人骨膜成骨细胞培养及初步观察

以青年男性股骨骨膜为材料，采用植块组织培养技术，在ＤＭＥＭ／Ｆ１２加１５％灭活小牛血清培养基中，建立了人成骨细胞体外培养模型，追踪观察了成骨细胞在体外培养５０天中的形态变化，并通过碱性磷酸酶染色技术，对培养２０天的原代细胞超微结构进行了酶细胞化学。结果显示：（１）成骨细胞为成纤维细胞型，细胞贴壁生；（２）培养４天，细胞开始生长呈梭形，胞核为椭圆形，有２－３年核仁；１０天后细胞融合成片生长，细胞间分     

成人骨髓成骨细胞体外培养

目的　研究成人骨髓基质干细胞在体外培养条件下的成骨能力及生物学特性 ,探讨简便易行的成人成骨细胞体外培养方法 ,为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法　因诊断需要抽取健康成人骨髓组织 ,在含体积分数为 10 %胎牛血清的DMEM培养基中 ,置于 37℃、含体积分数为 5 %的CO2 湿化空气孵箱中培养 ,传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养 ,用倒置相差显微镜观察、HE染色、扫描与透射电镜观察增殖和分化情况 ,并测定培养细胞的生长曲线 (MTT法 )、碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力。结果　采用本法在体外培养的成人成骨细胞生长良好 ,生化指标稳定 ,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。结论　本实验方法取材方便 ,所培养的细胞具有成骨细胞的特性 ,可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法     

骨膜成骨细胞的分离培养及其成骨作用的放射自显影研究

取４只家兔胫前骨膜进行成骨细胞分离培养，用３Ｈ－ＴｄＲ标记，然后回植于同一供体的皮下、耳软骨缺损处及挠骨缺损处。分别在２周和４周后处死动物，原位取材，用放射自显影方法观察种植细胞的转归。结果表明，种植的细胞在皮下转化为类骨组织；在软骨缺损处转化为软骨组织；而在骨缺损处则转化为典型的骨组织。提示用骨膜分离培养成骨细胞，回植体内，有可能用于骨缺损和软骨缺损的修复。     

骨膜成骨细胞分离培养及其BMP—2cDNA基因转染的初步研究

为骨膜成骨细胞作为骨缺损和骨坏死基因治疗中的治疗性细胞提供依据。     

成人骨髓成骨细胞体外培养

目的 研究成人骨髓基质干细胞在体外培养条件下的成骨能力及生物学特性，探讨简便易行的成人成骨细胞体外培养方法，为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法 因诊断需要抽取健康成人骨髓组织，在含体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、含体积分数为5％的CO2湿化空气孵箱中培养，传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养，用倒置相差显微镜观察、HE染色、扫描与透射电镜观察增殖和分化情况，并测定培养细胞的生长曲线(MTT法)、碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力。结果 采用本法在体外培养的成人成骨细胞生长良好，生化指标稳定，表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。结论 本实验方法取材方便，所培养的细胞具有成骨细胞的特性，可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

骨膜成骨细胞修复骨缺损的实验研究

为了进一步验证骨膜成骨细胞培养建立“成骨细胞库”用于修复骨缺损的可能性，取８只家兔胫前骨膜进行成骨细胞分离培养，体外繁殖后，以明胶海绵为载体，回植于自体的桡骨缺损部。对侧以明胶海绵吸附Ｈａｎｋｓ液为对照。分别在细胞植入后第２，４，８和１２周拍摄Ｘ线片，按Ｌａｎｅ方法计分，评价其骨缺损修复愈合的能力。结果表明，植入的成骨细胞因自身的成骨能力而促进骨缺损的愈合。提示自体“成骨细胞库”的建立和移植在骨缺损的修复中是一种可以继续探索的方法     

骨膜成骨细胞分离培养及其BMP－2cDNA基因转染的初步研究

目的：为骨膜成骨细胞作为骨缺损和骨坏死基因治疗中的治疗性细胞提供依据。方法：兔胫骨骨膜分离培养其成骨细胞。利用脂质体转染技术把荧光素酶基因和ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ基因转入骨膜成骨细胞内，观察其导入基因表达情况。结果：荧光素酶基因和ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ基因均可以在成骨细胞内表达，结论：培养的骨膜成骨细胞可以作为受体细胞用于骨缺损和骨坏死的基因治疗。     

培养骨组织及成骨细胞的生物力学研究概况

培养骨组织及成骨细胞的生物力学研究概况中国中医研究院骨伤科研究所（北京１００７００）李可心，尚天裕审校骨组织培养技术在本世纪二、三十年代被发明并使生理应力对骨组织的影响研究得到发展。Ｇｌｕｃｋｓｍａｎｎ［１］指出：许多复杂的生理因素在组织培养中可被去...     

兔骨膜成骨细胞与肾血管内皮细胞间接共培养的体外实验研究

目的　探讨兔骨膜成骨细胞 (RPOB)和肾血管内皮细胞 (RRVEC)不同比例下间接共培养对成骨细胞增殖及功能的影响 ,优选细胞间接共培养的适宜比例。方法　取 RPOB和 RRVEC,采用细胞嵌盒培养系统 ,对照组、试验 1、2、3组分别以 RPOB和 RRVEC按 1∶ 0、2∶ 1、1∶ 1和 1∶ 2间接共培养 4天。通过细胞计数、碱性磷酸酶 (AL P)活性测定及 3H-脯氨酸掺入试验观察 RPOB和 RRVCE增殖分化能力及功能状态。结果　试验 1组 RPOB较对照组、试验2、3组增殖活跃 (P<0 .0 5 ) ,且 3H-脯氨酸掺入较高 (P<0 .0 5 ) ;试验 1组 AL P活性较对照组和试验 3组高 (P<0 .0 5 ) ,但与试验 2组无显著差异 (P>0 .0 5 )。结论　 RPOB和 RRVEC以 2∶ 1进行间接共培养时 RPOB增殖能力强、功能活跃 ,适宜进一步组织工程研究     

成骨因子BMP7在骨膜细胞体外培养中的作用

目的 探讨成骨因子骨形态发生蛋白(BMP7)在骨膜细胞体外培养中的诱导分化作用.方法取材于成人胫骨骨膜,常规细胞培养法行骨膜细胞体外培养,分为实验组和对照组,分别加入BMP7加成骨细胞培养辅助剂和单纯成骨细胞培养辅助剂,相差显微镜观察骨膜细胞形态特征.每组分别在第5、10、15、20天设3个样本,采用ALP试剂盒法及钙结节Von Kossa染色法分别检测成骨细胞特异性标志物ALP和钙结节的表达情况.结果 骨膜细胞在体外生长良好,实验组和对照组形成的成骨细胞增殖良好,形态一致.细胞早期呈梭形,饱满透明,立体感强;分裂期呈立方形或短柱状;后期由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形.由BMP7诱导的骨膜细胞的成骨标志物ALP和钙结节染色阳性率明显高于对照组,有统计学意义(P＜0.01).结论 骨膜细胞具有良好的成骨和再生能力,BMP7在体外培养中具有明显增强骨膜细胞分化为成骨细胞的作用.     

兔骨髓基质细胞的分离培养

目的 为骨组织工程寻找一种理想的种子细胞。方法 采取兔骨髓组织，应用梯度离心获取骨髓基质细胞，体外培养传代，通过光镜、透射电镜及成骨特性的鉴定，观察细胞的形态、生长特点及成骨特性。结果 培养的骨髓基质细胞形态多为三角形或梭形，生长增殖迅速，具有成骨能力，易于定向分化为成骨细胞。结论 自骨髓获得的骨髓基质细胞具有明显的增殖能力和成骨活性，可以做为骨组织工程中比较理想的种子细胞。     

组织工程骨再生修复骨缺损的实验研究

目的 观察不同浓度成骨细胞于三维胶原凝胶载体中植入体内的骨再生效果,确立成骨细胞于三维胶原凝胶载体中植入的最佳有效浓度。方法 采用胶原酶、胰蛋白酶消化方法分离、培养成骨细胞,然后按10~7、10~6、10~5、10~4/ml将成骨细胞包埋于Ⅰ型胶原凝胶载体中植入兔桡骨骨缺损区域,于术后1-8周采用形态学观察、双能量X线骨密度测量、电镜观察其骨再生过程。结果 成骨细胞按10~7、10~6、10~5、10~4/ml植入组和对照组骨缺损桥接率于术后4周时分别为40％、65％、31.25％、5.55％、5％,植入8周时分别为41.67％、75％、37.5％、10％、8.33％;成骨细胞按10~7、10~6、10~5、10~4/ml植入组和对照组于术后6周骨密度分别为0.112±0.018、0.159±0.033、0.122±0.039、0.066±0.002、0.067±0.009,术后8周骨密度分别为0.150±0.059、0.173±0.041、0.145±0.023、0.103±0.023、0.102±0.033。扫描电镜观察成骨细胞植入1周时细胞呈圆形或椭圆形,其周围可见大量呈疏松排的胶原纤维;植入3周时已经有骨陷窝形成,骨陷窝中的成骨细胞突起多、细、短;植入5周时骨陷窝已钙化,骨小管很清晰;成骨细胞突起变少、变粗、变长。结论 成骨细胞于三维胶原凝胶中按10~7、10~6、10~5/ml均有明显促骨再生效果,其最佳细胞密度为10~6/ml。     

自体成骨细胞--nBGC复合物修复犬胫骨骨缺损

目的：评价搭载自体骨细胞的纳米仿生材料在体内的组织反应性和骨修复作用。方法：4只犬的双侧胫骨各制作一直径l0mm的单侧皮质骨缺损，一侧骨缺损植人复合自体成骨细胞的仿生生物材料作为实验组，另一侧植人自固化磷酸钙(CPC)作为对照组。于术后8周取材，观察各组X线片、组织学、四环素荧光标记变化，比较骨缺损修复情况。结果：X线检查显示nBGC支架与周围骨组织很快融合，界限模糊；而对照组骨缺损界限仍清晰。nBGC支架内大量新骨组织形成，而在CPC植人组新生骨只沉积于植入物的表面，CPC周围有厚纤维组织条带包裹。结论：nBGC支架在体内既能降解又具有生物活性，能融入骨重塑过程，具有良好的组织反应性和骨修复作用，是一种皂好的组织工程骨支架材料．     

降钙素基因相关肽对人脐静脉血管内皮细胞增殖和迁移的影响及机制研究

目的组织工程骨的神经化能有效促进支架材料内血管生成,修复骨缺损。研究降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖与迁移的作用,进一步揭示组织工程骨的神经化促血管生成机制。方法体外分离获取HUVECs,并通过血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)与CD31抗原鉴定,取第1代细胞用于实验。实验分为6组,分别以0(A组)、1×10—12(B组)、1×10—11(C组)、1×10—10(D组)、1×10—9(E组)、1×10—8mol/L(F组)浓度CGRP干预HUVECs。采用细胞免疫荧光观察HUVECs的CGRP1受体(CGRP1 receptor,CGRP1R)表达情况,AlarmarBlue法动态检测各组HUVECs增殖率,Transwell小室检测各组HUVECs的迁移能力,ELISA法检测HUVECs分泌VEGF的水平,Westernblot法检测其局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的表达。结果分离的细胞通过形态学及vWF、CD31免疫荧光鉴定为HUVECs,并可见CGRP1R在细胞质和细胞膜表达。CGRP呈时间-浓度依赖性刺激HUVECs增殖;B～F组各时间点细胞增殖能力均高于A组(P<0.05),F组各时间点细胞增殖能力最高。B～F组迁移细胞数均显著高于A组(P<0.05),最大增幅达3倍以上。B～F组VEGF分泌量均显著高于A组(P<0.05);C、D组促进细胞分泌VEGF的能力最强。Western blot检测示,与A组相比,B～F组CGRP刺激HUVECs 3、7、10 d后,FAK表达明显增加(P<0.05)。结论 CGRP对HUVECs的增殖和迁移有直接促进作用,可能作用机制为CGRP能促进VEGF分泌和增加FAK的表达。     

骨组织工程细胞支架复合珊瑚羟基磷灰石生物相容性研究

目的研究复合珊瑚羟基磷灰石(CCHA)与成骨细胞的生物相容性。方法将成骨细胞分别和复合骨形态发生蛋白的珊瑚羟基磷灰石(CCHA)、单纯珊瑚羟基磷灰石(CHA)混合培养,检测细胞增殖指数和碱性磷酸酶(ALP)活性。结果CCHA对成骨细胞的ALP活性有明显的促进作用,CHA对ALP活性没有影响。二者对细胞增殖指数均无影响。结论CCHA具有良好的生物相容性和骨诱导作用。     

组织工程血管种子细胞培养的实验研究

目的：为血管组织工程的实验研究提供细胞来源，方法：分别采用消化法和和组织块法培养血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，并进行两种细胞的传代、纯化、鉴定以及形态学观察，结果：培养的两种细胞均符合血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的形态特征，结论：所培养的细胞可提供作进一步深入的血管组织工程的研究。     

聚丙交酯-猪衍生异种骨复合材料的体外细胞亲和性研究

目的研究聚丙交酯（poly—L—lactide，PLI。A）-猪衍生异种骨（porcine—derived xenogeneic bone，PDXB）复合材料作为骨组织工程细胞支架材料的可行性。方法采用溶液浇铸法制备PLLA—PDXB复合膜，溶液浇铸一致孔剂溶出法制备PLLA—PDXB复合支架。对PLLA—PDXB复合膜和支架的表面进行水解处理，扫描电镜观察形貌特征，并测量复合膜的吸水率。用鼠OCT-1类成骨细胞作为种子细胞进行体外培养和扩增，并种植于复合膜和支架上，观察OCT-1类成骨细胞在复合膜上的黏附率、黏附形态、增殖活力和生长形态。结果PDXB粉末粒径均匀分布在50μm左右，物相结构与羟基磷灰石相似，但钙磷比降低。PLLA—PDXB复合材料经表面碱水解处理，PDXB粉末得以暴露。复合材料的亲水性和粗糙度明显增加。复合材料的细胞黏附率及细胞增殖活力均优于纯PLLA材料；细胞倾向于生长在有PDXB粉末暴露的表面上；在复合支架上培养的细胞能够迁移至支架内部旺盛生长。结论PLLA—PDXB复合材料具有优良的细胞亲和性，可望成为一类新的骨组织工程细胞支架材料。     

关节软骨组织工程种子细胞的研究进展

目的 综述关节软骨组织工程种子细胞的研究进展.方法 广泛查阅近年来有关关节软骨组织工程种子细胞的文献,并进行综述.结果 BMSCs分化为软骨细胞将成为关节软骨组织工程种子细胞的主要来源,与支架利用和培养环境改善构成关节软骨组织工程的重要条件.结论 充分利用细胞因子和转基因技术,改良三维支架和培养条件,将推动关节软骨组织技术的进展.     

细胞膜片技术及其在骨组织领域的应用进展

目的对细胞膜片技术(cell sheet technology,CST)及其在骨组织领域的应用进展进行综述。方法广泛查阅近年来国内外相关文献,并进行总结。结果 CST主要应用温度反应培养皿收获细胞,避免使用蛋白酶,保留了培养过程中细胞自分泌的细胞外基质及相关蛋白和因子,将细胞以一层完整的膜状结构收集,为体内骨愈合提供了适宜的微环境。以CST为基础,通过同型或异型细胞膜片叠加、细胞膜片结合支架以及细胞膜片折叠等方法构建三维结构组织,在组织工程骨构建方面表现出了巨大潜力。结论 CST与传统组织工程方法结合将促进骨组织工程学的发展。