人CD226分子胞膜外区D1和D2真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 构建含有人CD226分子胞膜外区结构域1(D1)和结构域2(D2)的真核表达载体,表达并纯化重组蛋白.方法用特异性引物分别扩增CD226 D1和D2的基因,定向插入真核表达载体pSecTag2B-Fc,进行酶切和DNA测序鉴定,重组质粒瞬时转染293T细胞,收集上清,纯化蛋白及SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果利用PCR方法克隆出CD226胞膜外区D1和D2的基因,并正确插入pSecTag2B-Fc载体中,真核表达载体瞬时转染293T细胞,Western blot结果证实转染293T细胞的培养上清液中含有hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc融合蛋白,培养上清经亲和层析柱纯化,可获得较高纯度的重组蛋白.结论 成功的构建了分泌型融合蛋白hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc真核表达载体,获得纯度较高的融合蛋白,为进一步探讨其配受体的相互作用机制奠定了基础.     

9.1C3/LAIR-1的真核表达、纯化及单克隆抗体的制备和鉴定

目的 表达并纯化9.1C3/LAIR-1胞膜外区与人IgCl Fc段的融合蛋白，轩针对9.1C3/LAIR-1胞膜外区的单克隆抗体（mAb)。方法 构建真核表达载体pIg/3C-9.1C3/LAIR-1,表达并纯化9.1C3/LAIR-1－Fe融合蛋白。以9.1C3/LAIR-1－Fc融合蛋白免疫BALB／c小鼠，制备。以间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性，以竞争结合实验鉴定mAb识别LAIR－1的表位。结果表达并经9.1C3/LAIR-1－hIgFc融合蛋白，以其免疫BALB／c小鼠，获得1株针对9.1C3/LAIR-1胞膜外区的mAb 4H7。4H7对HL－60细胞和经9.1C3/LAIR-1 cDNA转染的COS7 的表位识别，与已报道的抗9.1C3 mAb体不同。 结论 成功地构建了9.1C3/LAIR-1胞膜外区基因的真核表达载体，并表达纯化了9.1C3/LAIR-1－hIgFc融合蛋白。获得一株针对9.1C3/LAIR-12胞膜外区的mAb，为进一步研究9.1C3/LAIR-1分子的2结构和功能提供了新的手段。     

CD326分子胞外区表皮生长因子样结构域融合蛋白的表达与纯化

目的:构建含有CD326分子胞膜外区EGF-like 1、EGF-like 2以及EGF-like1+2结构域的真核表达载体,在COS7细胞中表达相应蛋白并纯化。方法:用PCR扩增编码EGF-like 1、EGF-like 2以及EGF-like 1+2结构域的cDNA,插入真核表达载体pSecTag2B,脂质体法转染COS-7细胞,利用重组蛋白C端的组氨酸标签(6×His-tag)进行金属螯合亲和层析纯化,最后用SDS-PAGE和Western blot法检测纯化的包含EGF-like 1、EGF-like 2以及EGF-like 1+2结构域融合蛋白的纯度。结果:序列测定的结果显示含有CD326分子胞膜外区EGF-like 1、EGF-like 2以及EGF-like 1+2结构域序列的载体构建正确。经Ni2+-NTA树脂柱亲和层析纯化得到3种融合蛋白,相对分子质量(Mr)分别约为3 600,7 700和12 000。纯度均约为95%。Western blot检测结果显示3种融合蛋白都具有下游的c-myc表位。结论:成功构建了含有CD326分子胞外区EGF-like 1、EGF-like 2以及EGF-like 1+2结构域的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达。为制备抗CD326分子不同结构域的单克隆抗体提供了免疫原。     

人CD112(Nectin2/PRR2)单克隆抗体的制备和鉴定

目的：表达和纯化CD112 胞膜外区重组蛋白, 制备针对CD112胞膜外区的单克隆抗体（mAb）, 并且研究CD112的分布.方法：采用基因重组技术在真核系统表达CD112-Fc融合蛋白, 亲和层析法进行蛋白纯化;纯化的CD112-Fc融合蛋白免疫BALB/c小鼠, 杂交瘤技术建立分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 间接ELISA、 Western blot及FCM鉴定mAb 的特异性.用流式细胞术（FCM）检测 CD112 的细胞系分布.结果：构建了高效真核表达载体pIg3C-CD112, 表达并纯化了CD112-Fc融合蛋白, 其纯度大于 90%.以纯化重组蛋白为免疫原共制备9株分泌抗CD112 mAb的杂交瘤细胞株（命名为FMU-CD112.1 ～FMU-CD112.9）, 制备腹水并纯化 mAb.FMU-CD112.1、 3、 6和8能用于Western blot, FMU-CD112.1、 4、 6和8可用于 FCM.CD112细胞分布检测显示该分子主要分布在正常上皮及内皮细胞系、巨核细胞谱系和部分T细胞系, 并高表达于上皮及内皮来源的肿瘤、胶质瘤等细胞系.结论：成功地表达纯化了CD112-Fc融合蛋白并建立了稳定分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 为CD112的功能研究打下坚实的基础.     

兔抗mLAIR-1胞外区抗体的制备、纯化和鉴定

目的:表达并纯化小鼠白细胞相关免疫球蛋白样受体-1(mLAIR-1)胞膜外区与人IgGFc段的融合蛋白,制备兔抗mLAIR-1胞膜外区的抗体。方法:构建真核表达载体,表达并纯化mLAIR-1-Fc融合蛋白。以mLAIR-1-Fc融合蛋白免疫家兔,用偶联mLAIR-1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化多克隆抗体。用间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定多克隆抗体的特异性。结果:表达并纯化了mLAIR-1-hIgFc融合蛋白。以其免疫家兔,用亲和层析的方法纯化得到兔抗mLAIR-1胞膜外区的抗体,能与转染细胞和细胞表面天然mLAIR-1分子结合。结论:成功地构建了mLAIR-1胞膜外区基因的真核表达载体,表达并纯化了mLAIR-1-Fc融合蛋白。用偶联mLAIR-1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化的兔抗mLAIR-1胞外区抗体,具有高特异性和高效价,为进一步研究mLAIR-1分子的结构和功能提供了新的手段。     

人CD226(PTA1)分子胞膜外区的原核表达、复性及免疫反应性的鉴定

目的　构建人CD2 2 6 (PTA1)分子胞膜外区的原核表达载体 ,并进行原核表达和复性 ,为该分子的X线结晶衍射及功能学研究提供充足的蛋白来源。方法　将人CD2 2 6分子的胞膜外区基因克隆入原核表达载体pBV2 2 0 ,测序证实后 ,转化宿主菌MC10 6 1 P3并进行温度诱导表达。产物采用稀释加透析法复性 ,亲和层析柱纯化 ,并通过Westernblot和ELISA对其复性效果进行鉴定。结果　温度诱导 7h ,目的蛋白的表达量达宿主菌总蛋白量的 2 3.8% ,其相对分子质量为 30× 10 3,Westernblot及ELISA证实其重折叠和复性是成功的。结论　成功地获得了人CD2 2 6 (PTA1)分子胞膜外区的原核表达产物 ,可用于该分子X线结晶衍射及功能学实验     

人CD40-Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达与纯化研究

目的 建立稳定表达CD40－Ig融合蛋白的工程细胞株,获得大量融合蛋白以研究靶向阻断CD40：CD40L途径防治移植物抗宿主病（GVHD）策略的应用潜力。方法 自真核瞬时表达载体pIG／40Ig中切下CD40－Fc融合基因,插入pcDNA3．1载体中构建稳定表达载体。利用脂质体Lipo-fectamine将该载体转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆;夹心ELISA法检测上清中CD40－Ig融合蛋白的表达;Westem blot法鉴定其免疫学活性。利用有限稀释法对筛选出的混合克隆单克隆化。滚瓶法无血清大批培养工程细胞,ProteinA亲和层析法纯化,SDS－PAGE后薄层扫描分析纯度。利用流式细胞术检测该蛋白与Jurkat细胞表面CD40L的结合功能。结果 CD40－Fc融合基因插入pcDNA3．1载体后构建成功稳定表达载体p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为B2。ProteinA亲和层析纯化融合蛋白纯度达95％以上,该融合蛋白可特异结合Jukat细胞表面的CD40L。结论 CD40－Ig融合蛋白可模仿天然分子与其配基结合,为研究靶向CD40：CD40L途径的治疗制剂在防治GVHD中的潜在应用提供了有用的工具。     

VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及鉴定

目的: 构建人血管内皮细胞生长因子II型受体(VEGFR2)胞膜外区第三及第四个免疫球蛋白样结构域与GST融合蛋白VEGFR2 D3.4/GST基因的原核表达载体, 在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白.方法: 由公司合成VEGFR2胞膜外区第三、第四免疫球蛋白样结构域氨基酸的编码序列, 克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游, 构建重组表达载体pGEX4T-VEGFR2D3.4, 将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS, IPTG诱导表达VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白, 经不同浓度尿素洗脱纯化后, 表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果: SDS-PAGE分析表明, 表达产物的相对分子质量(Mr)为46 000, 与理论值相符, 主要以包含体形式存在; 灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38.6%, 纯化产物纯度最高为87.1%, Western blot 证实该蛋白为VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白.结论: 利用大肠杆菌表达系统, 获得了较高纯度的包含体形式VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白.     

CD40突变体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人muCD40胞外段基因序列,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1恒定区基因,分别插入真核表达载体pIRES2-EGFP,采用Superfectin转染CHO细胞,G418筛选出能稳定分泌muCD40Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆。筛选出的阳性克隆经无血清培养后,收集上清进行Western blot检测;并收集细胞进行RT-PCR鉴定,同时用流式细胞仪分析muCD40Ig蛋白与CD40L的结合能力。结果:成功构建了人pIRES2-EGFP/muCD40Ig重组真核表达载体,PCR及Western blot结果显示该CHO基因转染细胞能够稳定分泌人muCD40Ig蛋白;流式检测muCD40Ig融合蛋白能够与CD40L分子结合。结论:获得了能稳定分泌人muCD40Ig的CHO基因转染细胞株,muCD40Ig融合蛋白具有与CD40L结合的能力。     

人OX40-Fc分子的构建、真核表达及活性研究

目的构建人OX40-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人OX40-Fc融合蛋白。方法从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法扩增OX40膜外区cDNA编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，进行酶切并与人IgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，采用脂质体法稳定转染COS-7细胞，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与Western blotting进行鉴定。检测其对活化后Jurkat细胞增殖的抑制活性。结果测序证实构建的OX40膜外区与OX40-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实OX40-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与Western blotting证实其为OX40-Fc蛋白。增殖实验证明其对活化后的Jurkat细胞有抑制增殖作用。结论成功构建了人OX40-Fc真核表达载体，并使有生物学活性的OX40-Fc融合蛋白在COS-7细胞上获得了稳定表达。为进一步研究该蛋白在自身免疫性疾病治疗中的作用及调节免疫自稳机制中的地位奠定了基础。     

hdll1ext-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人dlll^ext(human delta-likel extraeellular region)-Fe融合蛋白的真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc，并在COS-7细胞中进行表达。方法：从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta-likel胞外段，通过DNA重组构建真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fe。瞬时转染COS-7细胞，应用RT-PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc。以重组载体转染COS-7细胞后，RT-PCR结果显示delta-likel胞外段与IgG1 Fe在mRNA水平正确拼接；细胞免疫荧光染色呈阳性反应；夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地扩增了人delta-likel胞外段，构建了pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc真核表达载体，并在COS-7细胞中获得表达，为下一步研究奠定了基础。     

hdll1~(ext)-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 :构建人dll1ext(humandelta like1extracellularregion) Fc融合蛋白的真核表达载体pEF BOSneo hdll1ext Fc,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta like1胞外段 ,通过DNA重组构建真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。瞬时转染COS 7细胞 ,应用RT PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA ,检测融合蛋白的表达。结果 :成功地构建了真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。以重组载体转染COS 7细胞后 ,RT PCR结果显示delta like1胞外段与IgG1Fc在mRNA水平正确拼接 ;细胞免疫荧光染色呈阳性反应 ;夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论 :成功地扩增了人delta like1胞外段 ,构建了 pEF BOSneo hdll1ext Fc真核表达载体 ,并在COS 7细胞中获得表达 ,为下一步研究奠定了基础     

人KIR2DL1-Ig融合蛋白在COS-7细胞的表达

目的：获得人KIR2DL1分子(killer lg—like receptor 2DL1)胞外区与人IgG Fc段的融合蛋白。方法：从人外周血单个核细胞中提取总RNA，通过RT—PCR扩增编码KIR2DL1胞外段cDNA，经Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后，定向插入真核细胞表达载体CD51negl中。构建的重组真核表达载体CD51negl—KIR2DL1。经酶切分析和测序鉴定后，通过DEAE—dextran／ehloroquine法转染COS—7细胞：瞬时表达后，取培养上清液经亲和层析、ELISA、SDS—PAGE及Western印迹，鉴定融合蛋白的表达及其免疫学活性。结果：序列测定证实，该重组表达载体含有正确的KIR2DL1胞外区基因序列。重组真核表达载体CD5lnegl—KIR2DL1转染COS—7细胞后，ELISA法检测细胞培养上清中有融合蛋白的表达。SDS—PAGE结果显示，该融合蛋白的相对分子质量(Mc)约为73000。Western印迹结果证实，该蛋白能被特异性单克隆抗体(mAb)EB6所识别。结论：KIR2DL1—Ig融合蛋白表达载体成功构建并在COS—7细胞中获得功能性表达，为KIR2DL1的功能及其配体MHC的研究奠定了基础。     

抗人B细胞淋巴瘤DNA疫苗的构建

目的 :探讨人B细胞淋巴瘤活检组织中肿瘤细胞膜表面免疫球蛋白VH(smIgVH)基因片段能否在动物体内激发特异性抗独特型抗体。方法 :以RT PCR法获得IgVH 基因片段 ,以小鼠单核细胞趋化因子 (MCP 3)基因作为佐剂分子 ,进行重组PCR获得MCP 3和VH 基因片段的融合基因 ,克隆在真核表达载体 pcDNA3.1中 ,构建DNA疫苗质粒 pcDNA/MCP BVH。通过脂质体转染验证该质粒在真核细胞COS 7中的表达。结果 :通过上述方法获得了以活检组织肿瘤细胞mIgVH区基因片段 ;成功地构建了DNA疫苗质粒 pcDNA/MCP BVH。体外瞬时转染实验证明 ,该质粒能够在真核细胞COS 7中正确表达。结论 :成功地构建重组表达质粒 pcDNA/MCPBVH,在体外能够正确表达 ,为进一步研制抗B细胞淋巴瘤基因疫苗奠定了基础     

mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白.方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实.从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体.脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定.3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用.结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖.结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础.     

Cloning and expression of human TNFR (P55)-IgG Fc fusion protein in eukaryotic cells]

OBJECTIVE: To express soluble biologically active TNF receptor protein in eukaryotic cells, which can inhibit cytotoxic activity of TNF. METHODS: PCR amplified the extra-cellular region of TNF receptor P55 and IgG Fc gene. Then the two were linked through an oligomer encoding a thrombin-sensitive peptide linker and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+). The eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1/TI was then transfected to the mammalian cell line COS7 and BHK. Using the G418 system, BHK cell clones were selected and can continuously secrete biological protein in large amount. RESULTS: The expressed protein was fused with IgG Fc and secreted into the cell culture supernatant. It has good antigenicity and binding ability to TNF. It can also inhibit the cytotoxic activity of TNF on L929 cell. CONCLUSION: The TNFR-IgG Fc fusion protein expressed in eukaryotic cells has biological activities of human TNF receptor P55.     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。