PCR扩增IS6110用于检测痰液中结核分枝杆菌的评价

为评价ＰＣＲ扩增ＩＳ６１１０检测结核分枝杆菌的特异性，用Ｂａｃｔｅｃ培养法对４５例可疑肺结核病人痰样品进行分枝杆菌检测；用４对分别针对ＩＳ６１１０不同区域引物和一对分枝杆菌属特异的１６ＳｒＲＮＡ基因引物对这４５例痰样品及其培养物和２７株已知分枝杆菌属菌株进行ＰＣＲ扩增检测。结果所有分枝杆菌ＤＮＡ均扩增出了１６ＳｒＲＮＡ基因片段，结核分枝杆菌ＤＮＡ均扩增出了ＩＳ６１１０的４个不同区域片段，非典型分枝杆菌ＤＮＡ均未扩增出ＩＳ６１１０片段，但存在假阳性和假阴性     

采用gyrB基因扩增快速鉴定结核分枝杆菌复合群的初步研究

目的:初步分析gyrB基因扩增用于结核分枝杆菌复合群(MTC)快速鉴定的可行性.方法:采用特异性引物进行分枝杆菌标准株和临床株的gyrB基因扩增,再通过琼脂糖凝胶电泳观察聚合酶链反应(PCR)结果.结果:15株各种分枝杆菌标准株中,结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌均扩增出1 184bp目的片段,而其余分枝杆菌PCR结果为阴性;94株分枝杆菌临床株中,60株MTB和10株牛分枝杆菌扩增阳性.而其他分枝杆菌(包括6株脓肿分枝杆菌、5株偶发分枝杆菌、4株龟分枝杆菌、3株鸟分枝杆菌、3株胞内分枝杆菌、2株耻垢分枝杆菌、1株堪萨斯分枝杆菌)均扩增阴性.结论:采用针对MTC的特异性引物进行gyrB基因扩增能快速、准确地鉴别MTC和非结核分枝杆菌.     

PCR-反向线点杂交技术鉴定慢生长分枝杆菌的方法学研究

目的建立和评价以16S-23S rDNA间隔序列（ITS）为靶基因的PCR-反向线点杂交技术（RLB）快速鉴定慢生长分枝杆菌（SGM）的方法。方法PCR—RLB检测70株分枝杆菌参考菌株、4株诺卡菌参考菌株、5株红球菌参考菌株、1株棒状杆菌参考菌株，来源于中国生物制品和药品鉴定所和悉尼大学感染性疾病和微生物中心；358株分枝杆菌临床分离株来源于深圳、广州和澳大利亚。结果所有分枝杆菌参考菌株均可扩增出200～250bp DNA片段，分枝杆菌引物可扩增4种诺卡菌和5种红球菌，但不与分枝杆菌属探针和种探针杂交。21个探针可鉴定分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、溃疡／海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌a／b和堪萨斯分枝杆菌c亚种及其他16种SGM。结论该方法能快速、简便和准确地鉴定SGM。     

结核分枝杆菌利福平耐药基因的检测

以药物敏感试验为标准，应用聚合酶链反应－单链构象多态性分析方法对６８例利福平耐药菌株和２０例利福平敏感菌株进行测定，结果８８例结核分枝杆菌均扩增出目标ＤＮＡ条带，１０例非结核分枝杆菌和８例非分枝杆菌未出现目标ＤＮＡ条带，所用引物扩增ｒｐｏＢ基因２１５ｂｐ片段为结核分枝杆菌复合群异性的。     

PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的研究

目的探讨PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因作为新的分子药敏试验方法的价值。方法应用PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因核心区的突变，同时对片段长度为215bp的PCR扩增产物进行测序分析。受试菌为23株利福平敏感结核分枝杆菌以72．35株利福平抗性结核分枝杆菌。结果23株利福平敏感结核分枝杆菌分别用PCR—SSCP和PCR扩增片段测序均没有检测到巾0B碱基突变。而在35株利福平抗性菌株中，PCR—SSCP检测到31株与H37Rv标准株不同的带谱，PCR—SSCP检测基因突变的敏感度和特异度分别为88．6％（31／35）和100％（23／23）。对35株利福平抗性菌株PCR扩增产物进行测序分析，在其中32株中检出了基因突变。测序分析检测基因突变的敏感度和特异度分别为91．4％（32／35）和100％（23／23）。卡方检验，PCR—SSCP和PCR扩增片段测序两种方法的敏感度之间没有显著性差异（P〉0．05）。若以DNA测序为标准，则PCR—SSCP检测基因突变的准确度、敏感度和特异度分别为93．1％（54／58），96．9％（31／32）和100％（23／23）。结论PCR—SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变可用于利福平药物敏感度的快速测定。     

RNA恒温扩增实时检测技术快速鉴定鸟分枝杆菌

目的建立RNA恒温扩增技术快速鉴定鸟分枝杆菌(RIARD-MA)的方法,评估鉴定分枝杆菌临床分离株的应用效果。方法以鸟分枝杆菌(MA)的16S rRNA的特异序列为检测靶标,设计RNA探针和带有T7启动子的逆转录扩增引物,42℃恒温扩增实时检测,对21种分枝杆菌标准株、4株非分枝杆菌和259株分枝杆菌临床分离株进行鉴别检测;同时以PCR测序结果为参考对照。结果 RIARD-MA可以在2 h内完成检测,能准确鉴定出21种分枝杆菌标准株及4株非分枝杆菌检测中的MA,检测灵敏度达103CFU/mL;检测分枝杆菌临床分离株中MA的敏感性、特异性均可达100%。结论 RIARD-MA鉴定MA具有较高的敏感性、特异性,检测快速,有望作为一种新的MA临床分离株鉴定方法。     

PCR—SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的研究

目的探讨PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因作为新的分子药敏试验方法的价值。方法应用PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因核心区的突变，同时对片段长度为215bp的PCR扩增产物进行测序分析。受试菌为23株利福平敏感结核分枝杆菌以72．35株利福平抗性结核分枝杆菌。结果23株利福平敏感结核分枝杆菌分别用PCR—SSCP和PCR扩增片段测序均没有检测到巾0B碱基突变。而在35株利福平抗性菌株中，PCR—SSCP检测到31株与H37Rv标准株不同的带谱，PCR—SSCP检测基因突变的敏感度和特异度分别为88．6％（31／35）和100％（23／23）。对35株利福平抗性菌株PCR扩增产物进行测序分析，在其中32株中检出了基因突变。测序分析检测基因突变的敏感度和特异度分别为91．4％（32／35）和100％（23／23）。卡方检验，PCR—SSCP和PCR扩增片段测序两种方法的敏感度之间没有显著性差异（P〉0．05）。若以DNA测序为标准，则PCR—SSCP检测基因突变的准确度、敏感度和特异度分别为93．1％（54／58），96．9％（31／32）和100％（23／23）。结论PCR—SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变可用于利福平药物敏感度的快速测定。     

分枝杆菌的分子诊断

结核病仍然是世界范围的主要传染病 ,由于致病菌结核分支杆菌生长速度缓慢 ,结核杆菌和其他的临床上重要的分枝杆菌的分离、鉴定和药物敏感试验需要几个星期或更长的时间。近年来 ,多种分子诊断方法已用于分枝杆菌的直接检测 ,菌种鉴定和药物敏感实验 ,极大缩短了诊断时间。两种核酸扩增方法改良型结核分支杆菌直接试验和Amplicor结核分枝杆菌试验已经获得FDA批准用于临床标本结核分枝杆菌的检测。PCR测序和DNA探针作为多数分枝杆菌的菌种鉴定的常规手段。高通量的寡核苷酸阵列已用于分枝杆菌利福平耐药基因突变的检测和菌种的鉴定     

分枝杆菌的分子诊断

结核病仍然是世界范围的主要传染病，由于致病菌结核分支杆菌生长速度缓慢，结核杆菌和其他的临床上重要的分枝杆菌的分离，鉴定和药物敏感试验需要几个星期或更长的时间，近年来，多种分子诊断方法已用于分枝杆菌的直接检测，菌种鉴定和药物敏感实验，极大缩短了诊断时间，两种核酸扩增方法改良型结核分支杆菌直接试验和Amplicor结核分枝杆菌试验已经获得FDA批准用于临床标本结核分枝杆菌的检测，PCR测序和DNA探针作为多数分枝杆菌的菌种鉴定的常规手段。高通量的寡核苷酸阵列已用于分枝杆菌利福平耐药基因突变的检测和菌种的鉴定。     

焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

目的利用焦磷酸测序技术，建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法。方法应用生物素标记的引物扩增rpoB基因片段，经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板，设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测rpoB基因耐药突变区的81bp序列突变情况，与H。Rv序列比对后判断耐药结果。结果通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌rpoB基因突变检测平台，32株利福平耐药株均在rpoB基因片段上检测到突变，22株利福平敏感株未检测到突变，检测结果与直接测序符合率达100％。结论本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。     

Rapid differentiation between clinically relevant mycobacteria in microscopy positive clinical specimens and mycobacterial isolates by line probe assay

The Inno LiPA Mycobacteria assay, based on PCR amplification of the 16-23S rRNA spacer region of Mycobacterium species, has been designed for identification of mycobacteria grown in culture media and discrimination between Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae, M. xenopi, scrofulaceum and M. chelonae group including M. abscessus. In order to evaluate the system as a fast diagnostic tool, the assay was for the first time used directly on 14 microscopy positive clinical specimens and 71 isolates and the results were compared to those of conventional identification using 16S rDNA analysis and biochemical properties. The assay only misidentified one strain, which was found to be M. avium complex instead of M. intracellulare as found by the conventional tests. The assay allows rapid discrimination of the eight most clinically relevant mycobacteria in microscopy positive clinical specimens and isolates within 6 h in the same procedural run.     

Direct identification of mycobacteria from smear-positive sputum samples using an improved multiplex polymerase chain reaction assay

The rapid identification of mycobacteria from smear-positive sputum samples is very important. To identify the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) and frequently isolated nontuberculous mycobacteria strains directly from smear-positive sputum samples, an improved multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay was developed. Nine pairs of primers targeting the 16S-23S rDNA internal transcribed spacer-1, hsp65, and the early secretory antigen (ESAT-6) gene sequences were developed, and their efficacy was evaluated in comparison to traditional culturing and 16S rRNA gene sequencing methods. A total of 200 smear- and culture-positive sputum specimens collected between November 2005 and May 2006 were used for the analysis. The results of the assay showed an accurate identification rate for acid-fast bacilli (AFB) 3+, AFB 2+, and AFB rare/1+ samples of 98%, 95%, and 53%, respectively. The improved multiplex PCR method saves time and has advantages for identifying mycobacteria from AFB 2+ and 3+ sputum samples. The method is suitable for use in countries with a high MTBC prevalence rate.     

直接杂交法检测痰液中结核分枝杆菌

目的 建立了一种高度灵敏、特异、快速和简便的探针杂交检测技术，以解决临床上结核病快速诊断的难题。方法 采用简易的方法处理标本，以对结核分枝杆菌特异的生物素标记188bpDNA探针进行点杂交，与链霉亲合素标记的辣根过氧化酶偶联后，以化学发光自显影方式记录检测信号。结果 此法的第三性可检出200个菌，较PCRI地为高，对20种分枝杆菌和9种非分枝杆菌检测时发现只有结核分枝杆菌呈阳性，以本法检测104例临床标本。结果发现，对其中45例结核病人痰涂片阳性标本。41例结核病人痰涂片阴性标本和18例非结核标本。检测阳性率分别为100%、65.9%和0.0%。结论 本法简便，特异。     

聚合酶链反应分子灯塔法检测结核分枝杆菌

目的 评价聚合酶链反应（PCR）分子灯塔法检测临床标本中结核分枝杆菌（结核菌）的应用价值。方法 应用涂片镜检法、培养法及PCR分子灯塔法检测142份结核病患者痰标本,42份非结核呼吸系疾病患者痰标本。结果 涂片镜检法检测结核病患者临床标本中结核菌阳性率为35.2%(50/142),培养法阳性率为35.9%(51/142),PCR分子灯塔法阳性率为44.4%(63/142)。用PCR分子灯塔法检测临床标本特异性为100％。结论 PCR分子灯塔法是一种全新的PCR分子交模式,PCR扩增、荧光探针杂交、检测一体化,在单一管内完成,其简便、快速、防污染,敏感性较高、特异性强,是结核病辅助诊断的有效方法之一。     

针对gyrA基因突变的反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的研究

目的 建立快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的反向斑点杂交(reverse dot blot hybridization,RDBH)技术,并观察其效果。方法 针对结核分枝杆菌gyrA基因序列及常见的突变位点,分别设计1条野生型和7条突变型探针,建立RDBH技术,对临床分离结核分枝杆菌菌株进行喹诺酮耐药性检测,以比例法药敏试验和DNA测序做对照。结果 应用比例法药敏试验、DNA测序、RDBH三种方法分别检测59株喹诺酮耐药株和51株喹诺酮敏感株,与比例法相比,RDBH试验灵敏度和特异度分别为69.49%(41/59)、100%(51/51),符合度为83.63%;而RDBH与DNA测序结果比较,敏感度和特异度分别为97.56%(40/41),98.55%(68/69),符合度达98.18%。结论 RDBH技术检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药具有良好的灵敏度、特异度和符合度。     

PCR反向点杂交技术快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种的应用研究

目的探讨PCR-反向点杂交技术(PCR-RDBHA)快速鉴定支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid BALF)标本中分枝杆菌菌种的临床应用价值。方法对临床306例活动性肺结核患者、疑似非结核分枝杆菌感染肺病患者BALF标本采用PCR-反向点杂交技术和传统的改良罗氏培养法进行分枝杆菌菌种鉴定。结果 306例BALF标本PCR反向点杂交技术检测出分枝杆菌127例,阳性率为41.5%(127/306),其中结核分枝杆菌复合群(MTC)108例,占分枝杆菌的85.0%(108/127),非结核分枝杆菌(NTM)19例,占分枝杆菌的15.0%(19/127)。NTM中,6例脓肿分枝杆菌,10例胞内分枝杆菌,2例戈登分枝杆菌,1例瘰疬分枝杆菌;传统的改良罗氏培养法检测出分枝杆菌101例,阳性率33.0%(101/306),经菌种的初步鉴定,其中MTC89例,占分枝杆菌的88.1%(89/101),NTM12例,占分枝杆的11.9%(12/101)。结论 PCR反向点杂交技术能够快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种,该方法简便、结果准确,具有良好的临床应用价值。     

应用膜芯片技术快速鉴定分枝杆菌菌种

目的：利用膜芯片技术建立一种快速、简便的分枝杆菌分子菌种鉴定方法。方法：以DNA直接测序法为对照，通过PCR．SSCP和膜芯片技术分析11种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和199株分枝杆菌临床分离株的菌种。结果：应用膜芯片技术分析11种分枝杆菌标准菌株和7种非分枝杆菌菌株，特异性100％。199株分枝杆菌临床分离株中，经16S rRNA PCR-SSCP初步菌种鉴定，30株为结核分枝杆菌复合群，应用膜芯片分析，显示与分枝杆菌属探针分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群探针a杂交阳性，两种鉴定方法结果一致：169株PCR．SSCP初步鉴定为非结核分枝杆菌的分离株，经芯片分析，58株为龟分枝杆菌，46株为胞内分枝杆菌，33株为堪萨斯、瘰疬、胃和猿猴分枝杆菌复合群，6株为偶然分枝杆菌，15株为戈登分枝杆菌，3株为乌分枝杆菌，2株为海和溃疡分枝杆菌复合群，另6株只与探针分枝杆菌杂交，经测序显示2株为胞内分枝杆菌，但其基因序列与标准菌株不完全相同，1株为土分枝杆菌，1株为迪氏分枝杆菌，1株为草分枝杆菌，1株为新金色分枝杆菌，芯片上无鉴定该菌种的探针。结论：应用膜芯片技术可简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种，指导临床合理治疗。     

反向斑点杂交快速检测肺炎链球菌

目的:建立一种利用DNA探针快速检测肺炎链球菌的反向斑点杂交方法.方法:在肺炎链球菌特异的自溶素基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成1段263 bp的DNA探针,然后用生物素标记的细菌DNA与该探针行反向斑点杂交,并将该方法应用于痰样本的检测.结果:所合成的探针具有高度特异性,与其他细菌间无交叉反应,该方法能检测出10 ng细菌DNA.50份痰标本肺炎链球菌培养阳性者8份,杂交阳性者12份,PCR阳性者18份.结论:反向斑点杂交具有快速、敏感、特异的优点,对肺炎链球菌的快速诊断有重要意义.     

Cloning of a gene from Mycobacterium tuberculosis coding for a hypothetical 27 kDa protein and its use for the specific PCR identification of these mycobacteria

PCR targeting the IS 6110 has been considered specific for identification of Mycobacterium tuberculosis and is frequently applied to confirm the presence of this organism directly in biological specimens. However, several authors found that some M. tuberculosis strains failed to hybridize with the IS 6110 probe and other authors found that false-positive results may be obtained for clinical samples when some methods based on IS 6110 are used. In the present study, the p27 gene isolated from a cosmid library was found to be highly specific for M. tuberculosis complex strains and allowed us to develop a PCR-based assay for rapid detection and identification of this mycobacterium. One pair of primers and two oligonucleotide probes were successfully used to amplify and to detect the DNA of strains belonging to the M. tuberculosis complex. These primers and probes did not hybridize with DNA from any of the 21 other mycobacterial species tested. It is worth noting that the chosen primers and probes hybridize with DNA from the M. tuberculosis strain with no IS 6110, furthermore no strain without p27 was found among the 410 strains tested in the present study.     

聚合酶链反应扩增结核杆菌的临床应用

采用PCR技术扩增人型结核分枝杆菌特异的158 bp DNA片段靶基因,检测60例肺结核病人痰标本,结果表明,阳性率达58.3%,对照的常规培养法阳性率为11.7%。20例非结核病患者痰标本两种检测结果均为阴性.研究结果表明,PCR 扩增检测结核杆菌技术比常规检验方法快速敏感,且有较高的特异性。