PCR-RLFP方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性的实验条件研究

目的探讨PCR-RFLP技术判断IL-6基因启动子区-634C/G多态性的最适实验条件.方法对影响PCR的部分因素和影响RFLP方法的一些因素进行研究.结果PCR扩增IL-6基因启动子区的最适条件为:引物浓度为0.2μmol/L;Taq酶量为1.5 U;dNTP浓度为120μmol/L;Mg2 浓度为2.0 mmol/L.最经济有效的酶切体系为20μL体系中加4μL产物用2.5 U的酶消化9 h以上.结论最佳实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键.     

PCR-RFLP技术检测SUMO4基因163A/G多态性的实验条件研究

目的确定PCR-RFLP技术检测小泛素样修饰蛋白4（SUMO4）163A/G多态性的最适实验条件.方法对影响SUMO4基因PCR反应的主要因素设定系列浓度梯度分别进行研究.结果最适变性温度为94℃;最适退火温度为55℃;最适引物浓度为0.25μmol/L;最适Mg2＋浓度为1.5mmol/L;最适dNTP浓度为0.25mmol/L;以2.5U为最适Taq酶量;酶切体系为31μL体系中加10μL产物用10U的酶消化.结论最佳实验条件的摸索是进行糖尿病实验研究的关键.     

PCR-RFLP法检测葡萄糖激酶基因启动子-30位点变异的实验条件研究

目的：确定PCR扩增葡萄糖激酶基因启动子区以及用Alw21I内切酶切割-30位点的最佳实验条件。方法：对影响PCR反应以及酶切的实验因素进行系统研究。结果：最佳引物浓度为0．3μmol／L；以1 U酶量效果最满意；最适dNTP浓度为167μ mol／L；最适镁离子浓度为1．5mmol／L。20μL的酶切体系中，最佳酶切产物为5μL，最佳内切酶量为5 U，酶切时间应超过9h。以上参数偏离最适条件将会导致实验失败。     

PCR-RFLP技术检测RANTES基因启动子区-28C/G多态性的实验研究

目的为研究PCR—RFLP技术检测RANTES基因启动子区-28C／G多态性的最适实验条件．方法对主要影响因素设系列浓度梯度进行PCR后观察电泳结果，设置不同的体系对RFLP方法进行了研究．结果最适变性温度为94℃；最适退火温度为60℃；最适引物浓度为0．6μmol／L；最经济有效的酶切体系为12μL体系中加4μL产物用3U的酶消化．结论最佳的实验条件的摸索是进行大批量实验研究的关键．     

TD-PCR技术用于肠道病毒71的检测

目的评价降落聚合酶链反应（touchdown PCR,TD—PCR）检测肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）的效能和敏感性。方法根据touchdown原理设计TD-PCR程序,试验选择PCR最佳反应条件,分别与普通PCR及TD—PCR、普通Taq酶与热启动酶扩增效果进行比较．并利用10倍稀释法检验TD—PCR方法的灵敏度。琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物,纯化后DNA产物测序验证该方法的特异性。结果TD—PCR的扩增片段条带清晰．检测效果明显优于普通PCR,使用普通Taq酶的TD—PCR比使用热启动酶有更优的性价比,测序证实了此组片段的特异性．cDNA的最低检测浓度为1．031μg／mL。结论成功建立TD—PCR检测EV71的方法,使用普通Taq酶获得理想的检测结果,为快速检测手足口病的病原体提供了可靠的手段。     

利用SOE-PCR技术构建eglAp-rhIL-12融合基因的条件优化

目的利用SOE-PCR技术连接丙酮丁醇梭菌内源性β1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽(eglAp)与重组人白细胞介素12(rhIL-12)序列,构建融合基因eglAp-rhIL-12;优化SOE-PCR反应中的主要条件,获得具有可重复性的SOE-PCR方法。方法通过PCR得到eglAp的3′端和rhIL-12的5′端重叠的两个基因序列;通过调整SOE-PCR体系中模板eglAp和rhIL-12的量及比例,得到目的产物;通过调整退火温度及引物量提高扩增产物特异性。结果当SOE-PCR满足以下条件时即可获得高纯度高丰度目的产物:25μL PCR反应体系中,eglAp和rhIL-12的两个模板量分别为5～10ng,摩尔比为5∶1(质量比1∶1);在不加引物的情况下,退火温度设定为71℃,扩增3个循环,然后加入0.4μL引物(10μmol/L),退火温度设定为61.3℃,扩增28个循环。结论 SOE-PCR成功的关键在于调整好模板的比例和浓度,即质量比1∶1,模板量不要少于5ng(25μL PCR体系);若要获得高纯度高丰度的连接产物,则需要适当提高退火温度和减少引物量。     

CYP2A6基因多态性的一步PCR-RFLP分析法

目的：建立CYP2A6基因多态性的一步PCR－RFLP分析法。方法：取外周静脉血100μl，用Rose法提取基因组DNA，用特异性引物CYP2A6F03：5′-CTG ATC GAC TAG GCG TGG TA-3′,cyp2a6r06:5′-CGT CCT GGG TGT TTT CCT TC-3′进行一步PCR扩增，用限制性内切酶Dde I,XcmI对PCR产物进行酶切，3％琼脂糖凝胶电泳。结果：扩增的PCR产物大小为214bp，部分血样标本未获得PCR扩增产物，判为CYP2A6缺失基因型（CYP2A6 del/CYP2A6del)。DdeI酶切后，凝胶电泳可得到部分酶切（CYP2A6wt/CYP2A6v2基因型），未被酶切（CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型）两种类型DNA片段；XcmI酶切后，凝胶电泳可得到部分酶切（CYP2A6wt/CYP2A6vl/CYP2A6wt基因型），未被酶切（CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型）两种类型DNA片段。其中，部分血样标本同时被DdeI和XcmI部分酶切（CYP2A6v2/CYP2A6vl基因型）。应用此方法检测，发现中国人群胃癌患者存在CYP2A6等位基因多态性。经双盲重复检测，上述结果一致。结论：采用一步PCR－RFLP技术可以建立简单、稳定、特异的CYP2A6基因多态性分析法。     

葡萄糖激酶基因启动子-30位点PCR扩增的实验条件研究

为确定PCR(聚合酶链反应)扩增葡萄耱激酶基因启动子区,对影响PCR的实验因素进行了系统研究.研究结果 表明:最佳引物浓度为0.3μmol/L;以1U酶量效果最满意;最适dNTP浓度为167μmol/L;最适Hg2+浓度为1.5mmol/L.以上参数偏离最适条件将会导致实验失败.     

PCR-RFLP方法检测锰超氧化物歧化酶基因V（16）A多态性的实验条件研究（摘要）

目的为确定PCR-RFLP技术检测锰超氧化物歧化酶基因（MnSOD）V（16）A多态性的最适实验条件,对影响PCR的主要因素进行了研究.结果最适变性温度为95℃;最适退火温度为55℃；最适引物浓度为0．25μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；最适反应体系为25μL，以0．6U为最适Taq酶量．酶切体系为15μL体系中加8μL产物用2U的酶消化．为后续研究奠定了实验基础．     

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的：建立一种简便，准确，实用的乙型肝炎病毒（HBV）耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法。方法：根据已公布的HBV DNA序列，在HBV多聚酶基因区设计合成了两对寡核苷酸引物，其中一只为错配引物；应用巢式错配聚合酶链反应（PCR）特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段，扩增产物用限制性内切酶（NdeI)酶切，琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后目的片段的限制性片段长度多态性（RFLP）图谱，部分标本进行DNA测序。结果：（1）所建立的巢式错配PCR－RFLP法，从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要11小时，灵敏度高，可以检测到10^3copies/ml的HBV DNA；特异性强，结果准确，经DNA测序证实。（2）检测20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清，发现YMDD变异者（45％）9例，YMDD野毒株者（55％）11例 ，表明该法可有效地鉴别HBV YMDD野毒株与变异株。结论：本实验所建立的用于检测HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异的巢式错配PCRRFLP方法简单，敏感，特异，适用于一般实验室及大规模的人群调查。     

荧光定量PCR检测细胞代谢综合征相关基因表达的优化

目的优化MRSG mRNA表达的Taqman荧光定量PCR检测反应体系并进行系统评价。方法设计荧光PCR适用的引物和探针,从模板、引物、探针、镁离子浓度等方面优化荧光定量PCR检测反应体系,评价优化系统的特异性和稳定性。结果确定系统的模板取样量为2μl,引物浓度为0.4μmol/L,探针浓度为0.2μmol/L,Mg~（2＋）浓度为4mM,建立了稳定的MRSG mRNA表达的Taqman荧光PCR检测方法。结论优化后的MRSG mRNA荧光PCR检测方法特异性和稳定性较好。     

佛波酯慢性处理对大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C表达的影响

目的观察佛波酯（PMA）慢性处理大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C（PKCs）表达的影响。方法原代培养大鼠m管平滑肌细胞,①按照PMA处理浓度将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMAI、5、10μmol／L组,各组细胞均处理4h;②按照PMA处理时间将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMA1、4和24h组,PMA组的药物浓度均为10μmol／L。采用Western blotting技术榆测各亚型PKCs蛋白的表达。结果PMA浓度〈10μmol／L处理细胞时间〈4h不影响PKC—α的表达（P〉0．05）,10pmlol／LPMA处理24h能抑制PKC—α的表达（P〈0．05）;PMA浓度〉5μmol／L处理细胞时间〉4h可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）,PMA浓度〈5μmlol／L处理细胞时间〈4h对PKC-δ的表达无显著影响（P〉0．05）,10μmol／LPMA处理细胞1h即可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）;PMA浓度〉5pμmol／L处理细胞时间〉4h可以明显抑制PKC-θ的表达（P〈0．01）;10μmol／L的PMA处理细胞24h对PKC．∈的表达无明显影响（P〉0．05）。结论PMA慢性处理大鼠血管平滑肌细胞可抑制传统型PKC—α和新型PKC-δ、ε、θ的表达,对非典型PKC-ζ的表达没有影响。     

锌和N-乙酰半胱氨酸对镉致人正常肝细胞HL-7702凋亡的拮抗作用研究

目的：探讨氯化锌（ZnCl：）和N-乙酰半胱氨酸（N—acetylcysteine,NAC）对镉所致人正常肝细胞HL-7702凋亡的拮抗作用。方法：体外培养的人正常肝细胞HL-7702分别以0、10、20、40、80、160Ixmol／L的氯化镉（CdCl2）处理24h,ZnCl,和NAC顸处理组分别在各浓度的CdCl2处理前以25．0、50．0、100．0、200．0μmol／L的氯化锌和2．5、5．0、10．0、20．0mmol／LNAC预处理24h,MTT法测定各组HL-7702细胞的相对存活率;流式细胞术Annexin—V—PI双染法检测细胞凋亡百分率。结果：随着镉处理浓度的增加,氯化镉对细胞活力的抑制作用增强,40、80、160ixmol／L的镉处理组细胞相对存活率明显降低,50ixmol／L锌预处理组在CdCl：剂量为40、80μmol／L时,细胞相对存活率显著高于相应剂量的单纯镉处理组（P〈0．01）,10mmol／LNAC预处理组只在40mmol／LCdCl2组细胞相对存活率显著高于相应剂量的单纯镉处理组（P〈0．05）;与0μmol／L镉处理组比较,40、80、160μmol／L镉处理组HL-7702细胞的凋亡百分率显著升高（P〈0．01）;与40μmol／L镉处理组比较,100μmol／L锌预处理组细胞凋亡率显著降低（P〈0．01）;5．0、10．0、20．0mmol／LNAC预处理可有效拮抗镉诱导的HL-7702细胞凋亡（P〈0．05）。结论：锌和NAC对镉致HL-7702细胞损伤和凋亡有明显的拮抗作用。     

醋酸棉酚对人腺样囊性癌ACC-M细胞P16基因甲基化及mRNA表达的影响及其意义

目的 研究醋酸棉酚（gossypol acetic acid,GAA）对体外培养的人腺样囊性癌ACC-M细胞P16基因甲基化及mRNA表达的影响,初步探讨醋酸棉酚的抗肿瘤作用机制.方法 （1）应用甲基化特异性PCR （MSP）检测ACC-M细胞在GAA作用48、72 h后P16基因甲基化状态的改变情况; （2）应用实时荧光定量法（RFQ-PCR）检测ACC-M细胞在GAA作用48、72 h后P16基因mRNA的表达变化.结果 （1） MSP检测结果显示：分别以19、10 μmol/L的GAA作用ACC-M细胞48、72 h后,P16甲基化条带的平均灰度值低于对照组（P＜0.05）; （2） RFQ-PCR检测显示：分别以19、10 μmol/L的GAA作用ACC-M细胞48、72 h后细胞中P16mRNA的表达水平高于对照组（P＜0.05）.结论 GAA可降低P16基因的甲基化水平,且能增强P16基因mRNA表达,这可能是GAA抗肿瘤作用的机制之一.     

芹菜素增敏TRAIL诱导卵巢癌CoC1细胞凋亡

目的研究芹菜素（API）抑制NF-κB活性,增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡的作用。方法体外培养CoC1细胞。碘化丙啶（PI）染色流式细胞术（FCM）定量分析细胞凋亡率（亚二倍体DNA含量细胞百分率）。DNA琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA梯形条带。Western blot检测细胞蛋白的表达。结果 API（20μmol/L）和TRAIL（20 ng/mL）以及两者合用48 h,CoC1细胞凋亡率分别是8.83%±2.33%、8.32%±2.80%和69.5%±4.65%;API（20μmol/L）预孵育4 h后,TRAIL（20 ng/mL）处理CoC1细胞44h,展示出典型DNA梯形条带图谱。API（20μmol/L）以时间依赖的方式降低CoC1细胞IκBα蛋白磷酸化水平和抑制NF-κB（p65）蛋白表达。结论亚细胞毒性浓度的API具有增强TRAIL诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡作用,其作用机制与抑制NF-κB活性有关。     

姜黄素对氧化应激损伤后海马神经元血红素加氧酶-1 的表达影响

目的：探讨姜黄素对氧化应激损伤后的海马神经元血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）的表达影响。方法i将培养的原代海马神经元,分为6组：空白对照组、损伤对照组、姜黄素不同剂量治疗组（2．5μmol／L,5μmol／L,10μmol／L,20μmol／L）。利用1mmol／L的H2O2处理海马神经元1h,制作神经元氧化应激损伤模型。按照以上分组情况加入等浓度的姜黄素培养液,37℃、5％CO2孵箱孵育6h,采用倒置相差显微镜观察细胞的形态变化;免疫荧光、PCR半定量检测细胞内HO-1的表达。结果：①5μmol／L组、10μmol／L组细胞形态变化不明显;损伤对照组和2．5μnol／L组细胞损伤明显;②损伤对照组与空白对照组比较,P〈0．05;损伤对照组与2．5μmol／L组、20μmol／L组两两比较差异无统计学意义（P〉0．05）;5μmol／L组、10μmol／L组与损伤对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;PCR检测结果提示20μmol／L组比2．5μmol／L组HO-1的表达量减少。结论：姜黄素对氧化应激损伤海马神经元的保护机制可能是通过上调HO-1的表达实现的。     

染料木素与大豆甙元对子宫内膜癌细胞株ERRα的影响

目的探讨两种植物雌激素（染料木素、大豆甙元）对子宫内膜癌细胞株（Ishkawa细胞系）中雌激素受体相关受体α（estrogen-related receptorα,ERRα）的表达及细胞增殖的影响。方法采用Real-Time PCR方法检测不同浓度（40、20、10、5μmol/L）的两种植物雌激素作用于Ishkawa细胞系不同时间（24、48 h）后ERRαmRNA的变化,并用MTT法检测细胞的增殖情况。结果Ishkawa细胞系经低浓度染料木素处理后ERRαmRNA的表达均有上调趋势,以10-20μmol/L较为明显,40μmol/L浓度时ERRαmRNA的上调受到抑制。且染料木素在低浓度（5、10μmol/L）对Ishkawa细胞的增值有着抑制作用,而在较高浓度（20、40μmol/L）有着促进Ishkawa细胞生长的作用。大豆甙元处理24 h组ERRαmRNA均有上调,以40μmol/L最为明显;48 h组均有上调,以20μmol/L上调最为明显,40μmol/L浓度时ERRαmRNA的上调受到抑制。且24 h和48 h组各浓度均对Ishkawa细胞增殖有着抑制作用,24 h以低浓度抑制较为明显,48 h组各浓度之间增值率的差异不明显。结论大豆甙元和染料木素在低浓度时均可上调ERRdmRNA并抑制Ishkawa细胞增殖,在高浓度时却对Ishkawa细胞ERRetmRNA的上调作用不明显,染料木素高浓度时促进Ishkawa细胞增殖,大豆甙元高浓度时抑制Ishkawa细胞增殖作用较低浓度为差。     

7,8-二羟基黄酮对6-羟基多巴胺诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的 探讨7,8-二羟基黄酮（D HF）对6-羟基多巴胺（6-O HD A）诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制。方法 将6-OHDA（25～200 Lmol/L）和PC12细胞混合后孵育24 h,观察6-O HD A的毒性作用;以D HF（1～25Lmol/L）预处理细胞1 h,再加入100 Lmol/L 6-O HDA继续培养24 h,观察D HF对6-O HD A诱导PC12细胞损伤的保护作用;25 Lmol/L D HF预处理前30 min加入10 n mol/L L Y294002,观察D HF的保护作用是否可被磷酸肌醇3激酶（PI3K）抑制剂所阻断。采用MTT法测定细胞存活率。结果 与对照组相比,50～200 Lmol/L 6-O HDA作用24 h可明显降低细胞存活率,其中100 Lmol/L 6-O HD A可导致半数细胞死亡。D HF预处理剂量依赖性抑制了6-OHDA诱导的细胞损伤,该作用部分被PI3K抑制剂所阻断。结论 DHF对6-OHDA诱导PC12细胞损伤具有明显的保护作用,该作用可能与PI3K信号通路有关。