人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化

目的：探索人小涎腺成纤维样单克隆细胞的体外培养、扩增方法,鉴定其性质,研究向成骨细胞分化的潜能。方法：组织块贴壁法原代培养人小涎腺细胞,收集成纤维样细胞,用96孔板稀释铺板法克隆培养,免疫荧光和RT-PCR检测细胞表型,并进行成骨诱导分化,通过骨钙素、一型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶、茜素红钙结节染色鉴定成骨分化。结果：成功的在体外扩增培养出人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫荧光证实细胞表达CD13、CD29、CD106和CD44,RT-PCR显示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表达与人骨髓间充质干细胞相似。成骨诱导8天后,碱性磷酸酶表达阳性率100%,19天后骨钙素和一型胶原大量表达,并形成钙结节。结论：所建立的分离培养体系能够获得大量人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似于间充质干细胞。在成骨诱导培养条件下具有良好的向成骨细胞分化的潜能。     

诱导人孤雌胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的实验研究

目的探索人孤雌胚胎干细胞在体外向类间充质干细胞诱导分化的方法 ,并鉴定所得细胞的生物学特性。方法人孤雌胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养,形成拟胚体,10d后在含血清条件下使拟胚体贴壁生长,7d后胰酶消化,所得细胞在含血清的培养液中传代、扩增。观察传代、扩增后细胞的形态学变化;用免疫荧光染色和流式细胞技术进行细胞表型分析;取第9代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,9～28d后行特殊染色及RT-PCR分析。结果人孤雌胚胎干细胞在诱导分化后,形态与骨髓间充质干细胞相似,多次扩增传代后仍保持细胞形态和扩增能力。免疫荧光染色发现,细胞表达中胚层标志波形蛋白(Vimentin)。流式细胞分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166、CD44等间充质干细胞表面标志。特殊染色及RT-PCR分析显示:成骨诱导后,细胞碱性磷酸酶和茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后,细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强;成脂诱导后,细胞油红染色阴性,脂蛋白酶和Leptin无表达。结论人孤雌胚胎干细胞可以诱导、分化为间充质干细胞,并具有成骨、成软骨分化潜能。     

Wnt3 a信号分子对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化 过程中端粒酶活性的影响

目的探索Wnt3a信号分子对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中端粒酶活性的影响。方法采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养SD大鼠股骨骨髓间充质干细胞。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD45,筛选并鉴定细胞。采用成骨诱导培养基联合不同浓度的wnt3a(5 ng/mL、25 ng/mL、100 ng/mL)诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化,以碱性磷酸酶活性检测评价其成骨分化能力。通过TRAP-ELISA端粒酶活性检测法检测在不同浓度的wnt3a干预下诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中端粒酶活性的表达。结果骨髓间充质干细胞传至第3代后可获得均一性较高的细胞,流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达,CD45低表达。成骨诱导培养基联合不同浓度的wnt3a诱导大鼠BMSCs 7 d后,碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测结果:与普通成骨诱导培养基相比,含有5 ng/mL及25 ng/mL wnt3a的成骨诱导培养基可显著增加其碱性磷酸酶(ALP)活性(P0.05),而含有100 ng/mL wnt3a的成骨诱导培养基则明显抑制其碱性磷酸酶(ALP)活性(P0.05)。与普通成骨诱导培养基相比,联合诱导培养基诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,端粒酶活性的改变无明显的统计学差异。结论小剂量(5 ng/mL、25 ng/mL)的wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞成骨分化,而大剂量(100 ng/mL)的wnt3a分子则抑制其成骨分化。骨髓间充质干细胞具有较弱的端粒酶活性,成骨分化过程中其活性逐渐减弱,直至消失;wnt3a信号分子刺激并不能有效激活其端粒酶活性。     

兔脂肪干细胞的分离培养鉴定及成骨诱导分化研究

[目的]探讨在成骨诱导条件下兔脂肪干细胞的体外诱导分化情况：[方法]取3个月龄日本大耳白兔颈背部皮下脂肪，用Ⅰ型胶原酶消化获得细胞。Stro-1免疫细胞化学染色鉴定细胞性质；加入成骨诱导液后依次进行形态学、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积相关检测。[结果]（1）原代所获细胞Stro—1表达阳性？（2）在诱导条件下，Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积均呈阳性表达。[结论]脂肪干细胞来源广、易获取、对机体创伤小，与骨髓间充质干细胞类似，经体外诱导后可实现成骨分化，为骨组织工程提供了一种新的种子细胞：     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性及成骨诱导分化的研究

[目的]探讨成人骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养及鉴定的方法,观察其成骨分化过程中Runx2基因的动态表达以及生物学特性。[方法]取自人股骨近端骨髓标本,利用联合密度梯度离心和差异贴壁法分离骨髓间充质干细胞,体外扩增和传代培养,流式细胞仪检测细胞表面标记,诱导向成骨细胞分化,并采用RT-PCR和Western blot方法检测Runx2的动态表达。[结果]原代和传代细胞呈纺锤状外观,生长增殖能力良好,骨髓间充质干细胞的生长曲呈成"S"形,细胞表面标记物CD90阳性表达,CD34和CD45阴性表达。经定向诱导分化后,细胞分别呈现成骨细胞的表型特征,随着诱导时间的增加,Runx2的表达也明显增加,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。[结论]该方法能从人骨髓中高效分离和扩增MSCs,生物学性状稳定,具有成骨分化潜能,为骨组织工程提供理想的种子细胞,同时证实Runx2在成骨分化中起到重要的调控作用。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及体外诱导分化为成骨细胞

[目的]建立人骨髓来源的间充质干细胞( hBMSCs)分离、培养及传代的方法,观察成hBMSCs体外成骨潜能.[方法]采用全骨髓贴壁筛选法分离培养hBMSCs,流式细胞仪检测细胞表型;所得细胞第3代用含100 nmol/L地塞米松、5mmol/Lβ -甘油磷酸钠,50 μg/ml抗坏血酸的条件培养基进行骨诱导,茜素红染色鉴定.[结果]分离培养的细胞流式细胞术检测显示CD44、CD105阳性,而CD34、CD45阴性,符合MSCs特征;hBMSCs经骨诱导后可形成钙结节,茜素红染色显示阳性.[结论]全骨髓贴壁筛选法可分离获得高纯度的hBMSCs,其在体外具有成骨潜能.     

脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的：分离培养人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSC）,体外观察其生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力.方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态及生长情况;流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物;用茜素红染色和油红0染色分别鉴定其成骨成脂分化能力.结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长,呈均一梭形,具有较强的增值能力,流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73,CD105和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45;成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性;成脂诱导3周后细胞油红0染色阳性.结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力,表达间充质干细胞的表面标记,具有成骨成脂分化潜能.     

重组人骨形态发生蛋白-2质粒转染诱导人脐血间充质干细胞软骨分化研究

目的探究从人脐血中提取间充质干细胞，重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2转染干细胞并诱导其成软骨化的可能性。 方法采用密度梯度离心方法获取脐带血中细胞，依据贴壁时间不同获得间充质干细胞，流式细胞仪检测表面抗原表达鉴定细胞；然后把重组有pIRES2-EGFP-hBMP-2的质粒导入间充质干细胞，观察EGFP的表达；ELISA方法检测在不同时间收集的培养基上清中hBMP-2蛋白含量，采用免疫荧光和RT-PCR方法检测目的蛋白和基因表达。转染成功后继续培养细胞2 w，免疫组化检测细胞Ⅱ型胶原的表达和RT-PCR检测软骨特异性标志物软骨连接蛋白（CRLT1）的表达。 结果两种方法可以获取人脐血间充质干细胞，流式细胞术鉴定发现CD90、CD105、CD146高表达，CD34、CD45、Anti-HLA-DR不表达。非脂质载体包裹重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2可成功导入脐血间充质干细胞，转染率为（27.7±7.6）%。ELISA检测实验组和对照组hBMP-2的表达结果有统计学差异（t=3.355，P<0.01）。RT-PCR结果表明hBMP-2基因稳定转录，免疫荧光标记hBMP-2蛋白呈红色荧光。Ⅱ型胶原免疫组化染色示部分细胞被染成棕黄色，RT-PCR结果表明加入转染后的干细胞组CRLT1的表达量比未转染的干细胞组高（t=59.700，P<0.05）。 结论重组hBMP-2基因可以成功转染人脐血间充质干细胞并在胞内稳定表达，且有hBMP-2分泌，并可促进其表达Ⅱ型胶原蛋白及软骨连接蛋白，可向软骨细胞化诱导。     

脐血间充质干细胞的培养鉴定及成骨诱导后的免疫原性研究

目的通过观察体外培养人脐血间充质干细胞(Umbilical cord blood-mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)并作诱导成骨分化,探讨其作为组织工程的骨种子细胞的可行性。方法体外分离培养UCB-MSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达及其变化规律;体外成骨诱导UCB-MSCs2周,采用Alizarin Red染色和钙离子半定量测定的方法评价细胞成骨活性。取P2代UCB-MSCs细胞,流式细胞仪检测加入IFN-γ前后的HLA-Ι、HLA-Ⅱ、CD40、CD80等分子的表达情况;流式细胞仪检测UCB-MSCs在成骨诱导分化前后HLA-Ι类分子、HLA-Ⅱ类分子的表达情况以观察成骨诱导分化的MSCs免疫抗原性的变化。结果第1、3、5代细胞的CD29、CD105和CD166均呈阳性表达,而造血细胞系的表面标记CD31、CD34和CD45则呈低表达,且随传代次数增加含量逐渐下降。UCB-MSCs成骨诱导2周后,Alizarin Red染色为阳性。对照组则无明显钙盐沉积。钙离子半定量的检测结果则表明,UCB-MSCs成骨诱导2周后的钙离子含量远高于未诱导组。流式细胞检测结果显示,人UCB-MSCs高表达HLA-Ι类分子,不表达HLA-Ⅱ类分子和CD40,CD80等共刺激分子;经IFN-γ刺激诱导后,HLA-Ι类分子的表达未发生改变,HLA-Ⅱ类分子呈阳性表达,而CD40和CD80的表达仍为阴性。人UCB-MSCs在成骨诱导分化前后HLA-Ι类分子均为阳性表达;而HLA-Ⅱ类分子在成骨分化前为阴性,诱导后阳性表达率增高。结论①UCB-MSCs能诱导分化为成骨细胞,有望成为较理想的组织工程骨种子细胞;②成骨分化使UCB-MSCs的免疫原性发生相应变化。     

不同组织来源间充质干细胞体外成骨分化能力的比较研究

目的比较成人脂肪间充质干细胞(ASCs)、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)和成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨能力,选择优势干细胞种类作为应用于骨组织工程治疗骨缺损的种子细胞。方法采用含10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F-12培养液培养3种MSCs。取3种MSCs的P3代,通过CCK8方法检测其增殖能力;通过流式细胞仪进行鉴定;通过碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色检测骨分化蛋白ALP的分泌和矿化钙结节的沉积,并对钙结节进行定量分析;通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)方法检测骨再生相关基因的表达。结果 3种P3代MSCs在3~5d之间增殖均处于对数生长期;流式鉴定3种细胞的表面标志物阳性率:CD44、CD90和CD105均高于97%,阴性率:CD14、CD34和CD45均低于1%;ALP染色结果显示3种MSCs成骨诱导9d时,细胞内均表达ALP,茜素红染色结果显示成骨诱导18d时,均呈现较好的矿化能力,BMSCs和UC-MSCs成骨诱导后形成的钙结节无显著性差异;RT-q PCR结果显示3种MSCs成骨诱导组相比较于对照组,成骨再生相关基因Osterix、ALP、I型胶原(COL1)和骨钙素(OCN)均显著性高表达;3种MSCs成骨诱导9d时,UC-MSCs实验组的COLI基因表达显著性高于BMSCs,成骨诱导18d时,ASCs实验组的Osterix基因表达显著性高于BMSCs。结论 ASCs和UC-MSCs具有一定的成骨矿化能力,有望成为骨组织工程治疗骨缺损的种子细胞。     

人羊膜间充质细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的 观察人羊膜间充质细胞(human amnion mesenchymal cells,hAMCs)体外诱导向成骨细胞分化,为骨组织工程提供种子细胞。方法 从剖宫产后废弃的人羊膜组织分离培养hAMCs,经成骨细胞诱导条件培养基诱导后,对细胞形态特征、碱性磷酸酶、骨桥素、骨钙素表达以及I型胶原分泌进行观察和检测。结果 原代培养的hAMCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大,约5～7d传代1次。经成骨细胞诱导培养15d后,hAMCs碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥素的表达呈阳性,并且检测有I型胶原分泌。结论 hAMCs易于体外分离培养及扩增,体外成骨细胞定向诱导的hAMCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征,是良好的骨组织工程种子细胞。     

煅烧骨与诱导的MSCs复合的实验研究

目的：观察大鼠骨髓基质干细胞（MSCs）与经胶原涂层处理的煅烧骨（CCB）复合行体外培养时贴附、增殖能力的变化,探讨构建组织工程骨体外培养的最适时间。方法：制备鼠尾胶原（I型胶原）,无菌条件下,将煅烧骨置于胶原液中,2h后取出骨块,置滤网中将孔内外的胶原溶液沥干。体外培养的大鼠MSCs经矿化液诱导向成骨细胞分化。将分化后的成骨细胞滴加到涂胶原的煅烧骨块上,同时以未涂胶原的煅烧骨块为对照组。3天,7天时取材,扫描电镜下观察实验组与对照组成骨细胞在煅烧骨表面的贴附数量及形态,用细胞计数法测定细胞在两组材料的生长曲线,组织化学方法检测成骨细胞的ALP活性。结果：扫描电镜发现实验组成骨细胞的贴附数量显著高于对照组（P〈0．01）。细胞计数认为实验组细胞在材料上粘附数量多,增殖速度快。实验组ALP活性明显高于对照组（P〈0．01）。结论：胶原修饰的煅烧骨具有良好的组织相容性,能明显提高成骨细胞的贴附,并且促进成骨细胞活性维持,体外培养7～8天时,材料上的细胞数达到最大,应尽快植入体内。     

重组人骨形成蛋白2与骨诱导剂对大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的观察重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein2,rhBMP-2)与骨诱导剂对SD大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的增殖与成骨作用。方法体外培养大鼠MSCs,分为实验组与对照组。对照组:不加rhBMP-2与骨诱导剂。实验组:骨诱导剂单独作用于SD大鼠MSCs(A组);rhBMP-2分别以浓度为10(B组)、50(C组)、100(D组)、200μg/L(E组)单独作用于SD大鼠MSCs;rhBMP-2分别以浓度为10(F组)、50(G组)、100(H组)、200μg/L(I组)联合骨诱导剂作用于SD大鼠MSCs。测定第3、6、9、12天的增殖状况(MTT法)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和骨钙素(osteocalcin,OC)水平。结果倒置相差显微镜观察SD大鼠MSCs原代培养时,细胞接种12h后即可贴壁;48h细胞成梭形,形似成纤维细胞;4d时细胞为多角形、纺锤形;6d时,成纤维细胞散在分布,少量呈集落样生长,为漩涡状、放射状排列;10d左右,细胞基本铺满瓶底,融合成片。传代细胞5~7d即可长满瓶底。各时间点A~I组均能显著促进MSCs成骨活性(ALP和OC)的表达。B~E组同时具有促进MSCs增殖作用,并呈浓度依赖性;F~I组增殖及ALP、OC含量均高于A~E组,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论rhBMP-2与骨诱导剂联合作用可在促进MSCs增殖的同时提高其成骨活性。     

GFP转基因鼠肌卫星细胞系的构建及基因介导成骨分化的实验研究

目的 评价肌卫星细胞(Muscle satellite cells,MSCs)体内外成骨分化的能力,探讨肌卫星细胞作为骨组织工程新的种子细胞的可能性.方法 取新生绿色荧光蛋白转基因小鼠颌面部肌肉,采用酶消化法分离出MSCs,体外原代及传代培养,经腺病毒介导的人骨形成蛋白2(Ad-BMP2)基因转染后,行成骨细胞标志物的活性检测及细胞化学染色,并进行细胞体外矿化及体内成骨的检测.结果 转染后细胞碱性磷酸酶(ALP)组织化学染色呈阳性;骨钙素(OC)免疫细胞化学染色呈阳性且OC活性增强(p＜0.05);21天后见钙结节形成;转染后的细胞与材料复合物植入裸鼠后肢肌肉内,4周后见骨组织形成.结论 体外培养的肌卫星细胞体内外可以成骨分化,可以成为骨组织工程的新的种子细胞.     

Dexamethasone modulates BMP‐2 effects on mesenchymal stem cells in vitro

Dexamethasone/ascorbic acid/glycerolphosphate (DAG) and bone morphogenic protein (BMP)‐2 are potent agents in cell proliferation and differentiation pathways. This study investigates the in vitro interactions between dexamethasone and BMP‐2 for an osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs). Bone marrow‐derived human MSCs were cultured with DAG (group A), BMP‐2 + DAG (group B), and DAG + BMP‐2 combined with a porous collagen I/III scaffold (group C). RT‐PCR, ELISA, immuncytochemical stainings and flow cytometry analysis served to evaluate the osteogenic‐promoting potency of each of the above conditions in terms of cell morphology/viability, antigen presentation, and gene expression. DAG induced collagen I secretion from MSCs, which was further increased by the combination of DAG + BMP‐2. In comparison, the collagen scaffold and the control samples showed no significant influence on collagen I secretion of MSCs. DAG stimulation of MSCs led also to a steady but not significant increase of BMP‐2 level. A DAG and more, a DAG + BMP‐2, stimulation increased the number of mesenchymal cells (CD105+/CD73+). All samples showed mRNA of ALP, osteopontin, Runx2, Twist 1 and 2, Notch‐1/2, osteonectin, osteocalcin, BSP, and collagen‐A1 after 28 days of in vitro culture. Culture media of all samples showed a decrease in Ca²⁺ and PO concentration, whereas a collagen‐I‐peak only occurred at day 28 in DAG‐ and DAG + BMP‐2‐stimulated bone marrow cells. In conclusion, BMP‐2 enhances DAG‐induced osteogenic differentiation in mesenchymal bone marrow cells. Both agents interact in various ways and can modify osteoblastic bone formation. © 2008 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 26:1440–1448, 2008     

骨折后外周血间充质干细胞浓度变化的实验研究

[目的]观察骨折后不同时间点外周血间充质干细胞(MSCs)浓度变化,并比较其与骨髓间充质干细胞生物学特性的异同.[方法]根据不同处理条件将SD大鼠分为:对照组和骨折组(骨折后1、3、7d共3组),每组20只.分别于骨折后1、3、7d抽取外周血,密度梯度离心法分离培养外周血MSCs,计数成纤维细胞集落形成单位(CFU-Fs)数.流式细胞仪检测细胞表面标记(CD44、CD90、CD34、CD45).成骨、成脂诱导,碱性磷酸酶、茜素红和油红染色检测其分化特性.[结果]原代外周血MSCs呈集落生长,骨折组集落数明显多于对照组,其中以骨折后3d组形成的集落数最多,具有显著差异(27.25±11.52 CFU-Fs/cuhure vs 2.80±3.96 CFU-Fs/culture,P＜0.01).外周血MSCs高表达CD44、CD90,低表达CD34、CD45,不同的是CD34小部分呈阳性(＜20％).与对照组骨髓MSCs的诱导结果相同,外周血MSCs成骨诱导后28 d出现钙结节,茜素红染色阳性;成脂诱导后21 d有大量脂滴出现,油红染色阳性.[结论]外周血体外密度梯度离心法分离培养的细胞具有多潜能分化的MSCs表面标记且可以向成骨、成脂分化.骨折后外周循环中MSCs数量明显增多,呈一定的时序性变化,可能参与骨折修复.     

体外诱导家猪骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的观察家猪骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)在体外诱导条件下成骨分化的特征及相关基因的表达。方法选取3月龄雌性长白猪6头,无菌条件下于胫骨近端抽取骨髓15ml。采用密度梯度离心法并根据细胞贴壁特性对MSCs进行分离、纯化,倒置相差显微镜观察原代细胞生长情况,于培养第7天计算MSCs百分比含量及群体倍增值。将第1代细胞置于含1×10-8mmol/L地塞米松(dexamethasone,Dex)、10mmol/Lβ-磷酸甘油(β-glycerophosphate,β-GP)和82μg/ml抗坏血酸(ascorbic acid,Asc)的成骨诱导培养液中培养21d,作为实验组;DMEM培养液中培养作为对照组。分别行细胞形态学观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)组织化学染色、钙沉积和细胞增殖测定,采用实时定量PCR分析成骨分化的相关基因表达。结果原代MSCs特征:培养第1天,有核细胞大部分由悬浮的圆形血源性细胞组成;第3天换液弃除非贴壁细胞,MSCs克隆开始形成,细胞呈成纤维细胞样生长;第7天,镜下观察到大小不一的克隆。细胞在培养后12～14d基本长满,原代细胞群体倍增值平均为13。MSCs成骨分化:诱导培养14d实验组细胞形态由成纤维细胞样变成立方体样,而对照组细胞始终保持成纤维细胞样。培养5d,对照组细胞计数为11723±4040,实验组为10276±5513,二者差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,实验组诱导培养14d,ALP染色呈强阳性,21d钙沉积明显增加(P<0.01)。实验组MSCs成骨相关基因:核心结合因子α1(corebinding factorα1,Cbfα1)、osterix、ALP、型胶原、骨连接素(osteonectin,ON)、骨钙素(osteocalcin,OC)表达逐渐增强;Cbfα1、ALP、ON在分化早期增加明显;与第7天比较,第21天osterix和OC基因表达明显上调(P<0.05);第14天,型胶原表达也上调(P<0.05)。结论密度梯度离心法分离的猪MSCs,在体外诱导条件下能通过上调分化特异基因表达向成骨细胞分化。     

骨形成蛋白2活性多肽体外定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的剂量依赖性研究

目的探讨自行合成的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)活性多肽对大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)体外定向诱导成骨的能力,评价BMP-2活性多肽的成骨诱导性及诱导成骨的剂量依赖性。方法取4周龄Wistar大鼠分离培养MSCs,传至第3代时改用条件培养基,培养基中分别加入浓度为300、200、100、50及0μg/ml的BMP-2活性多肽,并依次记为A、B、C、D和E组。细胞培养至5、10、15及20d,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,测定钙含量,采用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitativePCR,FQ-PCR)检测型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及骨钙素(osteocalcin,OCN)mRNA的表达,检测不同浓度BMP-2活性多肽体外诱导成骨的能力。结果倒置相差显微镜下观察,用条件培养基培养3～4d后,培养细胞由长梭形转变为短梭形或多角形。随条件培养基中BMP-2活性多肽浓度的增加,细胞发生成骨样改变的时间提前。ALP活性和钙含量检测显示,A组和B组较其他组增加明显,且差异有统计学意义(P<0.05),但A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。FQ-PCR检测发现不同浓度条件培养基培养14d后,型胶原、OPN和OCN mRNA在各组均有表达。Ct值表明其表达量的大小顺序为A、B、C、D组,E组无表达,A组和B组的Ct值明显大于C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05),但A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论BMP-2活性多肽能有效地促进MSCs向成骨方向分化,其诱导作用存在剂量依赖关系,最佳诱导剂量为200μg/ml。     

补肾方剂拮抗地塞米松促骨髓基质细胞向成脂细胞分化的实验研究

目的观察补肾方剂对地塞米松促骨髓基质干细胞成脂作用的影响。方法从成年SD大鼠分离出骨髓基质干细胞体外培养,取第三代细胞用于实验。分别在培养液其中加入1×10^-7mol·L^-1的地塞米松（A组）、1×10^-7mol·L^-1的地塞米松和80mg·L^-1的补肾方剂（B组）,C组为对照组。分别应用MTT、碱性磷酸酶活性与三酰甘油含量法检测MSCs增殖与分别向成骨和成脂方向分化的能力。结果实验组（A组和B组）的MSCs增殖能力较对照组明显降低（P〈0.05）,但A组与B组之间差异无显著意义（P〉0.05）;B组MSCs硷性磷酸酶活性较A组增高（P〈0.05）,而三酰甘油含量低于A组（P〈0.05）。结论补肾方剂不能干预地塞米松对MSCs增殖的抑制作用,但具有抑制地塞米松促进MSCs向成脂方向分化的作用。