重组胶质细胞生长因子2蛋白的原核表达及纯化

目的通过原核表达的方法得到胶质细胞生长因子2(GGF2)重组蛋白。方法将不含信号肽编码序列的GGF2基因用亚克隆的方法自PVT-GGF2质粒克隆至PCXJ18质粒,再由PCXJ18-GGF2质粒克隆至pET-32b(+)质粒,构建pET-32b(+)-GGF2表达载体。表达载体转染4种宿主菌,筛选合适者。优化表达时程和IPTG诱导剂量。GGF2大量表达后回收包涵体,复性。复性产物利用His Bind树脂进一步纯化。纯化产物用Western blot鉴定。结果测序鉴定表明,成功构建pET-32b(+)-GGF2表达载体。筛选结果表明Origami B(DE3)为合适宿主菌。适宜的表达条件为30℃诱导前扩增,浓度25μmol/L IPTG,37℃诱导2 h。所表达外源蛋白相对分子质量和预期一致。回收、纯化后得到纯度约为96%的产物。Western blot鉴定表明所获为GGF2重组蛋白。结论原核表达方法得到足量GGF2重组蛋白。     

人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

猪链球菌2型人源分离株截短的溶菌酶释放蛋白基因的克隆及原核表达

目的:克隆及表达猪链球菌2型(S.suis2)人源分离株Habb截短溶菌酶释放蛋白(MRP)基因。方法:根据S.suis2mrp基因的序列设计引物,克隆和分析江苏海安患者分离株Habb截短mrp基因(tmrp),构建原核表达质粒pGEX4T-2-mrp。在大肠杆菌中诱导带有谷胱甘肽转移酶(GST)标签的融合蛋白tMRP-GST表达;经亲和层析法纯化后,用凝血酶酶切去除重组蛋白中的GST,制备纯化的截短MRP(tMRP)抗原。用Westernblot检测重组抗原的活性。结果:序列分析表明,获得的tmrp基因长957bp;原核表达的融合蛋白tMRP-GST的相对分子质量(Mr)约61000;凝血酶处理的tMRP抗原的Mr约为35000。Westernblot分析显示,MRP-GST、tMRP蛋白均可与MRP多克隆抗血清发生特异性反应。结论:成功地克隆人源分离株Habb截短的mrp基因,并在原核系统实现高效表达,制备的纯化抗原tMRP具有良好的抗原性,为开展相关免疫学研究奠定了基础。     

小鼠B细胞趋化因子原核表达与纯化

用多聚酶链反应 (PCR)扩增小鼠 B细胞趋化因子 (BL C)基因片断并导入 Bam H1和 Pst1两个酶切位点 ,插入到原核表达载体 PQE30中 ,构建重组质粒 p BL C- PQE30 ,并诱导相对分子量为 10 Kda的重组目的蛋白r BL C的表达 ,通过 Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。双酶切和测序分析显示小鼠 B细胞趋化因子片断正确插入原核表达载体 PQE30中 ,重组蛋白 Western blot分析显示出特异性条带。提示已通过基因工程方法获得并纯化了小鼠B细胞趋化因子重组蛋白。     

人血管抑制因子的原核表达、纯化及活性研究

目的：利用大肠杆菌表达系统表达人血管抑制因子，并利用镍金属螯合层析法进行纯化，探讨其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法：采用RT-PCR技术从人肝脏组织中获取人血管抑制因子的cDNA，将其克隆至原核表达载体pQE30中进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析，并利用镍金属螯合层析法进行纯化。^3H-TdR法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果：利用pQE30表达载体表达的含6个组氨酸尾的vasostafin蛋白，在SDS-PAGE上表现出一条约2lkD的阳性条带，经镍金属螯合层析纯化后的蛋白经肽指纹图谱分析鉴定为目的蛋白，在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖。结论：人血管抑制因子可在大肠杆菌中以包涵体形式高水平表达，并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性．     

人GRP78蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的:构建原核表达质粒pGEX-4T-1 -GRP78,诱导表达、纯化后检测GRP78蛋白的抗原活性.方法:利用PCR方法从本实验室已构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)上扩增GRP78基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组载体pGEX-4T-1 -GRP78.转化至大肠杆菌BL21( DE3)中诱导表达,再将所表达的融合蛋白进行纯化.经SDS-PAGE分析后,将所得产物用Thrombin切割;进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价.结果:酶切和测序结果均证实GRP78原核表达载体构建正确,可诱导表达;ELISA检测显示纯化后的人GRP78抗原具有免疫原性.结论:成功构建了人GRP78基因的原核表达载体,获得了纯化的GRP78蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以GRP78为基础的肝细胞癌的血清学检测提供了抗原.     

人源受体相关蛋白的原核表达及功能检测

目的研究人源受体相关蛋白(RAP)的表达并鉴定表达产物的功能。方法用IPTG诱导培养含有人源RAP重组表达载体(pET-28 a( )-RAP)的BL21转化菌,利用融合蛋白中6个组氨酸纯化标签,经N i -NTA树脂亲和层析、SDS-PAGE分离鉴定表达产物,并经脱盐、浓缩、冻干处理获得RAP融合蛋白冻干品。将RAP融合蛋白与富含LDLR家族受体的巨噬细胞进行结合实验,分析RAP融合蛋白的功能。结果经亲和层析分离纯化后获得可溶性表达的RAP融合蛋白。实验显示,表达的RAP融合蛋白可竞争性抑制VLDL与巨噬细胞的结合。结论实验获得的RAP融合蛋白具有正常的结合活性,可用于相关研究,为RAP蛋白生产开发奠定了良好的基础。     

MAGE-n的原核表达与分离纯化

目的　构建MAGE n的原核表达质粒 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并通过谷胱甘肽巯基转移酶 (GlutathioneS trans ferse,GST)纯化系统进行分离纯化。方法　用ANTHEPROTV5 .0软件预测MAGE n的生物学特性 ,从中选择抗原性及特异性较强的一段。利用PCR方法扩增MAGE n基因片段 ,连入原核表达载体pGEX 4T 1,构建MAGE n的原核表达质粒pGEX MAGE n并测序。将该质粒转化大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化。结果　成功地扩增了MAGE n基因片段 ,测序结果表明与GenBank公布的序列一致 ,成功地构建了pGEX MAGE n原核表达质粒 ,含有该质粒的大肠杆菌经异丙基 β D 半乳糖苷 (Isopro pyl beta D thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后表达一Mr 约为 4 30 0 0的蛋白 ,经GST融合蛋白纯化系统纯化 ,得到了MAGE n的重组蛋白。结论　首次获得了新的肿瘤抗原MAGE n的重组蛋白 ,并进行分离纯化 ,为进一步研究MAGE n抗原在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础     

人神经蛋白synuclein gamma的原核表达及纯化

synucleins是脊椎动物中高度保守的小分子量蛋白家族 ,主要在神经元表达 ,在突触前末梢尤为丰富。SNCG(synucleingamma;spersyn ;breastcancer specificprotein 1)是该家族的第三个成员 ,在脑中广泛表达 ,其表达异常与神经退行性病变和细胞恶变都有一定的相关性。它在神经元胞质中广泛分布 ,可能起到维持神经纤维网络完整性的作用[1 ] 。γ synuclein蛋白的N末端与脑中参与多种信号通路的 14 3 3蛋白家族成员有较高的同源性 ,具有分子伴侣的特性 ,参与MAPK途径的调节。为了研究SNCG基因及其表达产物在神经系统中的作用 ,本研究采用RT…     

人细胞骨架调节蛋白基因Nelin的原核表达与分离纯化

目的：原核表达并分离纯化人细胞骨架调节蛋白基因Nelin。方法：利用DNAstar软件预测Nelin的B细胞表位，选择Nelin基因B细胞表位较多、特异性最强的片段。用DNA重组技术，将此片段插入原核表达载体pE128a（＋），构建C末端带有His6标签的原核表达载体pE128a-Nelin，转化大肠杆菌B121（DE3），IPTG诱导，产物用Ni^2＋金属螯合吸附层析柱纯化。结果：成功构建了pE128a-Nelin表达载体，IFTG诱导后表达分子量约为17000的可溶性蛋白，Nelin-His6蛋白的表达量占菌体总蛋白的18％，经Ni^2＋金属螫合层析柱纯化，得到了电泳纯的Nelin—His6蛋白。结论：建立了稳定的Nelin基因的表达体系，为其功能研究奠定了基础。     

北京地区人偏肺病毒核蛋白基因的原核表达及抗原活性分析

目的用大肠杆菌表达获得人偏肺病毒主要结构蛋白N蛋白，为下一步的深入研究奠定基础。方法从重组质粒pUCm-N1816中PCR扩增获得N基因，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入到原核表达载体pET30a（＋）中，得到重组表达质粒pE130a-N1816，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPIG诱导培养。SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达和抗原性。结果经双酶切和测序证明1．2kb N1816。基因正确插入pET30a中，并具有正确的读码框架，得到预期的pET30a-N1816重组原核表达质粒。37℃，1mmol／L IFIG诱导培养6h后产生大量带6个组氨酸标记的重组N蛋白，主要以包涵体形式存在，占细胞总蛋白的20％左右。N蛋白粗提物经Co^2＋亲和层析获得较理想纯化。Western blot结果显示，体外所表达的蛋白能和特异性抗血清及人血清反应。结论本研究成功构建了重组pET30a-N1816原核表达质粒，N蛋白获得了高效表达，并且具有特异抗原活性，可用于人偏肺病毒的深入研究。     

2型猪链球菌组氨酸三聚体蛋白家族05SSU1267的克隆、表达及免疫保护作用研究

目的对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)05ZYH33组氨酸三聚体蛋白家族(Histidine triadprotein,Htp)成员编码基因05SSU1267进行克隆、表达,并研究其免疫保护作用。方法根据05ZYH33基因组编码的05SSU1267基因序列设计引物,PCR扩增目的片段。将目的基因克隆入原核表达载体pET32a,并转化E.coli BL21(DE3)。通过IPTG诱导表达、His-Tag亲和层析柱纯化获得重组蛋白,并将纯化后的蛋白用于Western blot分析。以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备兔多抗血清,并通过ELISA检测多抗血清的效价。重组蛋白免疫Balb/c小鼠,研究其免疫保护作用。结果 Western blot显示重组蛋白可以与兔抗05ZYH33全菌血清反应,显示该蛋白具有较好的免疫反应原性;ELISA结果显示重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的多抗血清;动物保护实验表明该蛋白具有一定的免疫保护作用。结论在原核系统成功表达了05ZYH33 Htp蛋白05SSU1267,动物实验结果表明其能够在Balb/c小鼠中发挥一定的免疫保护作用,研究结果为Htp蛋白作为2型猪链球菌疫苗候选分子以及进一步了解该蛋白家族的生物学功能奠定基础。     

2型猪链球菌中国强毒株znuA基因的原核表达及免疫学活性分析

目的克隆2型猪链球菌高亲和力锌吸收蛋白(High-affinity zinc uptake system protein,ZnuA)编码基因并进行原核表达,研究ZnuA蛋白的免疫学活性。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因znuA,构建重组表达质粒pET32a::znuA,转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;Western blot检测ZnuA蛋白的免疫原性;重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清,间接ELISA检测多抗血清效价。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;Western blot结果表明ZnuA蛋白具有良好的免疫原性;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的多抗血清。结论在原核系统中成功地表达了znuA基因编码的蛋白,且ZnuA重组蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究znuA基因在猪链球菌致病过程中的作用以及猪链球菌疫苗的开发奠定了基础。     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

人脂联素球状结构域基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建人脂联素球状结构域(gAd)基因的原核表达载体PET-28a(+)-gAd,诱导表达并纯化重组gAd蛋白,制备多克隆抗体。方法:以人基因组为模板,用PCR方法扩增人脂联素球状结构域(gAd)基因,构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经SDS-PAGE,免疫印迹法检测并鉴定表达产物,表达的目的蛋白用镍亲和层析柱纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果:原核表达载体PET-28a(+)-gAd转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,获得gAd重组蛋白,免疫印迹证实能与抗his标签检测抗体结合,制备的多克隆抗体经间接ELISA法测得效价为1∶32 000。免疫印迹证实,抗血清不仅能特异性地识别gAd蛋白,还能识别脂联素蛋白,而不与非特异性蛋白结合。结论:成功构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,并表达、纯化重组蛋白gAd,制备的多克隆抗体特异性好,效价较高,为进一步的研究奠定了基础。     

人TLR-2胞外肽段的分段表达及其活性鉴定

为深入研究TLR-2胞外肽段不同区域在配基识别过程中的功能,对TLR-2a(7M-225E)、TLR-2b(185L-392L)、TLR-2c(436E-595C)三个小片段进行克隆及原核表达,其中TLR-2a和TLR-2c得到成功克隆和表达,活性鉴定结果显示TLR-2a与商品抗TLR-2(179L-204I)多抗和抗His单抗反应良好,TLR-2c可以与抗His单抗反应,在配基结合实验中TLR-2a和TLR-2c都可与PGN和LTA结合,提示TLR-2对配基的识别为构像识别。     

登革病毒2型非结构蛋白NS2B的原核表达、纯化及其抗体的制备

目的 原核表达登革病毒(Dengue Virus,DV)NS2B蛋白并纯化,制备NS2B的小鼠多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增DV2全长的NS2B基因序列,构建表达带有6×His标签的NS2B的原核表达载体,进行表达与纯化,免疫Balb/c小鼠,制备NS2B多克隆抗体.采用ELISA检测抗体效价,Westem-blot及免疫荧光染色检测其特异性.结果 成功构建原核表达载体pQE-31/NS2B,进一步获得相对分子质量为16 000的纯化蛋白及多克隆抗体,EHSA显示抗体效价达1:25 600.Western-blot和免疫荧光染色显示多克隆抗体与NS2B蛋白特异性结合.结论 本研究获得了纯化的DV2 NS2B蛋白,成功地制备了NS2B多克隆抗体,为进一步研究NS2B的作用机制奠定了基础.