胰腺癌组织和细胞系中DNA错配修复基因的甲基化和异常表达

目的:检测错配修复基因hMLH1、hMSH2和 hMLH3在胰腺癌中的甲基化和表达状态,探讨错配修复缺陷在胰腺癌发病中的作用.方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)检测hMLH1、hMSH2和hMLH3的甲基化状态,逆转录PCR(RT-PCR)检测hMLH1、hMSH2和hMLH3的表达状态.结果:在胰腺癌组织中hMLH1、hMSH2和hMLH3的甲基化频率分别为28.6%、46.4%和39.3%;在癌旁正常组织中分别为3.6%、10.7%和12.5%,上述各基因在胰腺癌中的甲基化频率均显著高于癌旁正常组织(hMLH1:x2=12.97,P<0.01;hMSH2:x2=17.50,P<0.01; hMLH3:x2=10.47,P<0.01).在胰腺癌组织中分别有25.O%、50.0%和33.9%没有检出hMLH1、hMSH2和hMLH3表达.在癌旁正常组织中分别有7.1%、8.9%和16.1%,各基因在胰腺癌中的表达缺失频率均显著高于癌旁正常组织(hMLH1:x2=6.62,P<0.05;hMSH2:)x2 =22.73,P<0.01:hMLH3:x2=4.76,P<0.05).hMLH1在胰腺癌细胞系PANC-l和CFPAC-1 检出甲基化和表达消失.hMSH2在PC-3检出甲基化和表达消失.hMLH3在PC-3和PANC-1检出甲基化和表达亦消失.结论:在胰腺癌错配修复基因缺陷较普遍参与了部分胰腺癌的发病过程.     

胃癌多基因甲基化状态分析

目的:检测胃癌组织中p16,hMLH1,E-cadherin和RUNX3基因甲基化状态,探讨多基因甲基化在胃癌发病中的作用.方法:采用饱和氯化钠法提取肿瘤组织、瘤旁组织及正常胃黏膜组织DNA.采用甲基化特异PCR对上述基因甲基化状态进行分析.结果:在正常胃黏膜组织中,38.9%存在E-cadherin甲基化,16.7%存在RUNX3甲基化,没有发现p16和hMLH1甲基化;在癌旁组织中,p16、hMLH1、E-cadherin和RUNX3甲基化频率分别为8.3%,4.2%,54.2%和29.2%;在胃癌组织中,上述基因甲基化频率分别为33.3%,20.8%,0.8%和54.2%.66.7%胃癌被检出存在2个或2个以上基因甲基化,明显高于癌旁组织(37.5%,χ2=4.09,P<0.05)和正常胃黏膜组织(5.6%,χ2=15.94,P<0.01),而癌旁组织则高于正常胃黏膜组织(χ2=4.16,P<0.05).有5例胃癌没有检出任何一种基因甲基化.结论:多基因甲基化是部分胃癌发展过程中一种早期事件,提示多基因甲基化在这部分胃癌的发病中起重要作用.     

错配修复基因hMLH1甲基化与胃癌的关系

目的:通过研究散发性胃癌中错配修复基因hMLH1 mRNA的表达及其启动子区5'CpG岛甲基化状态,探讨hMLH1基因异常甲基化在胃癌发生过程中的作用.方法:应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)检测60例胃癌组织及其癌旁黏膜组织中hMLH1基因启动子区的甲基化状态,逆转录PCR(RT-PCR)检测两种组织中hMLH1 mRNA表达情况.结果:胃癌组织hMLH1 mRNA表达水平明显低于癌旁组织(t=4.082,P<0.01),hMLH1基因启动子区高甲基化18例(30%),其癌旁黏膜组织中未发现有甲基化.hMLH1基因启动子区甲基化与胃癌的临床病理参数之间无明显的相关性.hMLH1 mRNA表达阴性的21例病例中,17例(81%)发生甲基化,而hMLH1 mRNA表达阳性的39例中仅有1例(2.5%)发生甲基化,hMLH1 mRNA表达降低与甲基化之间存在明显的相关性(χ2=8.0182,P=0.0046).结论:胃癌组织中hMLH1基因启动子区甲基化与其mRNA表达缺失密切相关,是导致hMLH1基因错配修复功能缺陷的重要原因之一.     

特异性PCR法检测胰腺癌p16基因甲基化改变

目的：探讨胰腺癌p16基因启动子区5'CpG岛甲基化改变的特点及其与临床病理特征的关系。方法：应用甲基化特异性PCR法进行甲基化检测。结果：14／36例胰腺癌标本的p16基因启动子区5'CpG岛检测到甲基化，甲基化频率为38．9％，5例癌旁组织、1例正常胰腺组织、7例慢性胰腺炎及2例胰腺粘液性囊腺瘤未发现相应区域的甲基化。结论：p16基因启动子区5'CpG岛甲基化是胰腺癌p16基因失活的机制之一，是胰腺癌细胞区别与正常细胞的分子事件。检则p16基因甲基化可能有助于胰腺癌的诊断及鉴别诊断。     

DNA甲基化对大肠癌相关基因表达的调控意义

目的:探讨大肠癌发生与演进中p16,Rb,cyclin D1甲基化状态与蛋白表达的关系及意义．方法:提取正常黏膜、腺瘤、癌旁组织及癌组织基因组DNA,应用MSP法检测不同病变阶段组织中各基因的甲基化状态,并对其与蛋白表达及临床病理参数的关系进行分析．结果:在大肠癌发生与演进过程中,p16,Rb 基因甲基化率呈增高趋势,cyclin D1基因甲基化率呈下降趋势,p16(切缘:r=-0．185,P =0．173;腺瘤:r=-0．381,P=0．013:癌旁:r= -0．419,P=0．001;癌:r=-0．516,P=0．000)、 cyclin D1(切缘:r=-0．282,P=0．035;腺瘤:r= -0．329,P=0．033;癌旁:r=-0．298,P=0．026; 癌:r=-0．618,P=0．000)基因甲基化程度分别与其蛋白表达呈明显负相关,且在癌组织分化程度(p16:X2=11.232,P=0．002,cyclin D1:X2 =9．144,P=0．015)、浸润深度(p16:X2=6．229, P=0．013;cyclin D1:X2=8．023,P=0．006)和淋巴结转移(p16:X2=5．707,P=0．016;cyclin D1: X2=7．794,P=0．005)上有显著性差异．Rb基因的甲基化状态在Rb表达抑制上不起主要作用．结论:大肠癌p16高甲基化和cyclin D1低甲基化可能是p16失活和cyclin D1过表达的主要机制,在大肠癌的发生、发展中发挥重要作用, 对于大肠癌的早期诊断、恶性程度及预后判断有重要意义．     

特异性PCR法检测胰腺癌p16基因甲基化改变

目的探讨胰腺癌 p16基因启动子区5'CpG岛甲基化改变的特点及其与临床病理特征的关系.方法应用甲基化特异性PCR法进行甲基化检测.结果 14/36例胰腺癌标本的p16基因启动子区5'CpG岛检测到甲基化,甲基化频率为38.9%,5例癌旁组织、1例正常胰腺组织、7例慢性胰腺炎及2例胰腺粘液性囊腺瘤未发现相应区域的甲基化.结论 p16基因启动子区5'CpG岛甲基化是胰腺癌p16基因失活的机制之一,是胰腺癌细胞区别与正常细胞的分子事件.检测p16基因甲基化可能有助于胰腺癌的诊断及鉴别诊断.     

胃癌组织中肿瘤相关基因甲基化及其表达与叶酸和代谢酶MTHFR基因多态性的关系

目的:探讨人胃癌组织中癌基c-myc,抑癌基因p16INK4A,p21WAF1,错配修复基NhMLH1和hM2SH2的甲基化状态及其表达与叶酸、MTHFR基因多态性的关系．方法:胃癌38例手术切除标本的癌区、癌旁和外周正常黏膜组织,运用FOL ACS:180自动化学发光系统测定叶酸含量,PCR-RFLP技术检测MTHFR基因677(C→T)和1298(A→C)两个常见多态,并分别以Real—time RT-PCR和甲基化特异性PCR (MSP)技术检测肿瘤相关基因的表达和甲基化状态．结果:c-myc表达升高,p16INK4A,hMLH1和hMSH2表达降低的胃癌黏膜组织其基因启动子区异常甲基化．p21WAF1,hMSH2表达降低, p16INK4A高甲基化者叶酸水平明显降低,c-myc低甲基化和表达升高者中均存在低叶酸水平．MTHFR 677CC基因型的胃癌黏膜组织p16INK4A甲基化升高且表达降低,而其余肿瘤相关基因的甲基化及其表达与MTHFR两个常见多态均无明显相关性．结论:DNA甲基化在胃癌的发生、发展中具有重要作用,叶酸水平和MTHFR基因多态性通过影响部分肿瘤相关基因的甲基化状态而调控其表达．     

原发胃癌中p16基因及其甲基化状态、表达异常的研究

目的：检测胃癌组织中p16基因及启动了甲基化状态和p16蛋白表达情况。方法：选择p16基因及启动子区域,用PCR－SSCP、MSP（甲基化特异的PCR）法、测序和免疫组化等方法对100例胃癌患者的癌组织和癌旁组织进行检测。结果：71％的病例p16表达阴性,54％的病例具有p16基因启动子区的高甲基化,50％的病例同时有p16表达阴性和p16基因启动子区的高甲基化,无突变和纯合缺失检出。结论：提示p16基因启动子区域高甲基化是胃癌中p16基因失活的主要原因。     

APC和CDKN2A基因甲基化定量分析对肝细胞癌的诊断价值

目的:系统分析基因甲基化在肝癌发生中涉及的分子途径, 从中选取代表性基因进一步分析其甲基化在细胞癌变过程中的生物学及临床意义.方法:对10年间关于肝癌基因甲基化相关文献进行数据发掘与功能分类, 在其中2个与肝癌发生相关的生物途径中选取APC和CDKN2A基因, 采用实时定量甲基化特异性PCR技术对46例成对肝癌与癌旁组织中基因的甲基化水平进行定量分析并评估其诊断价值.结果:生物信息学分析显示肝癌中发生甲基化的基因主要涉及Wnt/β-catenin、p16及p533个主要分子途径; 甲基化分析表明CDKN2A基因在肝癌组织中甲基化水平极显著高于癌旁组织( P<0.0001), 并且癌组织中甲基化程度在高龄患者中较高( P = 0.0027); ROC曲线分析表明通过CDKN2A甲基化定量分析能够高效区分癌与非癌组织(AUC = 0.8526). APC基因在癌与癌旁间总体甲基化水平无显著性差异( P = 0.0656).结论:CDKN2A基因甲基化水平的升高在肝细胞癌变过程中可能具有重要作用, 其甲基化水平的升高可作为一种鉴别癌与非癌组织的分子标志物. CDKN2A甲基化模式的特异性使其在肝癌早期筛查和诊断中具有一定的临床应用价值.     

原发性肝细胞癌中p16基因甲基化及其蛋白表达分析

目的探讨p16基因的甲基化改变和p16蛋白表达在肝癌的发生发展过程中的作用。材料和方法收集原发性肝细胞癌(HCC)手术切除的新鲜标本10例,石蜡包埋标本3 3例,Ⅰ级8例,Ⅱ级2 1例,Ⅲ级14例(Edmonson分级) ,p16蛋白检测用免疫组化法(ABC) ,p16基因甲基化检测用甲基化特异PCR(MS_PCR)法。结果HCCp16蛋白缺失率65 1% ( 2 8/4 3 ) ,而癌旁组织缺失率11 5 % ( 3 /2 6) ,两者相比有显著差异(P <0 0 1)。Ⅰ～Ⅱ级HCCp16蛋白的缺失率与Ⅲ级相比明显较低(P <0 0 5 )。p16蛋白阳性的15例HCC标本,均未检出基因甲基化,p16蛋白缺失的2 8例标本,有19例检出基因甲基化,甲基化率44 2 %。10例癌旁肝组织有1例基因甲基化,HCC和癌旁组织相比甲基化率有明显差异(P <0 0 5 ) ,基因甲基化与p16蛋白缺失明显相关(P <0 0 1)。各级HCCp16基因启动子区甲基化率有明显差异(P <0 0 5 )。结论p16蛋白缺失与HCC的发生有密切关系,低分化的HCC和p16蛋白缺失有关,p16蛋白在判断其恶性程度方面有一定的价值。基因的甲基化可能是p16基因在HCC中的主要失活方式,HCC分化程度和p16基因甲基化之间有密切关系。     

胰腺癌细胞系BxPC3及胰腺癌组织Ras相关区域家族1A启动子CpG岛的甲基化状态

目的 检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株BxPC3及胰腺癌组织中的甲基化状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病机制中的可能作用.方法 采用结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)检测胰腺癌细胞株BxPC3、5例正常胰腺组织、13对胰腺癌及相应癌旁正常胰腺组织中RASSF1A启动子CpG岛的甲基化状态,计算其甲基化率.以甲基化酶抑制剂5-Aza-dC(5-Aza-2-deoxycitydine)处理BxPC3,观察处理前后甲基化率变化情况及RASSF1A mRNA表达变化.结果 在BxPC3细胞株中,RASSF1A启动子的CpG岛甲基化率为62.90%;正常胰腺、癌旁及癌组织中平均分别为9.14%、53.79%和55.82%.与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P值<0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P>0.05).BxPC3经5-Aza-dC处理后,RASSF1A的CpG岛甲基化率显著下降至42.50%(P<0.05),同时RASSF1A mRNA表达增强.结论 RASSF1A启动子CpG岛异常甲基化是胰腺癌发生发展中的早期事件,可能参与胰腺癌的发病过程.     

胃癌患者血清RASSF1A基因启动子区甲基化检测

Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）基因是近年发现的新型抑癌基因，其启动子区甲基化可能与胃肠道肿瘤的发生、发展密切相关。目的：检测胃癌患者血清RASSF1A基因启动子区甲基化情况，探讨其在胃癌早期诊断和预后评估中的可能作用。方法：以甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测47例胃腺癌患者、30例胃良性病变患者和30名健康对照者的血清RASSF1A基因启动子区甲基化情况，其中16例胃腺癌患者同时留取手术切除癌组织、癌旁组织标本以及术前、术后血标本行对照研究。结果：胃腺癌患者血清RASSF1A基因启动子区甲基化率为34．0％（16／47），显著高于胃良性病变患者（3.3％，1／30）和健康对照者（0％）（P〈0．01）。16例胃腺癌组织中5例（31．2％）检测到RASSF1A基因启动子区甲基化，其中4例（80．0％）术前、术后血清标本均检测到RASSF1A基因启动子区甲基化。血清RASSF1A基因启动子区甲基化与胃癌患者性别、年龄、肿瘤分化程度、有无转移以及血清癌胚抗原（CEA）水平均无相关性。结论：血清RASSF1A基因启动子区甲基化检测可望为胃癌的早期诊断和预后判断提供依据。     

多种抑癌基因在食管鳞状细胞癌中的甲基化状态及其临床意义

抑癌基因甲基化与食管癌相关,目前多种抑癌基因与肿瘤家族史相关性的报道少见。目的：研究多种抑癌基因在食管鳞状细胞癌（ESCC）中的甲基化状态及其临床意义。方法：选取2010年2～7月浙江省肿瘤医院76例ESCC患者。应用MSP技术检测肿瘤组织和相应癌旁正常组织中APC、RARl32、CDHl、p16…、RASSFlA等5个抑癌基因的甲基化状态,并分析抑癌基因甲基化状态与肿瘤家族史的关系及其对预后的影响。结果：ESCC组织APC、RARe2、CDHl、p16慨、RASSFlA的甲基化率均显著高于相应癌旁正常组织（P〈0．05）。ESCC组织中APC、RARl32、CDHl、RASSFlA甲基化与肿瘤家族史相关（P〈0．05）：CDHl、RASSFlA甲基化患者的生存期明显低于非甲基化患者（P-0．015、P=0．016）。结论：ESCC患者存在抑癌基因APC、RARe2、CDHl、p16№、RASSFlA高甲基化;且APC、RARe2、CDHl、RASSFlA甲基化与肿瘤家族史显著相关,CDHl、RASSFlA甲基化患者的预后可能较差。     

Aberrant methylation of the negative regulators RASSFIA, SHP-1 and SOCS-1 in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukaemia

Mutations in the receptor tyrosine kinase (RTK/RAS) signalling pathway frequently provide a proliferative signal in myeloid malignancies. However, the role of RASSF1A, SHP-1 and SOCS-1, negative regulators of RTK/RAS signalling, has not been extensively investigated in the myelodysplastic syndromes (MDS) or acute myeloid leukaemia (AML). This study employed methylation-specific polymerase chain reaction (MS-PCR) to determine if aberrant promotor methylation of RASSF1A, SHP-1 and SOCS-1 is involved in the pathogenesis of myeloid malignancies. Patients with MDS (n = 107), AML (n = 154) and juvenile myelomonocytic leukaemia (JMML, n = 5) were investigated, together with 15 normal controls. Primers were located in the promotor region of each gene as well as within exon 2 of SOCS-1. Methylation of RASSF1A was found in five of 55 (9%) MDS cases, but not in any of 57 AML cases studied. RASSF1A methylation was present in one case (20%) of JMML. SHP-1 methylation was present in 13 of 121 (11%) AML cases but was not found in MDS or JMML. SOCS-1 promoter methylation was present in eight of 74 (11%) MDS patients but was not seen in JMML or AML. Importantly, RAS mutations and RASSF1A and SOCS-1 methylation were mutually exclusive indicating that approximately 30% of MDS cases had a defect of the RTK/RAS pathway and its negative regulation. Finally, SOCS-1 exon 2 methylation may not be pathogenetically relevant, since it was detected in samples from normal individuals and did not correlate with promotor methylation.     

外周血DNA FHIT、RASSF1A基因甲基化水平与非小细胞肺癌危险性分析

目的 观察外周血DNA脆性组氨酸三联体基因(FHIT)、RAS相关结构域家族基因1A (RASSF1A)甲基化水平与非小细胞肺癌危险性的关系.方法 采用实时荧光定量PCR方法测定136例非小细胞肺癌患者、140例肺良性疾病患者及145名正常对照者外周血DNA FHIT、RASSF1A基因甲基化水平.结果 肺癌组、肺良性疾病组和正常对照组FHIT、RASSF1A基因启动子甲基化率比较,差异均有统计学意义(x2值分别为6.281、4.123,P值均＜0.05).单因素logistic回归分析结果提示,性别对患肺癌的危险性无影响(OR=1.434,P=0.377),年龄、吸烟史、FHIT、RASSF1A甲基化率对患肺癌的危险性有影响(OR值分别为1.712、1.983、1.698、1.735,P值分别为0.005、0.002、0.017、0.001).多因素logistic回归分析结果表明,随着FHIT、RASSF1A甲基化水平升高,患肺癌的危险性均明显增加(OR值分别为1.767、1.367,P值分别为0.002、0.016).性别、高龄和吸烟史均可增加患肺癌的危险性(OR值分别为2.786、3.829、4.216,P值均为0.000).结论 外周血DNA FHIT、RASSF1A高甲基化水平与非小细胞肺癌相关,可作为肺癌临床诊断中重要的生物标志物.     

肺癌患者Ras相关区域家族1A基因启动子异常甲基化的检测

目的探讨肺癌组织和外周血浆、支气管肺泡灌洗液(BALF)中Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因启动子异常甲基化状况及其在肺癌诊断中的价值。方法用甲基化特异PCR方法对肺癌患者癌组织、癌旁组织及相应血浆、BALF进行RASSF1A异常甲基化检测。结果45例肺癌组织中,RASSF1A基因启动子异常甲基化率为53.33%(24/45),相应血浆中RASSF1A的甲基化检出率为28.89%(13/45),BALF检出率为42.22%(19/45),而癌旁组织中的RASSF1A启动子甲基化检出率为13.04%(3/23)、正常对照血浆、非肺癌患者BALF中未检出甲基化,只检出未甲基化的RASSF1A。血浆、BALF中甲基化改变与肿瘤组织甲基化状况显著相关(P<0.01);但与患者年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度、肿瘤分类的差异无统计学意义(P>0.05)。结论血浆、BALF中RASSF1A基因异常甲基化改变的检测在肺癌的特异诊断等方面有一定的应用价值。     

Alterations of DNA methylation and histone modifications contribute to gene silencing in hepatocellular carcinomas

Aim: The aim of the present study was to examine DNA methylation and histone modification changes in hepatocellular carcinomas (HCC). Methods: DNA methylation in the P16, RASSF1a, progesterone receptor (PGR) and estrogen receptor alpha (ERalpha) promoters was determined by quantitative bisulfite-pyrosequencing technique in HCC patients. Histone H3-lysine (K) 4, H3-K9 and H3-K27 modifications in all these four genes were examined by chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay in HCC cell lines. Expression of two DNA methyltransferases (DNMT1 and DNMT3b) and three histone methyltransferases (SUV39H1, G9a and EZH2) in HCC patients was measured by real-time polymerase chain reaction. Results: Aberrant DNA methylation was detected in all the HCC. Patients with DNA methylation in the RASSF1a, PGR andERalpha promoters in cancers also had substantial DNA methylation in their non-cancerous liver tissues, whereas DNA methylation in the P16 promoter was cancer specific. Epigenetic states in HCC cell lines showed that silencing of P16 and RASSF1a depended on DNA methylation and histone H3-K9 methylation. However, silencing of the PGR and ERalpha genes was more closely related to H3-K27 methylation rather than DNA methylation. Consistent with the alteration of histone status, higher expression of G9a and EZH2 was found in HCC than in non-cancerous liver tissues (P < 0.01). Conclusion: These data suggest that multiple epigenetic silencing mechanisms are inappropriately active in HCC cells.     

DNA methylation analysis of tumor suppressor genes in monoclonal gammopathy of undetermined significance

Aberrant DNA methylation is considered an important epigenetic mechanism for gene inactivation. Monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) is believed to be a precursor of multiple myeloma (MM). We have analyzed methylation status of p15 ^INK4B , p16 ^INK4A , ARF, SOCS-1, p27 ^KIP1 , RASSF1A, and TP73 genes in bone marrow DNA samples from 21 MGUS and 44 MM patients, in order to determine the role of aberrant promoter methylation as one of the steps involved in the progression of MGUS to MM. Methylation specific polymerase chain reaction assay followed by DNA sequencing of the resulting product was performed. SOCS-1 gene methylation was significantly more frequent in MM (52%) than in MGUS (14%; p = 0,006). Methylation frequencies of TP73, ARF, p15 ^INK4B , p16 ^INK4A , and RASSF1A were comparable in MGUS: 33%, 29%, 29%, 5%, and 0%, to that observed in MM: 45%, 29%, 32%, 7%, and 2%. All patients lacked methylation at p27 ^KIP1 gene. In both entities, a concurrent methylation of p15 ^INK4B and TP73 was observed. The mean methylation index of MGUS was lower (0.16) than that of MM (0.24; p < 0.05). Correlations with clinicopathologic characteristics showed a higher mean age in MGUS patients with SOCS-1 methylated (p < 0.001); meanwhile in MM, methylation of p15 ^INK4B was more frequent in males (p = 0.009) and IgG isotype (p = 0.038). Our findings suggest methylation of TP73, ARF, p15 ^INK4B , and p16 ^INK4A as early events in the pathogenesis and development of plasma cell disorders; meanwhile, SOCS-1 methylation would be an important step in the clonal evolution from MGUS to MM.