人肺癌相关抗原ALT-04Aag基因表达抑制对细胞生长特性及相关基因表达的影响

目的 探讨抑制人肺癌相关抗原基因ALT04-AG表达对细胞生长特性及相关基因表达的影响。方法 重组反义ALT04-AG RNA真核表达质粒，经脂质体介导转染人肺癌细胞株（L78），以MTT、FCM法分析转染细胞生长特性，以Northern blot、免疫组化染色及基因芯片技术检测相关基因的表达。结果 构建了重组表达反义ALT04-AG RNA的真核表达质粒[pALT04-AG(as)]，经该质粒转染及二氟甲基鸟氨酸（difluoromethylornithine，DFMO）处理的L78细胞均引起ALT04-AG表达下调及细胞的增殖抑制，后者还导致细胞凋亡比例增加。结论 pALT04-AG(as)转染L78细胞或用DFMO抑制多胺生物合成，可通过对相关基因表达的调控促使L78细胞恶性表型逆转，而后者的作用更为广泛。本结果为探索肿瘤的诊断与治疗提供了有意义的线索。     

人肺癌相关抗原基因ALT04-AG表达抑制对人肺癌细胞株生长及基因表达谱的影响

目的探讨抑制人肺癌相关抗原基因ALT04-AG表达对细胞生长特性及相关基因表达的影响。方法重组反义ALT04-AGRNA真核表达质粒,经脂质体介导转染人肺癌细胞株(L78),以MTT、FCM法分析转染细胞生长特性,以Northern b lot、免疫组化染色及基因芯片技术检测相关基因的表达。结果构建了重组表达反义ALT04-AGRNA的真核表达质粒[pALT04-AG(as)],经该质粒转染及二氟甲基鸟氨酸(d ifluorom ethylorn ith ine,DFMO)处理的L78细胞均引起ALT04-AG表达下调及细胞的增殖抑制,后者还导致细胞凋亡比例增加。结论pALT04-AG(as)转染L78细胞或用DFMO抑制多胺生物合成,可通过对相关基因表达的调控促使L78细胞恶性表型逆转,而后者的作用更为广泛。本结果为探索肿瘤的诊断与治疗提供了有意义的线索。     

刺激ECV304细胞增殖的新基因EOLA1的克隆和功能研究

目的 扩增内皮细胞受内毒素刺激后上调表达的新序列标签ST55（GenBank No．BMl21646）全长eDNA序列并研究其结构和生物学功能。方法 应用快速扩增cDNA末端技术延伸ST55获得其全长cDNA序列，以Noithem杂交检测其组织分布，通过酵母双杂交筛选其胞内相互作用蛋白，在ECV304细胞中稳定转染目的基因并强制表达后观察细胞生长变化。结果 获得1个全长为1404碱基的cDNA序列，作为人类新mRNA被GenBank接受（AY074889），命名为内皮高表达脂多糖相关因子1（endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1，EOLA1）。生物信息学分析显示EOLA1基因含5个外显子，定位于染色体Xq27．4，编码蛋白质由158个氨基酸组成，分子量为1789。Northern印迹显示EOLA1在人各组织和癌细胞系有不同的表达；以EOLA1 cDNA作为诱铒，进行酵母双杂交筛选人肝cDNA文库，鉴定了金属硫蛋白2A（metallothionein 2A，MT2A）为其相互作用蛋白并采用免疫共沉淀验证了这一结果。高表达EOLA1显著促进了ECV304细胞增殖。结论 EOLA1是人内皮活化相关新基因，EOLA1与MT2A的相互作用可能在炎症反应中细胞内保护方面发挥作用。     

小鼠凋亡相关新基因PNAS-4真核表达载体的构建、表达及体外抗肿瘤作用

目的：对小鼠凋亡相关新基因PNAS-4（mPNAS-4）进行克隆，构建其真核表达载体，并在小鼠Lewis肺癌细胞系LL2中转染表达；探讨mPNAS-4基因转染LL2细胞过表达所诱导的体外肿瘤细胞凋亡情况。方法：用RT-PCR从小鼠肝脏组织中克隆mPNAS-4编码区cDNA，构建重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4；用脂质体将pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞；用RT—PCR检测转染细胞中mPNAS-4的过表达情况；通过MTT、流式细胞术（FCM）及DNA Ladder分别检测转染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从小鼠肝脏组织中克隆到mPNAS-4全长cDNA并成功构建其真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4，转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞可使其mRNA表达明显上调。mPNAS-4过表达能抑制LL2细胞增殖并诱导其凋亡。结论：mPNAS-4过表达对小鼠Lewis肺癌LL2细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用。     

人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3的克隆

目的：克隆人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3。方法：从已获得的小鼠稳睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的表达序列标签片段（BE644537）入手，构建人同源表达序列标签重叠群，应用基因特异性引物和载体特异性引物，在睾丸cDNA文库的DN或进行巢式PCR扩增、测序，对测序结果进行生物信息学分析。结果：从睾丸cDNA文库中分离出人类睾丸凋亡相关基因的5’末端而获得全长cDNA,命名为TSARG3，GenBank登录号为AF419291（保密期为1年），同时应用相同方法克隆了该基因在小鼠中的同源基因，GenBank登录号为AF419292。结论：获得人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3，该基因可能与人类睾丸生精细胞凋亡有关。     

人退变椎间盘组织的基因表达谱

目的：研究人类退变椎间盘的基因表达谱，分析人退变椎间盘基因表达水平的变化。方法：按条件优化的一步法抽提人退变及正常椎间盘组织的总RNA各3例，分别用cy3，cy5荧光标记，获得2组椎间盘cDNA的探针，与含有4096条人类全长基因的cDNA表达谱芯片杂交，扫描芯片荧光信号图像，对所获得的基因进行生物信息学分析。结果：在4096条基因中，有差异表达的基因706条，358条基因表达量明显下降，298条基因表达量明显上升。在有差异表达的基因中，细胞凋亡相关类蛋白8条，其中上皮细胞膜蛋白(EMP-1)基因的表达上调明显。结论：退变椎间盘的基因表达发生变化，细胞凋亡增加可能是椎间盘退变发生和发展的因素之一。     

一株与大鼠肝细胞再生相关的新cDNA克隆

目的:用表达性差异显示分析(RDA)技术发现的一株新基因为目的基因。研究该基因与肝细胞再生的可能关系及在组织中的分布等初步的生物学功能。方法:用狭线杂交、Northern杂交、RT-PCR、cDNA文库筛选及序列分析法研究新基因cDNA序列、组织分布及初步功能。 结果:从大鼠胎肝cDNA文库中筛选出该基因的克隆;杂交等证实其在肝大部切除后表达迅速上调,在EGF诱导的肝细胞及肿瘤组织中呈高丰度表达;对该基因进行序列测定并获得全长核苷酸序列;分析表明该核苷酸序列仅编码70余个氨基酸。 结论:该基因与肝细胞再生相关;可能仅编码小分子多肽或其N-端具有更长的序列。     

Thy-1表达水平对肺腺癌细胞A549迁移性及部分相关基因表达的影响

目的 验证Thy-1(CD90)基因与肺癌细胞迁移潜能的关系,并探讨其作用机制. 方法 利用真核表达载体pcDNA3.0构建包含Thy-1基因全长序列的重组表达质粒载体,转染A549细胞,G418筛选获得稳定克隆,采用RT-PCR及免疫荧光技术检测重组质粒转染后细胞内Thy-1 mRNA及蛋白表达水平的改变;通过体外Transwell迁移实验研究外源性Thy-1对A549细胞迁移能力的影响. 结果 构建了pcDNA3.0-Thy-1真核细胞表达载体;成功建立了稳定表达外源性人Thy-1蛋白的肺癌A549细胞株.Trenswell实验提示,表达外源性Thy-1蛋白的A549细胞较对照组细胞体外迁移能力下降(P<0.0001);基因芯片结果提示,Thy-1基因在肺癌细胞中表达后,影响了25个细胞迁移相关基因的表达,在检测基因表达差异时,RT-PCR与基因芯片能够得到基本一致的结果. 结论 Thy-1基因的过表达能降低肺癌细胞系A549细胞的迁移能力,并改变A549细胞多个细胞迁移相关基因的表达,提示Thy-1在肺癌组织的表达状态可能影响肺癌的转移性.     

细胞凋亡相关新基因Apr-3转录剪接体的克隆、测序及亚细胞定位

目的克隆Apr-3基因的一个转录剪接体,并对其进行测序及亚细胞定位。方法培养HL-60细胞,提取HL-60细胞总RNA,应用RT-PCR获取Apr-3的转录剪接体的编码区cDNA序列,将该cDNA与质粒pcDNA3·1/myc-His(-)B连接,构建克隆载体,将其转化E.coli DH5α,进行测序,与GenBank中登录序列比对结果正确后将该cDNA与质粒pEGFP-C3连接,并将其转染COS-7细胞。结果对测序结果进行序列分析,与GenBank中登录的Apr-3编码区完全一致。pEGFP-Apr-3基因表达产物定位于COS-7细胞的细胞膜和细胞质。结论对Apr-3基因的一个转录剪接体进行克隆,构建了真核表达载体,首次发现Apr-3的该转录剪接体主要在真核细胞的细胞膜和细胞质表达,为后期对该基因的结构和功能的研究奠定基础。     

人sTRAIL基因载体构建及其在真皮干细胞的表达

背景:基于肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor,TNF)可溶性相关凋亡诱导配体(soluble related apoptosis inducing ligand,sTRAIL)抗瘤的生物特性,克隆sTRAIL基因,构建其真核表达载体,为肿瘤细胞凋亡的实验研究奠定基础。目的:构建真核表达载体pEGFP-N1/sTRAIL,并转染真皮干细胞,以探究sTRAIL基因导入真皮干细胞的表达情况。方法:采用RT-PCR二步法,以人胎盘组织总RNA为模板,扩增sTRAIL的cDNA序列,将其克隆入pMD18-T载体,随后亚克隆入载体pEGFP-N1中,构建其真核瞬时表达载体pEGFP-N1/sTRAIL,以Fugene6转染技术,将sTRAIL基因导入真皮干细胞。倒置显微镜下观测转染后真皮干细胞生长变化及sTRAIL在其中的表达等情况。RT-PCR法对目的基因转染的真皮干细胞进行鉴定。结果与结论:克隆到sTRAIL基因的cDNA序列,成功构建了其真核表达载体,该真核表达载体能携带sTRAIL基因在真皮干细胞中正常表达。倒置显微镜下观测到转染后真皮干细胞生长状态与未转染的真皮干细胞无差异。以经sTRAIL基因转染的真皮干细胞该基因组DNA为模板,用RT-PCR法能扩增到sTRAIL基因cDNA序列。     

基因芯片技术的研究进展

基因芯片技术的诞生是基于人类基因组计划的成果,它以一种全面、综合、系统的思维方式来研究生命现象。同时,它还是疾病诊断和治疗的重大方法学突破,也是新药开发筛选的新方法。     

DMD基因突变及突变检测技术研究进展

假性肥大型进行性肌营养不良（DMD／BMD）一类发病率较高的X连锁隐性遗传病。DMD基因庞大,突变机制复杂,随着分子生物学的进展,对DMD基因及其所编码aystrophin蛋白的认识不断深入,探索更简便、准确、经济的基因突变检测技术成为目前对DMD研究的热点,本文着重对DMD基因、突变与表型关系的研究进展,以及突变检测技术的进展做一综述。     

基因枪转导K-RAS反义基因对胰腺癌细胞(K-RAS P21)蛋白表达的影响

目的观察基因枪转导K-RAS突变特异性反义基因对胰腺癌细胞K-RAS P21蛋白的影响。方法利用基因枪技术,将反义基因转导入宿主细胞,通过免疫细胞化学和Western blot方法,观察K-RAS突变特异性反义基因转导后AsPC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3三种人胰腺癌细胞系K-RAS P21蛋白的变化。结果转导K-RAS突变特异性反义基因后,AsPC-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞的K-RAS P21蛋白表达明显降低;BxPC-3胰腺癌细胞的K-RAS P21蛋白表达无明显变化。结论突变特异性K-RAS反义基因经基因枪有效转导后,可用于胰腺癌的治疗。     

基因枪转导K-RLIS反义基因对胰腺癌细胞（K-PLASP21）蛋白表达的影响

目的观察基因枪转导K-RAS突变特异性反义基因对胰腺癌细胞K-RASP21蛋白的影响。方法利用基因枪技术，将反义基因转导入宿主细胞，通过免疫细胞化学和Westernblot方法，观察K-RAS突变特异性反义基因转导后ASPC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3三种人胰腺癌细胞系K-RASP21蛋白的变化。结果转导K-RAS突变特异性反义基因后，AsPC-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞的K-RASP21蛋白表达明显降低；BxPC-3胰腺癌细胞的K-RASP21蛋白表达无明显变化。结论突变特异性K-RAS反义基因经基因枪有效转导后，可用于胰腺癌的治疗。     

降钙素基因的化学合成与克隆

本文报道用化学法全合成降钙素的基因。基因全长113碱基对。采用大肠杆菌偏爱密码子。整个基因分为6个片段合成。用T~4DNA连接酶一次连接成功,序列分析证明合成的基因序列与设计的一致。     

Phylogeny of Thogoto Virus

Thogoto virus is a tick-borne member of the family Orthomyxoviridae. Previously, based on the similarity in antigenic relationship by cross-neutralization test, all virus strains were concluded to have derived from the same origin. In this study, we obtained partial gene sequences of 4 genes (PB1-like protein, PA-like protein, glycoprotein, and nucleoprotein) of 8 Thogoto virus strains isolated in Africa, Asia, and Europe and studied the genetic variation and phylogeny. Unrooted phylogenetic trees created by both neighbor-joining and maximum likelihood methods based on nucleotide and amino acid sequences for 4 genes were mostly similar and revealed two lineages, Euro-Asian and African. Intra-lineage nucleotide sequence variation was greater in the Euro-Asian lineage than in the African lineage for all 4 genes. Furthermore, for the strains of Euro-Asian lineage, variations for two genes associated with RNA-dependent RNA polymerase activities were greater than those for glycoprotein or nucleoprotein gene, based on both nucleotide and amino acid sequence differences as well as on synonymous and nonsynonymous differences, indicating greater mutation rates for the polymerase activity genes in these strains.     

三例眼皮肤白化病患者TYR和P基因的突变分析

目的 分析眼皮肤白化病(oculocutaneom albinism,OCA)患者酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因和P基因的基因突变.方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR)和变性高效液相色谱(de-naturing high-perfomanee liquia chromatography,DHPLC)技术对3例患者的眼皮肤白化病Ⅰ、Ⅱ型相关基因(TYR和P基因)的外显子进行突变检测,并对DHPLC检出的突变样本进行测序和限制性内切酶分析以验证该突变.针对未见报道的新突变,筛查100名表型正常的无关个体,排除多态的可能.结果 在3例患者中检测出两种P基因突变,未检测到TYR基因突变.其中,患者1的P基因第13外显子发生杂合突变T450M;患者2的P基因发生两个杂合突变,分别是第13外显子T450M和第23外显子G775R;患者3的P基因第23外显子发生杂合突变G775R.P基因第13外显子限制性内切酶分析显示,患者1、2均出现杂合突变T450M导致的Oli I酶切位点部分消失,100名表型正常的无关个体未检出该突变;经检索,T450M为一未见报道的新突变.结论 联合应用PCR、DHPLC、DNA测序和限制性内切酶分析的方法可有效的对白化病进行基因诊断.     

原发性肝细胞癌RIT1基因的突变和扩增

目的　探讨 RIT1基因突变和扩增在肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)的发生情况及其与发病的关系。　方法　采用 PCR直接测序法检测 5 0例原发性 HCC患者的肝癌组织和非癌肝组织RIT1基因在所包含的 6个外显子的全序列寻找突变位点 ;并用荧光定量 PCR法检测 RIT1基因的扩增情况。　结果　在 5 0例肝癌组织中 1例出现第 5外显子编码区 2 4 1位核苷酸 G/ C变异 ,其对应密码子改变为GAG81CAG,编码氨基酸改变为 Glu81Gln,该氨基酸变异位于 GTP结合的保守功能域内 ,该病例的非癌肝组织以及其余 4 9例的肝癌组织和非癌肝组织均未发生此种改变 ;在 5 0例肝癌组织和非癌肝组织中均出现 5′- UTR(起始密码子前 2 1位核苷酸 ) G/ C变异 ;在获得有效扩增数据的 4 3例肝细胞癌患者中 ,11例有 2～2 97倍的 RIT1基因扩增 ,扩增率为 2 5 .6 %。　结论　基因扩增是 RIT1基因在肝细胞癌的激活方式之一 ,可能与肝细胞癌的发病有关 ,而点突变方式可能意义不大。     

不同选择剪接形式的小鼠Era在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:对不同剪接形式的小鼠era基因(mera)进行克隆、原核表达,并进行纯化,检测抗人Era蛋白抗体对于两种剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后鼠Era蛋白的研究奠定基础。方法:采用两种剪接形式era基因的MBP融合表达载体(pMAL-meraW,pMAL-meraS),在大肠杆菌中进行表达,对其进行纯化,并应用Westernblot鉴定了抗人Era蛋白抗体的特异性。结果:原核表达的MBP-mEraW、MBP-mEraS融合蛋白经过薄层扫描后发现其分别占菌体总蛋白的17%、19%;纯化后的融合蛋白纯度为67%和61%;用抗人Era蛋白抗体进行Westernblot发现抗体特异性较好,适合两种剪接形式的鼠Era蛋白的检测。结论:利用原核系统高效表达了不同剪切形式的鼠era基因,并检测了兔抗人Era蛋白抗体对不同剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后对鼠era基因的研究奠定了基础。     

Inhibition of tumor growth by histoincompatible cells expressing interleukin-2.

Murine tumor cells engineered to express IL-2 have been shown to be rejected by the syngeneic host, which is then protected against a subsequent tumorigenic challenge. To assess whether IL-2 has to be produced by the tumor cells themselves, or whether its local delivery would be sufficient to promote such beneficial effects, the syngeneic tumor cells were co-inoculated with allogeneic or xenogeneic cells secreting IL-2, selected after gene transfection. In several murine systems, it was observed that this is an efficient approach for controlling the growth of the syngeneic tumor. However, animals which rejected the tumor were not protected against a subsequent challenge. Several lines of evidence indicate that NK cells play a major role in tumor rejection induced by the IL-2 expressing histoincompatible vector cells. Thus, while local delivery of IL-2 in the vicinity of a tumor might not be sufficient to promote a systemic long-term specific antitumor immune response, it can control the growth of the primary syngeneic tumor. These experiments demonstrate the feasibility of using genetically engineered histoincompatible cells (which are rejected by the host's immune system) as a transient delivery system in vivo.