人骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

目的：探讨应用壳聚糖支架三维立体培养人骨髓基质干细胞(mesenchvmal stem cells，MSCs)，体外诱导其分化成为软骨细胞的可行性。方法：实验于2004—02／11在中山大学附属第三医院中心实验室完成。相分离法制备三维多孔壳聚糖支架，检测支架的孔隙率、孔径。抽取人骨髓，密度梯度离心法分离纯化，体外培养扩增。将第3代MSCs复合于支架中培养，应用无血清诱导液诱导细胞向软骨细胞分化，通过组织学染色及扫描电镜观察细胞的形态、增殖及功能的改变。结果：通过相分离法可制备出高孔隙率的三维壳聚糖支架，孔隙率达86．5％，孔隙分布均匀且相互连通，平均孔径182μm。诱导分化的MSCs在支架中贴附良好，呈现典型的软骨细胞形态，并有细胞外基质分泌：结论：人MSCs在三维立体培养环境下可诱导分化为软骨细胞，作为种子细胞在组织工程软骨的构建及软骨损伤的修复中有良好的应用价值。     

壳聚糖和软骨细胞外基质复合组织工程骺软骨支架的性能观察

背景:在组织工程骺软骨构建过程中,采用何种载体承载已经扩增了的软骨细胞越来越受到人们的关注.目的:探讨软骨细胞外基质与壳聚糖复合构建组织工程骺软骨支架的可行性并对其性能进行初步观察.设计、时间及地点:体外观察实验,于2007-12/2009-03在解放军总医院骨科研究所完成.材料:壳聚糖(脱乙酰度90%,Mr10×105)由青岛海汇生物工程公司提供.市售猪关节软骨.方法:将新鲜的猪关节软骨在液体中粉碎,梯度离心后制备成3%软骨微丝悬液,将其按1∶1的比例与2%的壳聚糖溶液混合,采用冷冻冻干法制备脱细胞软骨基质三维多孔支架.主要观察指标:对梯度乙醇处理再次干燥后支架材料进行组织学及扫描电镜观察,测定支架孔径和孔隙率、吸水率,并采用MTT法分析支架浸提液毒性.分离培养兔骨髓间充质干细胞,用转化生长因子β 1成软骨诱导后种植至支架,倒置显微镜、电镜观察细胞在支架上的生长、分化情况.结果:支架内孔洞相互连通,孔大小(161±31)μm,孔隙率为(90.1±1.6)%,吸水率为(2 361±132)%.组织学观察显示,三维多孔支架甲苯胺蓝染色、番红O染色、Ⅱ犁胶原免疫组织化学染色均呈阳性.MTT法结果显示支架无细胞毒性.细胞在支架表面黏附良好,分布均匀,并有基质分泌.结论;制备的软骨细胞外基质和壳聚糖复合三维多孔支架结合良好,含有软骨细胞外基质主要成分,无毒,具备合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好.     

骨髓间充质干细胞出现软骨细胞表型后与壳聚糖/胶原三维多孔支架的复合培养

背景：体外单层诱导骨髓问充质干细胞转化为软骨细胞后，但仍存在难以长期扩增培养，容易出现去极化的现象。 目的：观察体外诱导骨髓间充质干细胞出现软骨细胞表型后，在自制复合壳聚糖，胶原三维多孔支架上构建组织工程化软骨的特点。 设计、时间及地点：以细胞为对象的单一样本观察，于2006—12／2007—09在首都医科大学细胞与遗传实验室完成。 材料：1岁龄骨骼成熟的健康绵羊。雌雄不拘，体质量20～30kg。 方法：采用密度梯度离心法分离羊骨髓间充质干细胞，体外培养至第3代时，实验组以特定诱导液培养2周，以未经诱导培养的细胞为对照，两组均接种于自制的壳聚糖／胶原三维多孔支架中。 主要观察指标：在相差显微镜和扫描电镜下观察细胞形态、增殖和功能改变情况，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定形成软骨组织的特征。 结果：壳聚糖/胶原接种细胞悬液后，细胞迅速扩散到支架孔隙内，分布均匀，不易脱落，有较好的亲水性和黏附性。实验组细胞在三维立体诱导培养环境中，一直成球状聚集生长，生长旺盛，2周时肉眼即可隐约看见支架孔隙内的细胞团块，4周时则更加明显，甚至向支架表面外向生长。组织学检查发现诱导分化后的细胞分泌大量的细胞外基质，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性说明分泌的细胞外基质中含有软骨组织特有的Ⅱ型胶原，形成类似于正常软骨组织的组织工程化软骨。结论：在壳聚糖肢原三维立体诱导培养环境中，骨髓间充质干细胞能够很好的转化为软骨细胞，保持表型不变，继续增殖、代谢以及分泌细胞外基质，形成软骨组织。     

软骨细胞复合胶原/壳聚槲/β-磷酸三钙层状梯度修复体的体外培养

背景:关节软骨缺损的修复涉及到软骨和软骨下骨的双重修复,需要将骨与软骨组织工程结合起来,构建骨软骨双层支架,或者在同一支架上构建组织工程化骨软骨.目的:观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响,评价其作为关节软骨工程支架的可行性.时间及地点:体外细胞学实验,于2007-12/2008-06在广东省构建与榆测实验室进行.材料:以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架,上层以胶原/壳聚糖为主,下层以胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙为主,孔隙率≥90%,孔径100 μm.方法:体外培养新西兰大白兔软骨细胞并成骨诱导3周,使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养3周.主要观察指标:通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响.结果:修复体/细胞体外培养3周,修复体上细胞数量明显增多,并分泌细胞基质,包裹在软骨细胞周围,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性.结论:胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的细胞相容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料.     

纳米羟基磷灰石／壳聚糖支架与诱导骨髓间充质干细胞体外构建软骨支架复合体

背景:国内外许多研究通过不同的构建方法构建组织工程化软骨支架复合体修复骨软骨联合缺损,且取得了一定的进展,但目前各种方法存在的问题突出表现为组织工程化的软骨和骨组织之间的界面、移植体和宿丰骨和软骨之间的界面耦合不够理想.目的:将体外提纯、扩增的骨髓间充质下细胞诱导成软骨细胞.将其接种于穿"靴"的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架的底部上联合培养,探索其用于组织工程软骨复合体的可行性.设计、时间及地点:细胞和材料复合的体外观察实验,于2008-03/07在暨南大学附属第一医院中心实验室和暨南大学理工学院材料系实验室完成.材聿斗:通过原位复合和冷冻干燥结合的方法制各纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架.健康新西兰兔10只由广东省医学实验动物中心提供.方法:密度梯度离心法提取分离骨髓间充质干细胞,软骨诱导液诱导骨髓闻充质干细胞2周后甲苯胺蓝染色检测.把诱导得到的软骨细胞接种于穿"靴"的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架的底部,将细胞-支架复合物置入成软骨条件培养液中培养2周.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态特征,鉴定CD29,CD44,CD34和CD45抗原的表达,观察细胞生长特性,测定细胞活力和生长周期,扫描电镜观察纳米羟摹磷灰石/壳聚糖史架结构和细胞与支架的复合情况.结果:骨髓间充质干细胞可在体外分离扩增,表达CD29和CD44,不表达CD34和CD45,细胞活力为95.27%,G0～G1期细胞占94.68%.经软骨诱导液诱导后骨髓问充质十细胞转化成软骨细胞;制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔支架孔隙率为90%,平均孔径为150μm,与软骨细胞有较好的黏附性.结论:初步证实纳米羟基磷灰石,壳聚糖支架与骨髓间充质干细胞诱导成的软骨细胞复合可以在体外构建组织工程软骨复合体.     

软骨细胞复合胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的体外培养

背景：关节软骨缺损的修复涉及到软骨和软骨下骨的双重修复,需要将骨与软骨组织工程结合起来,构建骨软骨双层支架,或者在同一支架上构建组织工程化骨软骨。目的：观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响,评价其作为关节软骨工程支架的可行性。时间及地点：体外细胞学实验,于2007-12/2008-06在广东省构建与检测实验室进行。材料：以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架,上层以胶原/壳聚糖为主,下层以胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙为主,孔隙率≥90%,孔径100μm。方法：体外培养新西兰大白兔软骨细胞并成骨诱导3周,使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养3周。主要观察指标：通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。结果：修复体/细胞体外培养3周,修复体上细胞数量明显增多,并分泌细胞基质,包裹在软骨细胞周围,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。结论：胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的细胞相容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料。     

兔骨髓间充质干细胞与异体脱细胞耳软骨支架的体外复合

背景：耳软骨作为脱细胞基质可选择的支架,进行脱细胞处理可去除了软骨细胞的抗原性,从而与种子细胞具有良好的相容性。目的：体外提取、培养兔骨髓基质干细胞,并与异体脱细胞耳软骨支架复合,观察其生物相容性。方法：提取兔骨髓间充质干细胞行体外培养,诱导为软骨细胞,以胰蛋白酶-曲拉通联合法获得脱细胞软骨支架,将两者于体外复合,10d后复合支架固定行组织学染色及扫描电镜观察。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞体外诱导14d可形成软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学示胞浆呈棕黄色;兔耳软骨脱细胞基质呈乳白色,组织学染色及扫描电镜观察示经脱细胞后支架孔隙均匀,结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分。其孔径长度（33.70±4.33）μm,孔隙率（65.23±7.35）%。复合支架组织学染色及扫描电镜示两者黏附良好,并伴有多量基质分泌。说明兔骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞与异体脱细胞耳软骨有良好的生物相容性。     

骨髓间质干细胞体外分化软骨细胞的实验研究

目的：应用转化型生长因子TGF-β1，体外诱导骨髓间质干细胞（MSCs）向成软骨细胞表型分化，探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法：由大鼠骨髓中分离出MSCs，体外传代培养，取第3代细胞通过TGF-β1、地塞米松和维生素C诱导向软骨细胞分化。诱导后14d观察细胞形态变化，进行阿辛蓝染色检测软骨基质的分泌、免疫组化检测细胞Ⅱ型胶原的表达。采用Western-blot和RT-PCR检测诱导前后成软骨相关的SOX9、蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的表达。结果：诱导后阿辛蓝染色示糖胺聚糖均匀分布于基质中，免疫组化染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性。RT-PCR检测示成软骨相关的SOX9、蛋白聚糖、Ⅱ型腔原mRNA表达阳性。Western-blot印迹检测示细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性。结论：MSCs在特定培养液的诱导下可向软骨细胞表型分化．并能分泌软骨细胞特异性基质．可成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。     

细胞传代对骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化的影响

目的：观察在成软骨诱导培养条件下，细胞传代对骨髓问充质干细胞(MSCs)体外成软骨能力的影响。方法：不同代MSCs成软骨诱导后，观察细胞生物学特性以及通过免疫荧光、RT-PCR测定特异性软骨细胞外基质aggrecan的表达情况。结果：经成软骨诱导后，第2、4代MSCs表达aggrecan明显较第6、8代细胞高。结论：MSCs很可能由多种形态功能接近，分化潜能有略有差异的细胞组成；在成软骨诱导培养条件下，对此传代后成软骨能力减弱。     

藻酸钠微球中骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景:传统的体外诱导干细胞向软骨细胞定向分化的方法有高密度细胞团块培养和平面培养.细胞团块诱导方式培养过程易损害细胞活性,而平面培养获得的细胞数量有限.目的:观察藻酸钠微球中骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化潜力,及其在壳聚糖复合支架上的生长情况.设计、时间及地点:对比观察实验.于2007-03/10在武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室完成.材料:SPF级1月龄雄性Wistar大鼠7只.壳聚糖复合支架材料由武汉大学资源与环境学院研制.藻酸钠盐、转化生长因子β3、胰岛素样生长因子I均为Sigma公司产品.方法:取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,体外扩增培养骨髓间充质干细胞.实验组用转化生长因子β3和胰岛素样生长因子I联合定向诱导藻酸钠微球包被的骨髓间充质干细胞3周,对照组培养条件中无转化生长因子β3和胰岛素样生长因子I.诱导3周后,免疫组织化学方法和反转录-聚合酶链反应法检测ii型胶原蛋白和aggrecan的表达.从微球中释放诱导的软骨细胞并接种于壳聚糖复合支架.扫描电镜观察其生长情况.主要观察指标:软骨特异性的Ⅱ型胶原、aggrecan的表达以及软骨细胞的三维形态.结果:实验组藻酸钠微球中的骨髓间充质干细胞表达的Il型胶原和aggrecan明显高于对照组(P<0.05),与原代软骨细胞比较差异无显著性意义(P>0.05).壳聚糖复合支架支持分化软骨细胞的贴壁、伸展、增殖和迁徙,并呈典型的软骨细胞生长形态.结论:转化生长因子β3和胰岛素样生长因子I能诱导藻酸钠微球中的骨髓间充质干细胞定向分化成软骨细胞,并与壳聚糖复合支架表现出良好的组织相容性.