维甲酸对人RPE细胞胞间通讯功能和Cx43表达的影响

目的观察培养的人视网膜色素上皮（RPE）细胞中连接蛋白Cx43的表达特点，以及维甲酸（RA）对人RPE细胞生长和细胞间缝隙连接功能、细胞间通道蛋白Cx43表达的影响及其相互关系。方法免疫组织化学方法观察缝隙连接蛋白（Cx43）在培养的人RPE细胞中的表达特点；不同浓度的RA作用于培养的第4代人的色素上皮细胞，用MTT方法观察RA对体外培养人RPE细胞生长的抑制；用LY染料传输方法测定细胞间隙连接功能，观察这三组不同浓度的RA对人RPE细胞缝隙连接功能的影响；免疫组织化学方法鉴别不同浓度RA影响后的缝隙连接蛋白Cx43的表达，用计算机灰度测量的方法评估表达的强度并作统计学分析。结果免疫组织化学染色显示体外培养的人RPE细胞表达缝隙连接蛋白Cx43，表达的部位主要在细胞浆和细胞膜上；RA对人RPE细胞的生长有明显的抑制作用，其抑制作用呈剂量依赖性；LY染料传输试验表明在RA的作用下RPE细胞间通讯功能明显增强；经计算机图像分析表明RA使连接蛋白Cx43表达增强，增强的程度与RA的浓度呈正相关。结论体外培养的人RPE细胞可以表达Cx43蛋白，RA抑制培养的色素上皮细胞的生长，提高细胞间隙连接通讯功能，上调Cx43蛋白在人RPE细胞中的表达。     

表皮生长因子对人视网膜色素上皮细胞Cx43mRNA表达的影响

目的:观察表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)对培养的人视网膜色素上皮(retinapigmentepitheliumcell,RPE)细胞中缝隙连接蛋白Cx43蛋白及mRNA的表达影响。方法:不同浓度的EGF作用于培养的第4代人的RPE细胞24h,采用Westernblot的方法测定Cx43的蛋白;原位杂交观察Cx43mRNA在RPE细胞中的表达特点;RT-PCR实验对EGF影响后的RPE细胞的mRNA进行半定量观察。结果:Westernblot试验证实不同浓度的EGF均可使Cx43蛋白表达量明显减少,并且与EGF的浓度呈正相关,原位杂交显示所有细胞均表达Cx43mRNA,其表达部位主要在细胞质和核;RT-PCR实验对mRNA进行半定量观察显示表皮生长因子使RPE细胞的mRNA表达量明显减少。结论:EGF可以下调Cx43蛋白及Cx43mRNA在人RPE细胞中的表达。     

EGF对人视网膜色素上皮细胞胞间通讯功能和Cx43表达的影响

目的探讨培养的人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞中连接蛋白Cx43的表达,以及表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)对人视网膜色素上皮细胞间缝隙连接功能、细胞间通道蛋白Cx43表达的影响。方法免疫组化的方法观察Cx43在培养的人RPE细胞中的表达特点,用10mg·L-1、20mg·L-1、30mg·L-1不同浓度的EGF作用于培养的第4代人RPE细胞后,观察缝隙连接蛋白Cx43的表达强弱变化,用计算机灰度测量的方法评估表达的强度并作统计学分析。用LY染料传输方法测定细胞间隙连接功能,观察这3组不同浓度的EGF对人RPE细胞缝隙连接功能的影响。结果免疫组化染色显示体外培养的人RPE细胞表达缝隙连接蛋白Cx43,经计算机图像分析表明EGF使连接蛋白Cx43表达减弱,下调的程度与EGF的浓度呈正相关。LY染料传输试验显示在EGF作用下视网膜色素上皮细胞间通讯功能明显降低。结论体外培养的人RPE细胞表达Cx43,EGF可以减弱细胞间隙连接通讯功能、下调Cx43在人RPE细胞中的表达。     

小干扰RNA对人视网膜色素上皮细胞缝隙连接蛋白43表达水平的调节

目的 观察体外化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对原代培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞缝隙连接蛋白43(connexin43,cx43)基因和蛋白表达的影响.方法 设计合成针对人ex43基因的小干扰片段(siR-NA1、siRNA2、siRNA3)和1条阴性对照siRNA0,在脂质体的介导下转染培养的人RPE细胞,采用RT-PCR确定最有效的抑制片段;针对siRNA的有效片段,分为不同浓度(50～30nmolO·L-1)转染培养细胞,培养72 h后进行MTT增生试验,观察其对人RPE细胞增生能力的影响,确定最有效的浓度;siRNA转染细胞后,分别培养12 h、24 h、48 h、72 h后进行Weston blot试验.观察不同时间点其对cx43蛋白表达的影响.结果 体外合成的3条siRNA均在一定程度上抑制cx43基因的合成,其中 siRNA1是最有效的抑制片段,根据条带灰度比其抑制率达到72%;siRNA1可以显著促进人RPE细胞的增生,增生率达到146%;明显抑制其cx43蛋白的表达(P<0.01),抑制率达到61%;从浓度组间结果可以看出,siRNA的最佳作用浓度是250 nmol·L-1,在此浓度之前效率与浓度呈正比,超过此浓度后各浓度组间差异无统计学意义;比较不同时间点,siRNA转染人RPE细胞24 h后开始抑制cx43表达,48 h后对cx43蛋白合成抑制率最明显.结论 化学合成的siRNA可以有效抑制培养的人RPE细胞cx43基因的表达,促进细胞的增生.这种基因沉默作用可能对于视网膜色素上皮组织的再生有一定作用.     

曲安奈德对高糖培养RPE细胞ICAM-1和ILK表达的影响

目的 检测高糖诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和整合素连接激酶(integrin-)linked kinase,ILK)的表达,并观察曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)时二者表达的影响,探讨炎症在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)发病过程中的作用.方法 体外培养人RPE细胞,应用免疫荧光细胞染色法、Western-blot法,分别检测在低糖对照组(5.6 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)、高糖组(30.0 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)、TA组(0.1 mol·L-1TA+30.0 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)RPE细胞ILK和ICAM-1蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测二者mRNA的表达.结果 Western-blot和免疫荧光细胞染色都显示RPE细胞在高糖组培养6 h时ICAM-1表达量最高,为0.378±0.012,是对照组0.220±0.008的1.71倍,TA对其表达有抑制作用,抑制率为26.98%(P＜0.05);高糖组作用2 h ILK蛋白表达量最高,是对照组的1.45倍,TA组中虽然ILK表达量较高糖组减少(为高糖组的76.20%),但差异无统计学意义(P＞0.05),TA对其表达无明显抑制作用.而实时荧光定量PCR检测显示在在高糖组作用1 h后RPE细胞表达ICAM-1、ILK mRNA开始上升,ICAM-1 mRNA表达在2 h达到高峰,2 h时TA对高糖组ICAM-1 mRNA的抑制率为83.67%,差异具有统计学意义(P＜0.05).TA组ILK mRNA的表达与高糖组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RPE细胞在高糖环境下能高表达ICAM-1和ILK,高糖对RPE细胞表达ICAM-1的上调作用能被糖皮质激素TA抑制,而ILK的上调不受其抑制,提示炎症在早期DR病理过程中有重要作用,RPE细胞可能通过这两种因子的信号途径参与DR的病变.     

曲安奈德对缺氧条件下培养人RPE细胞HSP47表达的影响

目的 探讨曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)对体外缺氧培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞热休克蛋白47(heat shock protein 47,HSP47)表达的影响.方法 使用化学缺氧诱导剂CoCl2模拟人RPE细胞缺氧环境,人RPE细胞分别在不同浓度TA的条件下培养,将其分为0 μg·L-1 TA组、0.05 μg·L-1 TA组和0.20 μg·L-1 TA组,均加入含150 μmool·L-1 CoCl2的DMEM完全培养液采用RT-PCR检测HSP47表达,使用Western-blotting检测HSP47的蛋白水平.结果 0 μg·L-1 TA组、0.05 μg·L-1 TA组和0.20 μg·L-1 TA组HSP47 mRNA的表达量分别为1.53±0.21、1.15±0.20、1.07±0.17,HSP蛋白表达量分别为748.62±79.03、643.76±63.18、615.62±61.77,3组间HSP47 mRNA及蛋白表达量差异均有统计学意义(F=14.729,P=0.000;F=9.438,P=0.001);0.05 μg·L-1 TA组与0 μg·L-1 TA组比较,HSP47 mRNA及蛋白的表达量均显著下降(P=0.000、P=0.003);0.20 μg·L-1 TA组与0 μg·L-1 TA组比较,HSP47 mRNA及蛋白的表达量也均显著下降(均为P=0.000);而0.05 μg·L-1 TA组与0.20 μg·L-1 TA组比较,HSP47 mRNA及蛋白的表达量差异均无统计学意义(P=0.373、P=0.392).结论 HSP47对胶原的成熟起着重要的作用,TA能有效地抑制缺氧条件下人RPE细胞HSP47的表达,可能是其防治增生性玻璃体视网膜病变的一个重要机制.     

缺氧对体外培养的人视网膜色素上皮细胞热休克蛋白47表达的影响

目的:探讨缺氧对体外培养的人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞热休克蛋白47(heatshockprotein47,HSP47)表达的影响。方法:培养的人RPE细胞分为两组:缺氧组使用化学缺氧诱导剂CoCl2模拟RPE细胞缺氧环境来培养人RPE细胞,对照组置入正常环境中培养。采用半定量RT-PCR检测人RPE细胞中HSP47mRNA的表达,Westernblot蛋白印迹分析检测人RPE细胞中蛋白水平。结果:缺氧组AHSP47/Aβ-actin比值为1.46±0.15与对照组比值0.94±0.13比较,差异有显著意义(P<0.05)。同时缺氧组HSP47蛋白含量平均A值为728.03±38.15显著高于正常对照组平均A值571.47±26.95,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HSP47在缺氧状态下异常高表达。     

人眼Tenon囊成纤维细胞缝隙连接细胞间通讯的检测

目的:观察体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞(human Tenon’s capsule fibroblasts,HTFs)缝隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)功能及其构成蛋白connexin43(Cx43)的表达及分布。方法:锐刀划痕罗氏黄(lucifer yellow)荧光染料传输法观察GJIC功能;RT-PCR及Western blot分别检测Cx43 mRNA及蛋白表达;免疫细胞化学方法检测Cx43的分布。结果:荧光染料自划痕线向邻近未损伤细胞传输达6级细胞以上,同时检测到Cx43 mRNA与蛋白的表达;免疫细胞化学法观察到Cx43分布于细胞膜。结论:培养的HTFs具有较强的GJIC功能,通过Cx43介导GJIC赋予细胞能够相互之间传递信息的能力,提示在创伤愈合过程中GJIC对成纤维细胞功能同步化方面发挥重要作用。     

缺氧和高糖对视网膜色素上皮细胞增生及VEGF、TGF-β1表达的影响

目的 探究缺氧、高糖环境对体外培养的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞生长、增生及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达变化的影响.方法 采用酶消化法进行C57小鼠RPE细胞的体外原代培养.通过组织形态学观察和免疫化学染色对培养的RPE细胞进行鉴定.实验缺氧组:在DMEM培养液中加入CoCl2,使其浓度分别为50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1;实验高糖组:在DMEM培养液中加入D-葡萄糖,使其浓度分别为15 mmol·L-1、30 mmol·L-1、45 mmol·L-1.分别向培养的RPE细胞中加入上述培养液,共6组,每组3份;正常对照组加入含5.5 mmol·L-1葡萄糖、不含CoCl2的培养液.观察各组细胞在不同培养条件下的活力、倍增时间及增生情况.采用ELISA法检测各组细胞在培养不同时间后(24 h、48 h、72 h)上清液中VEGF及TGF-β1表达量的变化.结果原代培养及传代早期的RPE细胞生长较为旺盛;在缺氧和高糖培养条件下所培养的细胞活力和分裂次数均较正常对照组有所降低或减少,而倍增时间较正常对照组延长.在缺氧和高糖培养条件下培养24 h、48 h、72 h后,细胞上清液中VEGF和TGF-β1表达量均较正常对照组高(P<0.05);当CoCl2浓度为100 μmol·L-1和D-葡萄糖浓度为30mmol·L-1时,VEGF和TGF-β1在24 h、48 h、72 h表达均高于其他浓度,缺氧状态下48 h表达量分别为(43.28±0.88)ng·L-1和(8.90±1.38)ng·L-1,高糖状态下分别为(39.76±0.56)ng·L-1和(8.81±0.92)ng·L-1;缺氧组2种细胞因子表达量在48 h达到高峰,而高糖组在72 h达到高峰.结论 应用酶联合消化法可获得纯度较高的体外C57小鼠培养RPE细胞;缺氧和高糖状态可对RPE细胞增生起到明显抑制作用,但能够明显上调RPE细胞的VEGF、TGF-β1表达量.     

Peroxiredoxin6在氧化损伤人视网膜色素上皮细胞中的表达

目的 探讨Peroxiredoxin 6(Prx6)在体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中的表达情况,以及在人RPE细胞受到不同浓度的H2O2攻击时Prx6表达量的变化.方法 复苏培养人RPE细胞传至第3代,实验分为正常对照组和不同浓度H2O2攻击组(0.125 mmol·L-1、0.25 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、1 mmol·L-1),加入H2O2,后24 h收集细胞.通过免疫组织化学和RT-PCR法检测各组细胞Prx6的表达情况,同时应用MTT法检测各组细胞的存活率.结果 免疫组织化学和RT-PCR结果显示培养的正常RPE细胞中即有Prx6的表达.0.125 mmol·L-1.H2O2攻击组Prx6阳性表达量较正常组增多(4倍),0.25 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1H2O2,攻击组Prx6阳性表达量逐渐减少,1 mmol·L-1H2O2攻击组Prx6表达为阴性.MTT结果显示在H2O2浓度为0.125 mmol·L-1时,细胞的存活率仅轻微下降(91%),与正常组相比无统计学意义(P=0.086);在浓度为0.25 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1和1 mmol·L-1时,细胞的存活率明显下降,分别为83%、74%和52%,与正常组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 适量的氧化攻击可以诱导RPE细胞Prx6表达增高,进而保护细胞免受氧化损伤.     

Strabisme Alternant - Etude clinique - traitement

The author defines motor and sensory alternation: the term alternation should not be used in isolation, it should always be accompanied by the name of the parameter concerned. Sensory alternation is always found together with motor alternation but the reverse is not true.The examining criteria for a diagnosis of sensory alternation are given, sensory alternation must not be confused with alternating inhibition. Working from clinical observations of cases of motor alternating strabismus, the author selects 2 types of binocular sensory relations which allow one to differentiate between:- cases of primary alternating strabismus- cases of secondary alternating strabismusThese forms will develop in different ways; in both cases a cure is possible providing that the right treatment is prescribed and once prescribed carefully followed, etc. It is always a case of serious forms of strabismus whose developmental period is spread over several years.According to the authors, the frequency of cases of true primary strabismus is from 1–3%, the frequency of cases of secondary alternating strabismus varies according to the type of therapy practised on cases of monocular strabismus with amblyopia. These latter will become cases of alternating strabismus under the influence of certain types of therapy carried out over several years (penalization, rocking, alternated occlusion, etc...).Experimental data on kittens confirm clinical data; kittens placed in abnormal environments during the sensitive period will show modification in the distribution of cortical cells and the absence of binocular cells (either because the excitation of the two eyes was not simultaneous, or not identical: artificial strabismus, occlusion, opaque glasses). This disturbances become irreversible after a certain period of exposure (a function of age, length of exposure, etc...).It is thus necessary to bear in mind: 1) the iatrogenic risks of certain orthoptic treatments, 2) the necessity for a binocular form of treatment as soon as possible, as once a certain stage is passed, cortical plasticity diminishes and the elaboration of normal binocular relations becomes impossible.

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Effects of Adenosine Agonists on Intraocular Pressure and Aqueous Humor Dynamics in Cynomolgus Monkeys

The effects of single or multiple topical doses of the relatively selective A₁adenosine receptor agonists (R)-phenylisopropyladenosine (R-PIA) and N⁶-cyclohexyladenosine (CHA) on intraocular pressure (IOP), aqueous humor flow (AHF) and outflow facility were investigated in ocular normotensive cynomolgus monkeys. IOP and AHF were determined, under ketamine anesthesia, by Goldmann applanation tonometry and fluorophotometry, respectively. Total outflow facility was determined by anterior chamber perfusion under pentobarbital anesthesia. A single unilateral topical application of R-PIA (20–250 μg) or CHA (20–500 μg) produced ocular hypertension (maximum rise=4.9 or 3.5 mmHg) within 30 min, followed by ocular hypotension (maximum fall=2.1 or 3.6 mmHg) from 2–6 hr. The relatively selective adenosine A₂antagonist 3,7-dimethyl-1-propargylxanthine (DMPX, 320 μg) inhibited the early hypertension, without influencing the hypotension. Neither 100 μg R-PIA nor 500 μg CHA clearly altered AHF. Total outflow facility was increased by 71% 3 hr after 100 μg R-PIA. In conclusion, the early ocular hypertension produced by topical adenosine agonists in cynomolgus monkeys is associated with the activation of adenosine A₂receptors, while the subsequent hypotension appears to be mediated by adenosine A₁receptors and results primarily from increased outflow facility.