尖吻蝮蛇血凝酶临床止血作用及安全性研究进展

尖吻蝮蛇血凝酶( hemocoagulase agkistrodon, HCA)(商品名：苏灵)是从我国华南尖吻蝮蛇(俗称五步蛇)体内的毒液提炼和研制而成,所提取的单一组分血凝酶纯度高达99%,是国际上第一个达到如此高纯度的蛇毒血凝酶产品。2002年8月获得国家食品药品监督管理局( SFDA )颁发的药物临床研究批件并进入临床试验研究阶段,现将近年对尖吻蝮蛇血凝酶止血作用及用药安全性的研究进展综述如下。     

浙江尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯化及促凝活性

采用柱色谱等纯化方法从浙江尖吻蝮蛇凝血酶中提取获得一种类凝血酶（TQ-1）,采用RP-HPLC、MALDI-TOF、SDS-PAGE、等电聚焦电泳、Edman降解法对其进行了结构确证,并对其体内、外凝血活性进行测定。纯化所得TQ-1纯度98.5%,相对分子质量为30 522.95,SDS-PAGE分析其为一种单链蛋白,等电点为4.5,N末端氨基酸序列为VIGGNECDTNEHRFL。体外凝血活性为900U/mg,小鼠体内凝血试验结果表明：TQ-1凝血活性与阳性对照药巴曲亭相似。TQ-1为一种未见报道的尖吻蝮蛇类凝血酶,具有较高的开发价值。     

尖吻蝮蛇类凝血酶的研究现状

尖吻蝮蛇类凝血酶是我国正在研究的一种新止血药,其结构与以往的类凝血酶完全不同。目前的研究表明,该凝血酶具有良好的止血效果及广阔的临床应用前景。     

尖吻蝮蛇血凝酶在肾移植手术中的应用

<正>注射用尖吻蝮蛇血凝酶(HCA)是从尖吻蝮蛇蛇毒中提取的一种凝血酶。该酶有较好的止血作用,而且不影响血液中的凝血酶原和血小板数量,在正常血管内没有血小板凝聚作用,无血栓形成危险[1]。我院2010年1月至2012年1月对22例肾移植手术患者应用尖吻蝮蛇血凝酶治疗,取得了良好的疗效。现报道如下。临床资料1一般资料随机选取肾移植手术患者22例为HCA组,其中男14例,女8例,年龄28⁵8岁,平均43岁。另选取     

尖吻蝮蛇蛇毒纤溶酶的分离纯化及氨基酸序列测定

目的:从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化出高纯度的纤溶酶并对其进行初步性质研究和氨基酸序列分析。方法:采用DEAE-Sepharose FF离子交换和两次Superdex75PG凝胶过滤,从尖吻蝮蛇蛇毒中纯化出可直接溶解纤维蛋白原的蛋白酶。结果:分离到的纤溶酶相对分子质量为25kD,HPLC分析纯度在97%以上,氨基酸序列分析其N末端为MSTEF QRYME IVVNHS MVKKY NGDSD KIKAW。结论:采用此工艺可从尖吻蛇毒中分离出高比活的纤溶酶,为进一步研究其药理作用奠定了基础。     

一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶对血液活性的研究

目的研究蛇毒类凝血酶Agacutin的止血效果。方法新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察新西兰白兔的血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果。结果静脉注射Agacutin0.01～0.05U·kg-1剂量后,各剂量组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30min药效达高峰,药效持续24h。与给药前比较,各实验组兔血纤维蛋白原含量和血黏度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致。试验结果显示,Agacutin对活化部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性。腹腔注射Agacutin0.5～2.0U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%)。结论Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白和不激活凝血因子Ⅱ和,当有伤口时,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成不溶性纤维蛋白和血栓的形成。所有实验结果显示,Agacutin是一个有效的潜在止血剂。     

大肠癌术前应用尖吻蝮蛇血凝酶的作用及安全性

目的：观察大肠癌患者术前应用尖吻蝮蛇血凝酶的安全性和止血效果。方法40例大肠癌患者（其中结肠癌23例、直肠癌17例）,分为观察组、对照组,每组20例,术前20 min分别予以尖吻蝮蛇血凝酶2 U／100 mL生理盐水静脉滴注及等量生理盐水安慰剂;术前、术后第3天分别记录患者凝血、肝肾功能结果;记录患者术中失血量、术后引流量、拔管时间。结果观察组术中失血量（32.3±11.6）mL、术后引流量（24.9±7.7）mL,对照组术中失血量（58.7．3±15.7）mL、术后引流量（36.3±8.4）mL,两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）;术后两组凝血、肝肾功能比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论大肠癌术前应用尖吻蝮蛇血凝酶可明显降低患者出血倾向,疗效安全、有效。     

尖吻蝮蛇血凝酶N末端序列测定及其止血活性分析

目的:测定尖吻蝮蛇血凝酶N末端氨基酸序列,并对其止血活性进行分析。方法:采用Edm an法测定尖吻蝮蛇血凝酶N末端氨基酸序列,采用毛细管电泳估算其等电点,根据纤维蛋白出现时间和全血凝时间研究其止血活性。结果:尖吻蝮蛇血凝酶N末端氨基酸序列为VIGGNECDTNEEHFL,等电点为6.59,使用后能明显缩短纤维蛋白出现时间和全血凝时间。结论:尖吻蝮蛇血凝酶具有较强的止血活性。     

尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序

目的 测定Agacutin两个相近亚基的N端15个氨基酸残基序列,酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序.方法 通过生物化学方法获得高纯化Agacutin,经SDS-PAGE电泳分离、亚基胶条回收及PVDF膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品,后者通过Edman降解法,测定了亚基N端15个氨基酸残基序列.结果 大亚基(16 kDa)的序列为:DCSSGWSSYEEHQYY,小亚基(15kDa)序列为DSSGWSSYEGHEYYV.结论 测序结果经NCBI数据库检索发现,Agacutin为新的蛇毒类凝血酶.     

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶的纯化及其理化性质研究

目的：从蝮亚科尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom)中分离纯化出无出血活性纤维蛋白溶解酶(Non—hemonrrhagic fibrinolytic enzyme,NHFLE)并对其理化性质进行研究。方法：应用凝胶过滤和离子交换柱层析法分离纯化尖吻蝮蛇毒NHFLE，用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定其相对分子质量，用皮内出血实验测定其出血活性。结果：从短亚科尖吻蝮蛇毒中分离出一种单一组分的纤维蛋白溶解酶，它的相对分子质量为25000，没有出血活性，在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白，相对活性为粗毒的3．2倍。结论：从尖吻蝮蛇毒中分离出相对分子质量为25000的纯化蛋白是具有直接溶解纤维蛋白活性，而无出血活性的单一的纤维蛋白溶解酶。     

尖吻蝮蛇毒类凝血酶在兔体内的药代动力学研究

研究单一组份尖吻蝮蛇毒类凝血酶在兔体内的药动学过程。方法：采用放射性核素示踪动力法和聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合,检测体液中的原形物浓度,药一时数据用３Ｐ８７程序处理。结果：兔静脉注射尖吻蝮蛇毒类凝血酶 ０．５、１、１．５Ｕ／ｋｇ三个剂量后,ｔ１／２α（快分布相半衰期）在 １２．６～ １６． ５ｍｉｎ范围内,ｔ１／２β（慢分布相半衰期）在 １３１．６～１６４．７ｍｉｎ范围内,１／２γ（消除相半衰期）在９８８～１２９２ｍｉｎ范围内。ＡＵＭ_（０→２４ｈ）（药－时曲线下面积）分别为 ２８３３±３１２、５７８０±２７５和１０７０７±１２ｎｇ／ｍｉｎ／ｍｌ比例为１：２：０４：３．７７。结论：兔静脉注射尖吻蝮蛇毒类凝血酶三个剂量后,药一时曲线经拟合符合三房室模型特征,三个时相的半衰期各剂量组之间无显著性差异,ＡＵＣ与剂量成正比,表明药物在克体内的分布和消除为一级线性动力学过程,排泄以肾脏为主。     

尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶的长期毒性及连续给药后药理效应的研究

本文报道尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶对犬及家兔的亚急性毒性及生化药理效应。用药量(μg/kg·d)犬分别为200、65,家兔分别为540、180,连续静脉注射28天。用药后14天及28天,WBC,DC,Hb 含量、肝、臂功能均无明显异差。血浆纤维蛋白原含量明显降低,凝血酶样酶时间及凝血酶时间明显延长,血小板聚集功能明显抑制,高剂量组个别犬血浆尿素氮显著上升(停药2天后降低),实验结束时体重均增加。用药后10天起,个别犬于每天注药后出现短时反应,至3周后消失。病理解剖检查眼肉及镜检未见重要脏器发生病变。本资料提示凝血酶样酶是一低毒高效应制剂,用药2周后对血小板聚集的抑制作用有耐受现象,因此连续用药时间不宜过长。     

基因重组蛇毒纤溶因子rFII理化特性及纤溶能力的研究

[目的]研究重组蛇毒纤溶因子的理化特性和纤溶能力.[方法]SDS-PAGE及高效液相法分析重组蛇毒纤溶因子rFII相对分子质量、纯度,等电聚焦分析其等电点;纤维平板和SDS-PAGE检测重组蛇毒纤溶因子对纤维蛋白及纤维蛋白原的水解能力.[结果]重组蛇毒纤溶因子rFII是一个相对分子质量在28 000,等电点9.0的碱性蛋白酶.它水解纤维蛋白原的Aα、Bβ、γ亚基,水解能力随时间和浓度的增加而增加.它对纤维蛋白的水解能力比相同浓度下的纤溶酶强4倍.[结论]rFII是一种高效的水解纤维蛋白原和纤维蛋白的碱性蛋白酶.     

基因重组蛇毒纤溶因子rFⅡ的酶学特性研究

目的研究重组蛇毒纤溶因子的酶学特性。方法通过SDS-PAGE分析其分子量、纯度,用SDSPAGE方法检测其对纤维蛋白原的水解能力,用分光光度法检测其水解azocasein的能力和PMSF及EDTA对蛇毒纤溶因子的作用。结果蛇毒重组纤溶因子rFII是一个分子量在28000的蛋白酶。它呈时间和浓度依赖性水解纤维蛋白原的Aα、Bβ、γ亚基,EDTA和PMSF均可以抑制该因子水解azocasein的能力。结论rFII是一种纤维蛋白原酶,它的酶活性可同时被EDTA和PMSF所抑制。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样酶的分离、纯化及其生化药理研究

本文报道自尖吻蝮蛇中分离、纯化三个凝血酶样酶(Thrombin-like Enzymes,TLEs),TLE-A,TLE-Ⅵ及TLE-Ⅶ。双向免疫扩散分别出现单一沉淀线,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分别呈单一区带,并依此测定分子量分别为66、31及14KD。试管内TLES能使纤维蛋白原或血浆形成纤维强白微凝块。凝血酶样酶制剂(TLES)150μg/ml效价与牛凝血酶1.0U/ml接近。肝素不能对抗其凝血效应,以对甲苯磺酰精氨酸甲基酯(TAME)为底物,其精氨酸酯酰活力可达2000μmol/min·mg左右。动物在体实验中,犬(n=6)静脉注射100μg/kg后4h药效达高蜂,血浆纤维蛋白原含量明显降低(P<0.02),凝血酶时间明显延长,血浆副凝血试验强阳性,血小板聚集功能明显抑制,家兔(n=10)每日静脉注射300μg/kg连用7天,对血液凝固系统效应与犬相似。药后第8天处死家兔病理解剖无明显变化。小鼠一次静脉注射的LD_(50)及其95％可信限为14.5±2.2(12.3～16.6)mg/kg。     

精制蛇毒酶乳膏制备方法探讨及微量元素含量的测定

目的：探讨精制蛇毒酶乳膏制备方法及对微量元素含量进行分析。方法：对乳膏的稳定性进行实验检测。并用原子吸收分光光度法测定其微量元素Ｚｎ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｕ的含量。结果：精制蛇毒酶乳膏对光和热不稳定。需避光密封贮存。Ｘｎ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｕ含量分别为０．２５９,０．３２６,０．３７２,０．０２５ｕｇ／ｍｌ。结论：混合加热法缺备精制蛇毒酶乳膏成品性能最稳定,便于贮存和应用,微量元素的存在可能促进精制蛇毒酶乳     

五步蛇蛇毒类凝血酶的分离和纯化

用ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析，从五步蛇粗毒中分离纯化出一种促凝组分（类凝血酶），并对其纯度和促凝活性作鉴定。     

蝮蛇抗栓酶对糖尿病氮质血症期的疗效观察

研究蝮蛇抗栓酶（ＳＶＡＴＥ）对糖尿病肾病（ＤＮ）氮质血症期肾功能的影响。方法：将血液流变学异常的ＤＮ氮质血症期患者４２例随机分为２组：常规治疗组，包括糖尿病饮食控制及优质低蛋白饮食；另一组除常规治疗外加用ＳＶＡＥＴ静点，３疗程后比较两组肾功能改变。结果：尿白蛋白、肾小球滤过分数与高切还原粘度、低切还原粘度、纤维蛋白原、胆固醇、甘油三酯呈明显正相关。肾血浆流量上升、肌酐清除率无变化。ＳＶＡＴＥ组的这种相关性较常规治疗组更为明显（Ｐ＜０．００１）。结论：常规治疗基础上加用ＳＶＡＴＥ对ＤＮ氮质血症期患者能改善肾内血流动力学紊乱、减轻并延缓ＤＮ肾衰进展。     

蛇毒多肽和蝎毒多肽对小鼠肝癌移植瘤的抑制作用和Caspase-3表达的影响

目的:检测蛇毒多肽(卡迪,KD)和蝎毒多肽(polypeptide from Buthus martensii venom,PBMV)对肝癌移植瘤(H22)带瘤小鼠瘤重的抑制作用,并观察肿瘤细胞Caspase-3表达,初步探讨其作用机理.方法:昆明种系近交小白鼠,60只,复制肝癌移植瘤模型,随机分为6组:阴性对照组(生理盐水),阳性对照组(环磷酰胺0.010 mg/mL),KD 0.016、0.010 mg/mL组和PBMV 0.016、0.010 mg/mL组,分别注射KD、PBMV和阳性药物10 d后,分析统计带瘤小鼠的体重变化、脾指数和肿瘤生长抑制率;并采用免疫组织化学方法,观察治疗后Caspase-3表达的改变.结果:KD 0.016、0.010 mg/mL组和PBMV 0.016、0.010 mg/mL组的平均瘤重显著地减小,均具有明显的肿瘤生长抑制率,与阴性对照组相比有显著差异(P＜0.05),而与阳性对照组相比没有显著差别(P＞0.05).免疫组化显示:阴性对照组胞浆无着色或着色很浅;阳性对照组胞浆浅红棕色,着色胞浆分布较集中;两组待测组胞浆均显红棕色,分布面积广,而且随着用药浓度的增加而增多.结论:KD和PBMV对H22生长和增殖具有抑制作用,其抑制作用的机制可能是通过增强Caspase-3蛋白的表达而促使肿瘤细胞的凋亡.     

中华眼镜蛇毒组份M抑制血小板聚集作用机制初探

探讨中华眼镜蛇毒组份Ｍ抑制血小板聚集作用机制;方法：运用卵磷脂法、剩余可凝纤维蛋白原法、纤维蛋白平板法等分别测定了中华眼镜蛇毒组份Ｍ中磷脂酶Ａ_２（ＰＬＡ_２）,纤维蛋白原溶解酶及纤维蛋白溶解等与血小板聚集相关的酶活性,并运用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析了组份Ｍ对血小板内细胞骨架蛋白的影响;结果：组份 Ｍ不含 ＰＬＡ_２活性,无纤维蛋白（原）溶解酶活性,亦无ＡＤＰ酶和 ５’－核苷酸酶活性,不影响正常人血浆乳酸脱氢酶的含量,但对ＡＤＰ诱导的血小板细胞内肌动蛋白微丝聚合物的形成有明显抑制作用;结论：中华眼镜蛇毒组份Ｍ对血小板聚集所依赖的血小板内细胞骨架系统的功能有抑制作用。