗体所阻断，因而认为凝血酶对血管平滑肌细胞的增殖作用可能是通过诱导血小板源生长因子A链和碱性纤维母细胞生长因子自分泌和（或）旁分泌来实现的。     

血小板源生长因子诱导核受体Nur77调节血管平滑肌细胞增殖

目的 研究血小板源生长因子诱导血管平滑肌细胞中核受体Nur77表达机制及其与血管平滑肌细胞增殖的关系,探讨阿托伐他汀对血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖和核受体Nur77表达的关系.方法 分离培养鼠血管平滑肌细胞,分别与PD98059、阿托伐他汀、核受体Nur77siRNA孵育后应用血小板源生长因子刺激,检测核受体Nur77、细胞外调节蛋白激酶表达;检测增殖细胞核抗原表达.结果 血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞中核受体Nur77通过ERK-MAPK信号途径表达.阿托伐他汀减少血小板源生长因子诱导的核受体Nur77表达,抑制血管平滑肌细胞增殖.在核受体Nur77沉默后的血管平滑肌细胞中,血小板源生长因子诱导的细胞增殖减少.结论 血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖受核受体Nur77调控,阿托伐他汀降低核受体Nur77表达,减少血管平滑肌细胞增殖,这可能是他汀类药物抗细胞增殖的新的途径.核受体Nur77可能是减少再狭窄的新的治疗靶点.     

血小板源生长因子对大鼠血管平滑肌细胞表达血管细胞粘附分子1的影响

目的本实验研究血小板源生长因子对血管平滑肌细胞表达血管细胞粘附分子1的影响以及对血管平滑肌细胞与单核细胞粘附的作用。方法利用基因芯片和RT-PCR技术检测鼠主动脉血管平滑肌细胞经血小板源生长因子处理0min、20min、6h后血管平滑肌细胞表达血管细胞粘附分子1的mRNA表达变化;细胞粘附实验观察血管平滑肌细胞经血小板源生长因子分别处理0min、20min、6h后与单核细胞粘附情况。结果血小板源生长因子对鼠血管平滑肌细胞表达血管细胞粘附分子1的表达有显著的诱导作用,其诱导作用在20min即已出现(P<0.05),6h时明显增强(P<0.01)。细胞粘附实验显示随着血小板源生长因子的作用时间的延长,血管平滑肌细胞与单核细胞的粘附率增高,血小板源生长因子处理20min和6h后粘附率是对照组的1.92倍和3.04倍(P<0.05)。结论血小板源生长因子明显诱导血管平滑肌细胞中血管平滑肌细胞表达血管细胞粘附分子1的表达,促进血管平滑肌细胞与单核细胞的粘附,从而参与了损伤早期,白细胞向内膜下迁移的炎症反应。     

外加电场诱导大鼠血管平滑肌细胞形态及迁移行为变化与血管紧张素Ⅱ受体和血小板源生长因子受体的关系

目的探讨电场作用下血管平滑肌细胞膜表面细胞生长因子受体表达的变化及其对细胞增殖迁移的影响。方法通过电场实验小室,对体外培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞给予直流电场干预,间断显微细胞图像记录和分析,研究不同强度电场、不同作用时间下血管平滑肌细胞迁移和细胞形态的变化;采用免疫细胞化学或免疫荧光染色方法,检测电场干预后与血管平滑肌细胞迁移密切相关的血小板源生长因子受体、血管紧张素Ⅱ1型受体和2型受体等受体的表达情况。结果①150V/m电场长时间作用下,培养的血管平滑肌细胞有明显的电场趋化性,细胞向负极迁移的距离明显高于无电场作用的对照组。②改进的电场干预装置作用下,血管平滑肌细胞膜血小板源生长因子受体表达增加,部分细胞内血小板源生长因子受体表达上调,呈不对称分布,在电场负极面较集中;细胞中血管紧张素Ⅱ1型受体表达亦增加,但无明显不对称分布现象;血管紧张素Ⅱ2型受体表达改变不显著。结论外加直流电场干预下,大鼠血管平滑肌细胞发生形状改变和定向迁移。血管平滑肌细胞中血小板源生长因子受体和血管紧张素Ⅱ1型受体表达上调和重分布,可能与细胞定向迁移的启动和维持有关。     

血小板源生长因子对大鼠血管平滑肌细胞表达基质金属蛋白酶2的影响

目的研究血小板源生长因子对血管平滑肌细胞迁移的影响和细胞产生基质金属蛋白酶2的变化。方法体外培养的血管平滑肌细胞经血小板源生长因子处理0 min、20 min和6 h后进行如下检测:迁移实验观察细胞在盖玻片上的迁移情况;明胶酶谱检测血管平滑肌细胞分泌基质金属蛋白酶2活性;基因芯片和逆转录-聚合酶链反应技术检测血管平滑肌细胞表达基质金属蛋白酶2 mRNA的变化。结果细胞迁移实验显示随着作用时间的延长,血小板源生长因子明显促进细胞的迁移,血小板源生长因子处理20 min和6 h后迁移距离(分别为4.9±0.5、7.1±1.2μm)是对照组(2.3±0.15μm)的2.13倍和3.09倍,差异有显著性(P<0.05);明胶酶谱测定表明:血小板源生长因子显著提高血管平滑肌细胞分泌的基质金属蛋白酶2的活性,作用20 min与6 h后(分别为480.7±27.3和851.5±56.4)是对照组(296.7±15.8)的1.62倍和2.87倍(P<0.01);血小板源生长因子对血管平滑肌细胞表达基质金属蛋白酶2有明显的诱导作用,作用20 min与6 h后的表达(分别为0.54±0.09和0.77±0.04)是对照组(0.3...     

反义凝血酶受体基因序列对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

为了研究凝血酶受体在血管平滑肌细胞增埴中的作用 ,探讨反义凝血酶受体基因序列对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响 ,通过培养SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞 ,以3 H TdR掺入率作为评价反义凝血酶受体基因序列抑制血管平滑肌细胞增殖的指标 ;用反转录聚合酶链反应检测反义凝血酶受体基因序列抑制血管平滑肌细胞凝血酶受体mRNA的表达 ;用Western blot检测反义凝血酶受体基因序列抑制血管平滑肌细胞凝血酶受体蛋白质的表达 ;用3 H 肌醇掺入率检测反义凝血酶受体序列抑制血管平滑肌细胞磷酸肌醇代谢的影响。结果发现 ,反义凝血酶受体基因序列明显抑制血管平滑肌细胞的增殖 (与对照组相比 ,P <0 .0 5 ) ;明显抑制血管平滑肌细胞的凝血酶受体mRNA和蛋白的表达 ;明显抑制了血管平滑肌细胞磷酸肌醇代谢。提示反义凝血酶受体基因序列明显抑制血管平滑肌细胞的增殖 ;凝血酶受体反义序列明显抑制血管平滑肌细胞的增殖是通过抑制凝血酶受体基因的表达 (特别是通过抑制DNA、mRNA和蛋白的表达 ) ,抑制细胞内信号传递来完成     

葛根素对血管平滑肌细胞增殖及Bcl-2蛋白和凝血酶受体mRNA表达的影响

目的观察葛根素对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖及Bcl-2蛋白和凝血酶受体mRNA表达的影响,旨在认识葛根素作用的分子机制。方法以细胞计数法和流式细胞仪DNA含量测定,细胞周期分析法观察凝血酶及葛根素对血管平滑肌细胞增殖和DNA合成的影响。凝血酶及葛根素等各处理因素作用24 h后,用免疫印迹法检测Bcl-2蛋白表达,以半定量逆转录聚合酶链反应检测凝血酶受体mRNA的表达。结果凝血酶对血管平滑肌细胞有明显促增殖作用,促增殖效应在24 h末达峰值,且凝血酶浓度在0.1~1.0 u/L之间有剂量依赖关系;葛根素呈剂量依赖性地抑制凝血酶诱导的细胞增殖、DNA合成及血管平滑肌细胞Bcl-2蛋白的表达;高浓度(1.5×10-3mol/L)葛根素可显著抑制凝血酶诱导的凝血酶受体mRNA上调。结论葛根素能抑制凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖,这可能与其抑制Bcl-2蛋白有关,并部分与其抑制凝血酶受体mRNA表达有关。     

血小板源生长因子和血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞中p57基因表达的影响

为观察血小板源生长因子BB和血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞p57蛋白和基因表达的影响及其在血管平滑肌细胞增殖增生中的作用。用贴壁法培养鼠胸主动脉平滑肌细胞,加入血小板源生长因子BB 20ug/L或血管紧张素Ⅱ 1umol/L刺激24h,用Western蛋白印迹法检测p57蛋白水平,用DNA芯片技术检测p57 mRNA的表达量,结果发现,血小板源生长因子BB刺激组p57 mRNA和p57蛋白表达量明显高于血管紧张素Ⅱ刺激组,分别为后者的2．47倍和1．7倍,而血管紧张素Ⅱ刺激组p57蛋白表达量与对照组接近,保持在较低水平,研究结果提示,在血小板源生长因子刺激引起的血管平滑肌细胞增殖过程中p57基因表达明显增高,p57基因的高表达可能起抑制血管平滑细胞过度增殖的作用。     

葛根素对大鼠主动脉球囊损伤后血小板活化及凝血酶受体表达的影响

目的研究球囊损伤后血管内膜增生的过程、血小板活化水平、凝血酶受体mRNA的变化及葛根素的影响。方法将72只雄性W istar大鼠随机分为对照组、手术组和葛根素治疗组,分别在术后3、7、14和28 d通过组织学检查、放射免疫法和逆转录聚合酶链反应技术检测内膜增生的情况、血小板表面GMP-140的数目、凝血酶受体mRNA的水平及葛根素〔50 mg/(kg.d)〕腹腔注射对它们的影响。结果①凝血酶受体mRNA在正常血管组织表达极弱,球囊损伤术后3 d已显著增加,术后14 d达峰值,术后28 d开始下降。②GMP-140于术后3 d明显升高,术后7 d开始下降。③术后3 d已有增殖的血管平滑肌细胞移行至内膜层;术后7 d内膜开始增生;术后14 d血管平滑肌细胞的增殖及内膜增生更为明显;术后28 d血管平滑肌细胞的增殖明显减弱,细胞外基质增加,内膜继续增生。④使用葛根素后血小板表面GMP-140的数目减少,血管平滑肌细胞的增殖减弱,但凝血酶受体mRNA表达及内膜增生程度未见明显变化。结论血管内皮损伤后内膜增生的过程中血小板活化、凝血酶受体mRNA表达增加,葛根素抑制血小板的活化及血管平滑肌细胞的增殖,但对凝血酶受体mRNA的表达及内膜增生的程度无明显影响。     

三七总皂甙对血管平滑肌细胞增殖及c-myc基因表达的影响

目的探讨三七总皂甙对血小板源生长因子刺激的血管平滑肌细胞增殖的影响及其可能机制。方法运用血小板源生长因子刺激兔体外血管平滑肌细胞增殖模型,通过四甲基偶氮唑盐比色法、流式细胞术及免疫细胞化学法观察三七总皂甙对其增殖活性、细胞周期及c-myc蛋白表达的影响。结果血小板源生长因子显著刺激血管平滑肌细胞增殖,三七总皂甙呈浓度依赖性抑制血管平滑肌细胞增殖,对血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖亦具有显著抑制作用;三七总皂甙作用下血管平滑肌细胞处于G1/G0期的细胞数增多,而G2/S期的细胞数显著减少,c-myc蛋白的表达亦降低。结论三七总皂甙对基础状态下及血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖均具有显著抑制作用,部分机制与其阻滞血管平滑肌细胞G1/G0期向S期转化以及下调c-myc基因表达有关。     

水蛭素对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

为研究重组水蛭素对凝血酶诱导的兔胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制.选用第2～5代培养的血管平滑肌细胞,在与凝血酶(4.0 ku/L)共同孵育的条件下,分别给予水蛭素(6.0 ku/L)和肝素(6.O ku/L)进行干预.通过四唑盐比色实验检测细胞生长活性,流式细胞术检测细胞周期,免疫组织化学检测血小板生长因子和增殖细胞核抗原在血管平滑肌细胞中的表达.结果发现,重组水蛭素能明显抑制凝血酶诱导的平滑肌细胞增殖,其抑制作用可能与减低了血管平滑肌细胞对血小板生长因子和增殖细胞核抗原的表达有关.     

血小板源生长因子β受体反义寡核苷酸对血小板源生长因子诱导大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响

为研究血小板源生长因子β受体反义寡核苷酸对血小板源生长因子诱导的大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响和作用机制，利用激光共聚集显微镜观察平滑肌细胞对异硫氰酸荧光素标记的反义寡核苷酸的摄取和细胞内定位，改良Boden's小室法观察平滑肌细胞迁移。结果发现，加入反义寡核苷酸培养24h及48h后荧光分别位于细胞浆内和细胞核内，5umol/L以上浓度反义寡核苷酸作用36h后，被血小板源生长因子诱导迁移通过Boyden's小室碳纤维素膜的细胞数量小于空白对照组；正义，错义寡核苷酸和5umol/L以下浓度反义寡核苷酸迁移抑制不明显，提示血小板源生长因子β受体反义寡核苷酸在细胞核内呈时间和浓度依赖性抑制血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞迁移。     

水蛭素对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

为研究重组水蛭素对凝血酶诱导的免胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制。选用第2～5代培养的血管平滑肌细胞，在与凝血酶(4．0ku／L)共同孵育的条件下，分别给予水蛭素(6．0ku／L)和肝素(6．0ku／L)进行干预。通过四唑盐比色实验检测细胞生长活性，流式细胞术检测细胞周期，免疫组织化学检测血小板生长因子和增殖细胞核抗原在血管平滑肌细胞中的表达。结果发现，重组水蛭素能明显抑制凝血酶诱导的平滑肌细胞增殖，其抑制作用可能与减低了血管平滑肌细胞对血小板生长因子和增殖细胞核抗原的表达有关。     

瓜蒌皮提取物对PDGF-BB所致血管平滑肌细胞增殖周期的影响

目的 研究瓜蒌皮提取物对血小板源生长因子BB所致血管平滑肌细胞增殖周期的影响并探讨其可能机制.方法 组织块贴块法培养SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞,3H-TdR掺入观察瓜蒌皮提取物(10、20和30mg/L)对血小板源生长因子BB(20 μg/L)所致血管平滑肌细胞DNA合成的影响;流式细胞仪分析细胞增殖周期;real time RT-PCR检测血管平滑肌细胞中c-fos、c-myc mRNA表达.结果 血小板源生长因子BB可明显升高细胞每分钟脉冲数(P＜0.01),并增加S期细胞比例而降低G0/G1期细胞比例(P＜0.01),并上调c-fos、c-myc mRNA表达(P＜0.01).瓜蒌皮提取物各浓度组均明显抑制血小板源生长因子BB诱导的每分钟脉冲数升高(P＜0.01),降低S期细胞比例而升高G0/G1期细胞比例,明显下调血小板源生长因子BB所致的c-fos、c-myc mRNA高表达(P＜0.01).结论 瓜蒌皮提取物通过阻止血管平滑肌细胞由G0/G1期进入S期而抑制血小板源生长因子BB所致的增殖,其作用机制可能与降低细胞内c-fos、c-myc mRNA高表达有关.     

血小板源性生长因子影响血管弹性蛋白酶表达

探讨球囊损伤后血管平滑肌细胞丝氨酸弹性蛋白酶表达增加的机理。用球囊导管损伤Wistar系雄性大鼠主动脉或颈总动脉。以血小板源性生长因子A和大鼠胰腺丝氨酸弹性蛋白酶的地高辛标记RNA探针进行原位杂交，并用抗5-溴脱氧尿嘧啶抗体进行双重染色。用抗血小板源性生长因子从、抗血小板源性生长因子BB、抗胰腺弹性蛋白酶、抗人增殖细胞核抗原等抗体进行免疫染色或免疫双重染色。电镜观察细胞的超微结构。结果发现：①在球囊损伤后O．5～4h，血小板源性生长因子mRNA表达细胞多于弹性蛋白酶mRNA表达细胞；②增殖细胞和迁移细胞既有血小板源性生长因子mRNA和其蛋白表达，又有弹性蛋白酶mRNA和其蛋白表达；③迁移细胞多为增殖细胞核抗原染色阳性．细胞内可见到核分裂像。提示血小板源性生长因子可能是刺激中膜平滑肌细胞增殖、迁移并使其弹性蛋白酶增加的影响因子之一。     

氧化型低密度脂蛋白对大鼠血管平滑肌细胞表达基质细胞衍生因子1α的影响

目的为探讨氧化型低密度脂蛋白对大鼠血管平滑肌细胞上基质细胞衍生因子1α表达的影响。方法原代培养的大鼠血管平滑肌细胞,与氧化型低密度脂蛋白共同孵育,用逆转录聚合酶链反应检测基质细胞衍生因子1αmRNA,免疫印迹检测其蛋白表达变化,观察氧化型低密度脂蛋白对大鼠血管平滑肌细胞表达基质细胞衍生因子1α的剂量—时间效应。结果原代培养的大鼠血管平滑肌细胞有基础水平的基质细胞衍生因子1α表达,且在0～50mg/L范围内,基质细胞衍生因子1α表达量随氧化型低密度脂蛋白浓度增加而增加,50mg/L可使基质细胞衍生因子1α上调约5倍;经50mg/L氧化型低密度脂蛋白刺激0～48h,其峰值在12h,随后逐渐下降,但仍维持在基础水平的3倍左右。结论氧化型低密度脂蛋白上调大鼠血管平滑肌细胞的基质细胞衍生因子1α的表达。     

白细胞介素-1β上行调节兔血管平滑肌细胞极低密度脂蛋白受体mRNA的表达

为了研究血管平滑肌细胞是否表达极低密度脂蛋白受体mRNA，采用Northernblot分析法检测培养兔主动脉平滑肌细胞表达极低密度脂蛋白受体mR-NA的情况。结果发现，培养兔主动脉平滑肌细胞可以表达极低密度脂蛋白受体mRNA；而且．细胞因子白细胞介素-1β能使表达增强约2倍。提示极低密度脂蛋白受体有可能参与动脉平滑肌细胞源性泡沫细胞；白细胞介素-1β上行调节平滑肌细胞表达极低密度脂蛋白受体mRNA可能是其参与动脉粥样硬化斑块形成途径之一。     

洛伐他汀对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶3表达的影响

观察洛伐他汀对免血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶3表达的影响及其作用机制。用Westem blot检测基质金属蛋白酶3蛋白水平，采用电泳迁移率变动分析法测定AP-1结合活性，用逆转录聚合酶链反应检测基质金属蛋白酶3mRNA水平。结果发现，自细胞介素1α和血小板源生长因子BB联合作用于免血管平滑肌细胞。可明显增加基质金属蛋白酶3的表达，洛伐他汀抑制这种刺激作用，使基质金属蛋白酶3的表达减低，且呈浓度依赖性；该抑制作用可被甲羟戊酸和双香叶酯基焦磷酸盐所逆转，而不被角鲨烯所逆转。白细胞介素1α和血小板源生长因子BB联合作用后使兔血管平滑肌细胞胆1结合活性和基质金属蛋白酶3mRNA水平明显增高，洛伐他汀抑制白细胞介素1α和血小板源生长因子BB上调AP-1结合活性的作用，但对基质金属蛋白酶3mRNA水平无明显影响。结果提示，洛伐他汀不依赖其调脂作用抑制血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶3的生成，从而在理论上有抗动脉粥样硬化和增加斑块稳定性的作用。     

抑制人巨细胞病毒UL83基因对人脑动脉平滑肌22α及血管紧张素受体表达的影响

目的探讨人巨细胞病毒UL83基因对人脑动脉平滑肌22α及血管紧张素受体表达的影响。方法利用转染技术把RNA干扰转染到人巨细胞病毒感染的体外培养的人脑动脉血管平滑肌细胞中,建立RNA干扰人巨细胞病毒UL83基因的细胞模型。采用免疫荧光技术、逆转录聚合酶链反应和蛋白电泳等技术观察平滑肌22α及血管紧张素1型受体和2型受体基因的表达变化。结果利用RNA干扰技术成功干扰了人巨细胞病毒UL83基因mRNA的复制和蛋白表达,沉默人巨细胞病毒UL83基因后血管紧张素1型受体基因表达下调,而血管紧张素2型受体基因和平滑肌22α基因表达上调。结论成功建立了人巨细胞病毒感染体外培养的人脑动脉血管平滑肌细胞UL83基因沉默的细胞模型。人巨细胞病毒UL83基因可能通过激活血管紧张素1型受体,抑制血管紧张素2型受体和平滑肌22αmRNA的转录表达来发挥作用。