褪黑激素体外定向诱导骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨褪黑激素(melatonin,MT)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)不同时段向神经细胞分化的情况。方法:采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs,以MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经细胞分化。分别在诱导后3,7,10,14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志(nestin)、神经元细胞特异性标志(neurofilament,NF)和星形胶质细胞特异性标志(GFAP)的表达。结果:MT诱导分化3 d,部分细胞胞体收缩成三角形,有些成为简单的双极或多极细胞。诱导3 d细胞开始表达nestin,7~14 d表达nestin和NF,细胞不表达GFAP。结论:MT可诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞在体外向神经元样细胞的分化

目的探讨2-ME与BHA对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的作用。方法大鼠股骨中分离MSCs,贴壁法体外扩增、传代。以二巯基乙醇（2-ME）预诱导,再加入2-ME、3-叔丁基-4羟基茴香醚（BHA）诱导。免疫细胞化学染色检测巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管联合蛋白-2（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、1-氨基丁酸（GABA）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达,以鉴定分化细胞的表型特征。尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）作为细胞分裂标记检测MSCs增殖特性。结果细胞诱导后具有神经细胞的形态,并被BrdU标记,nestin、NSE、MAP-2、AchE、GABA表达阳性,而GFAP、TH表达为阴性。结论2-ME和BHA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

刺五加体外诱导骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的 研究刺五加体外诱导骨髓基质细胞(MSCs ) 分化为神经元样细胞.方法 采用全骨髓贴壁筛选法分离培养MSCs.含刺五加的无血清DMEM/ F12 诱导MSCs 的分化.间接免疫荧光法、Western blot及RT-PCR检测巢蛋白(nestin)、β-Tubulin III及GFAP蛋白和mRNA的表达.结果 MSCs在体外传代扩增至第3代,CD44 、CD54表达阳性已达90%以上,而CD14表达阳性下降至2.37%.刺五加诱导后,MSCs胞体收缩,突起伸出,类似神经元;免疫荧光、Western blot及RT-PCR均显示刺五加诱导后的细胞nestin、β-Tubulin III蛋白和mRNA表达阳性,而GFAP表达阴性.结论 刺五加可以在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞.     

bFGF促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元转化及机制

目的探讨碱性成纤维生长因子对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的作用及信号通路.方法利用bFGF与不同生长因子和化学诱导剂组合诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向神经元转化,观察分化过程中细胞形态、数目的变化,观察免疫细胞化学检测分化后细胞神经细胞标志蛋白和部分神经功能相关蛋白以及FGFR的表达情况,并计算转化率.结果①3组不同条件诱导后,MSCs均能分化为具有典型神经元形态的细胞,并明显表达NSE、MAP2和5-HT1D,但不表达GFAP;②bFGF预诱导组的转化率明显高于未预诱导组;③诱导后的神经元样细胞FGFR3表达明显增强.结论以DMSO和BHA为基础诱导剂,bFGF预处理可明显提高MSCs跨胚层分化为神经元样细胞的转化率,浓度为10 ng/ml的bFGF主要是通过FGFR3作用于MSCs.     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞分化

目的:探讨成人骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件. 方法:从正常成人志愿者髂骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用2-巯基乙醇(BME)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定. 结果:诱导1 h有部分细胞表达神经干细胞标志巢蛋白nestin,4 h后大部分细胞具有典型神经元形态,表达晚期神经元标志物-中间神经丝蛋白(NF-M),部分具有神经元形态的细胞表达微管相关蛋白-2 (MAP-2). 结论:成人骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞.     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用，为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法体外培养MSCs至第5代后，分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs，诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数，对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较；诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态；BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长；BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰，而β-ME在诱导2h即达高峰，但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性，而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性；RT-PCR显示NSE、NFL，MAP-2的mRNA表达阳性，GFAP有较弱的表达；蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞．而且分化后细胞的存活时间长．有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

β-巯基乙醇和脑匀浆上清对骨髓间充质干细胞的神经诱导作用

目的探讨β-巯基乙醇(BME)和大鼠脑匀浆上清对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为类神经元样细胞的作用。方法采用全骨髓培养法从SD大鼠骨髓中分离培养MSCs,经贴壁法体外扩增、传代和流式细胞仪鉴定。①以1mmol/L浓度BME的含血清DMEM培养基预诱导24 h,再以含5 mmol/L BME的无血清DMEM培养基诱导5 h至MSCs神经分化。②使用大鼠脑匀浆上清诱导MSCs,48 h至神经分化。免疫细胞化学染色分别检测两种诱导方法MSCs培养物神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果第5代MSCs有97.5%表达CD90抗原,1.72%表达CD45抗原。两种方法诱导后的细胞均具有神经细胞的形态特征;相比脑匀浆上清BME诱导组细胞形态变化更快。两种方法都可诱导MSCs表达NSE;鼠脑匀浆上清可诱导MSCs表达GFAP。结论MSCs具有向神经细胞分化的可塑性,相比BME,鼠脑匀浆上清具有诱导MSCs向胶质细胞分化的倾向。     

大鼠骨髓间充质干细胞神经分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白分布的变化及意义

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞神经分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)分布的变化及意义.方法 常规体外培养大鼠MSCs,采用β-巯基乙醇诱导MSCs分化为神经细胞.实验分MSCs空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)阴性对照组、β-巯基乙醇诱导组、不同浓度雷帕霉素干预组、不同浓度雷帕霉素干预+β-巯基乙醇诱导组.采用免疫荧光法检测诱导前后mTOR在细胞内的分布,激光共聚焦显微镜观察照相;Western blot法检测诱导前后神经细胞相关蛋白和mTOR通路蛋白的表达.结果 ①诱导前mTOR主要在MSCs细胞核内点状分布,细胞质也有少量的分布;诱导后核内荧光信号减弱,mTOR向细胞质转移.雷帕霉素处理后,随着雷帕霉素浓度的提高(10～ 30tμmol/L),mTOR向细胞质转移越明显.雷帕霉素浓度超过50 μmol/L后,细胞形态变圆,部分细胞脱壁,死亡率显著增加(P＜0.05).②β-巯基乙醇可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,诱导后神经细胞Tau蛋白、MAP-2蛋白表达显著增加.雷帕霉素(10 ～ 30 μmol/L)干预后,随着雷帕霉素浓度(10～20μmol/L)的提高,Tau蛋白、MAP-2蛋白表达逐渐增加,30 μmol/L时Tau蛋白、MAP-2蛋白表达下降(P＜0.05).③Westem blot检测结果提示,诱导前后总mTOR表达不变;磷酸化mTOR、磷酸化p70S6K、磷酸化4EBP1诱导后较诱导前表达下降(P＜0.05),雷帕霉素干预后下调更加显著(P＜0.05).结论 mTOR在MSCs神经分化过程中由细胞核内向细胞质转移,活性下降,表达下调,提示mTOR在MSCs神经分化过程中可能发挥了重要作用.     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用,为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法 体外培养MSCs至第5代后,分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs,诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数,对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较;诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果 两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态;BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长;BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰,而β-ME在诱导2h即达高峰,但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性;RT-PCR显示NSE、NFL,MAP-2的mRNA表达阳性,GFAP有较弱的表达;蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论 BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞,而且分化后细胞的存活时间长,有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞

目的观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞。方法通过贴壁法分离获得大鼠骨使髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。用浓度为1mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果流式细胞仪检示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞。结论清脑灵能诱导MSCs分化神经元样细胞。     

哺乳动物内耳再生毛细胞前体细胞来源研究

目的探讨哺乳动物内耳再生毛细胞前体细胞的可能来源。方法取出生1d大鼠的椭圆囊,嗜热菌蛋白酶处理,消化法原代培养。在倒置显微镜下,对椭圆囊感觉上皮细胞（USEC）的形态、生长特征进行观察;透射电镜及免疫细胞化学法检测细胞角蛋白18、波形蛋白;免疫细胞化学法及RT—PCR检测支持细胞标记物p27kipl mRNA及毛细胞的特征性标记物Brn3a、Calretinin及AchRa9、Myosin Vlla mRNA的表达,进而鉴定USEC上皮细胞来源。结果原代培养的USEC呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞问连接紧密,形成单层时呈“铺路石样”外观,可见“dome”结构;表达细胞角蛋白,但不表达波形蛋白,细胞微绒毛丰富,细胞问连接紧密。原代培养的USEC表达支持细胞标记物p27kipl mRNA及毛细胞的特征性标志物Brn3a、Calretinin及AchRa9、Myosin Vlla mRNA。结论原代培养的USEC可以产生毛细胞样细胞,而且能表达支持细胞标记物,表明其来源为支持细胞。椭圆囊感觉上皮的支持细胞可能是毛细胞再生的前体细胞之一。     

胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨胚胎干细胞（ＥＳ）向神经细胞定向分化发育的可能性。方法 ＥＳ－Ｄ３在无小鼠白血病抑制因子（ｍＬＩＦ）存在的条件下培养ＥＳ细胞４ｄ,形成ＥＳ集落（即胚胎样小体）,经胰酶消化打散后种植于粘附性培养皿上。结果 上述细胞表达ＭＡＰ－２和ＧＦＡＰ蛋白。ＲＴ－ＰＣＲ分析进一步证明这些细胞能表达γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）γ亚单位和酷氨酸羟化酶以及脑因子－１神经相关基因。结论 ＥＳ细胞在体外能有效地被诱导成具有多种神经元特性的神经样细胞,可为神经移植提供源源不断的材料。     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

大鼠肝脏卵圆细胞干细胞特性的研究

目的探讨大鼠肝脏卵圆细胞体外培养扩增及其干细胞特征。方法采用2-乙酰氨基芴/四氯化碳方法建模,胶原酶灌流和流式细胞术分选纯化卵圆细胞,进行培养和扩增。透射电子显微镜观察肝脏卵圆细胞的超微结构,免疫细胞化学法检测干细胞标志物OV-6、c-kit和Thy-1.1的表达;RT-PCR法检测卵圆细胞内c-kit、肝细胞标志物(HNF-4α、AFP)和胆管细胞标志物(CK-7、CK-19)的基因表达;Western blotting法检测OV-6和AFP蛋白的表达。结果大鼠肝脏组织可见明显的卵圆细胞增生,成簇分布,逐渐向肝实质内延伸。细胞体外培养可达40 d以上,细胞体积较小,多呈圆形和卵圆形。透射电子显微镜下可见细胞直径5～10μm,细胞核大,胞质少,核/质比例大,细胞器少,仅见少量线粒体和内质网。免疫细胞化学检测显示,细胞表面OV-6、c-kit和Thy-1.1染色阳性;RT-PCR检测显示,卵圆细胞内有c-kit、HNF-4α、AFP、CK-7和CK-19基因表达;Western blotting检测显示,OV-6蛋白持续表达,AFP蛋白表达逐渐增强。结论大鼠肝脏卵圆细胞体外可大量扩增并且保留其干细胞和双向分化潜...     

原核和真核细胞表达HBeAg的应用研究

目的：将原核细胞和真核细胞分别克隆表达生产的HBeAg,经适当纯化后进行检测分析,并在乙型肝炎抗HBe检测中进行应用和比较。方法：分别用大肠杆菌和家蚕细胞表达生产HBeAg,并用Saphacryl S-200柱层析进行纯化;紫外分光光度法测定表达产物的蛋白含量;EIA法测定HBeAg和HBcAg效价及评估HBeAg的应用效果。结果：原核细胞HBeAg：比活性为10000／mg,HBeAg/HBcAg＝50,用于抗HBe的检测时特异性为96％,灵敏度符合国家卫生部panel要求,真核细胞HBeAg：比活性为160000／mg,HBeAg/HBcAg＝5000,用于抗HBe的检测时特异性为100％,灵敏度高于国家卫生部panel要求的1－2个滴度。结论：真核细胞表达的HBeAg比活性高HBcAg含量低,在抗HBe检测时的应用效果优于原核细胞。     

大鼠肝脏卵圆细胞干细胞特性的研究

目的 探讨大鼠肝脏卵圆细胞体外培养扩增及其干细胞特征.方法 采用2-乙酰氨基芴/四氯化碳方法建模,胶原酶灌流和流式细胞术分选纯化卵圆细胞,进行培养和扩增.透射电子显微镜观察肝脏卵圆细胞的超微结构,免疫细胞化学法检测干细胞标志物OV-6、c-kit和Thy-1.1的表达;RT-PCR法检测卵圆细胞内c-kit、肝细胞标志物(HNF-4a、AFP)和胆管细胞标志物(CK-7、CK-19)的基因表达;Western blotting法检测OV-6和AFP蛋白的表达.结果 大鼠肝脏组织可见明显的卵圆细胞增生,成簇分布,逐渐向肝实质内延伸.细胞体外培养可达40d以上,细胞体积较小,多呈圆形和卵圆形.透射电子显微镜下可见细胞直径5～10 μm,细胞核大,胞质少,核/质比例大,细胞器少,仅见少量线粒体和内质网.免疫细胞化学检测显示,细胞表面OV-6、c-kit和Thy-1.1染色阳性;RT-PCR检测显示,卵圆细胞内有c-kit、HNF-4α、AFP、CK-7和CK-19基因表达;Western blotting检测显示,OV-6蛋白持续表达,AFP蛋白表达逐渐增强.结论 大鼠肝脏卵圆细胞体外可大量扩增并且保留其干细胞和双向分化潜能特性.     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

缺氧激发卵巢癌上皮性肿瘤细胞中的干细胞向内皮样细胞分化

 目的 在缺氧状态下对卵巢癌上皮性肿瘤细胞SKOV-3和ES-2诱导的内皮样细胞（endothelial-like cell,EC-like）进行鉴定,寻找卵巢癌上皮性肿瘤干细胞（tumor stem cell,TSC）的线索。方法 建立Matrigel三维培养系统,在1%O₂缺氧条件下对卵巢癌上皮性肿瘤细胞SKOV-3和ES-2进行缺氧诱导。应用免疫荧光双重标记、透射电镜等技术对SKOV-3和EC-2来源内皮样细胞的表面特异性抗原、超微结构和乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low -density lipoprotein,ac-LDL）吞噬功能进行鉴定。结果 培养7天后,SKOV-3内皮样细胞可以表达Flk-1、AC133及vWF;细胞出现空泡样变化,表面出现微绒毛样突起,极少数细胞出现质膜包裹的颗粒。ES-2内皮样细胞可以表达Flk-1、CD34;细胞出现空泡样变化,表面出现微绒毛样突起,极少数细胞出现质膜包裹的颗粒;部分Dil阳性细胞,具有吞噬ac-LDL功能。常氧状态下无上述变化。结论 卵巢癌肿瘤细胞具有干细胞（stem cell,SC）特征：SKOV-3和ES-2内皮样细胞可能来源于卵巢癌上皮性肿瘤细胞中的SC。缺氧的压力下卵巢癌SC先向血管内皮样细胞分化,说明卵巢癌SC是一种可向内皮细胞（endothelial cell,EC）分化的肿瘤源性EC前期细胞。缺氧激发下卵巢癌SC分化的EC-like更类似内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）而非EC。     

Differentiation of mouse embryonic stem cells into insulin-secreting cells in vitro

Regenerative medicine,including cell-replacement strategies,may have an important role in the treatment of type 1 diabetes which is associated with decreased islet cell mass.To date,significant progress has been made in generating insulin-secretingβcells from pluripotent mouse embryonic stem cells(ESCs).The aim of this study is to explore the potential of regulating the differentiation of ESCs into pancreatic endocrine cells capable of synthesizing the pancreatic hormones including insulin,glucagon,somat...     

表皮干细胞体外诱导转分化为角膜上皮细胞的实验研究

目的探讨表皮干细胞向角膜上皮细胞转分化的可塑性.方法用Ⅳ型胶原筛选的方法培养并鉴定表皮干细胞,经体外与角膜缘基质细胞共培养诱导分化,免疫组化检测角膜上皮细胞特异标志物K12表达.结果获得的表皮干细胞表现出很强的增殖潜能,光镜下为原始细胞形态特征,能强表达K19和β1-integrin,共培养2周后可见细胞分化,细胞表达角膜上皮特征性K12.结论在本实验的体外诱导条件下,表皮干细胞能转分化为角膜上皮细胞.