AQP1在维甲酸诱导红白血病细胞红系分化中的作用

目的建立稳定抑制水通道蛋白1（AQP1）表达的K562细胞株,探讨AQP1在维甲酸（RA）诱导红白血病细胞红系分化中
的作用。方法RA处理K562细胞,通过real-time PCR法检测γ-珠蛋白表达和分光光度法检测血红蛋白的含量研究RA对K562
细胞红系分化的影响。Real-time PCR法、蛋白质印迹法检测RA诱导后K562细胞AQP1转录和蛋白表达水平的变化。设计特
异AQP1shRNA序列,构建pSUPER-retro-puro重组质粒转染K562细胞,筛选建立稳定抑制AQP1基因表达的K562细胞株
（K562-shAQP1）;通过比较K562-shAQP1细胞株与对照组细胞在维甲酸诱导后γ-珠蛋白和血红蛋白的表达,研究AQP1在维甲
酸诱导K562细胞红系分化中的作用。结果RA处理K562细胞后红系分化指标γ-珠蛋白和血红蛋白的表达均明显增加,同时
AQP1mRNA及蛋白表达随RA作用时间显著增加（P<0.01）。pSUPER-retro-puro-shAQP1干扰载体转染K562细胞后AQP1基
因在转录和蛋白水平上的表达均被抑制,差异有统计学意义（P<0.01）;K562-shAQP1细胞与对照K562细胞相比,在RA诱导后
γ-珠蛋白和血红蛋白表达受到不同程度的抑制,差异有统计学意义（P<0.01）。结论RA诱导K562细胞红系分化后AQP1表达
显著增加,而抑制AQP1基因的表达可部分阻断RA诱导红系分化的作用,说明AQP1在RA诱导K562细胞红系分化过程中发
挥重要作用。
     

β-arrestin1激活JNK信号通路促进慢性髓细胞白血病细胞K562增殖

目的以CML K562细胞为研究对象,探索β-arrestin1促进CML细胞增殖的相关信号通路。方法以β-arrestin1慢病毒载
体感染CML K562细胞,形成稳定的K562-siβ1和K562-β1细胞,及非特异性siRNA对照K562-Ctrl细胞。以此为研究对象,利
用细胞计数与CCK-8实验检测细胞增殖能力;Western blot检测蛋白表达;免疫共沉淀（Co-IP）实验检测蛋白间的相互作用。结
果细胞计数与CCK-8 实验结果显示K562-β1 细胞增殖与细胞存活率能力显著高于K562-Ctrl,而K562-siβ1 显著低于
K562-Ctrl。Western blot结果表明β-arrestin1特异性增强磷酸化JNK表达,JNK抑制剂SP600125能抑制p-JNK表达和K562细
胞增殖;免疫共沉淀实验表明β-arrestin1 能与Src 结合。结论CML K562 细胞中β-arrestin1 与Src 结合,促进JNK信号通路激
活,从而促进细胞增殖。
     

K562细胞红系诱导分化方法的实验研究

目的建立一种高效K562细胞红系诱导分化方法。方法比较不同方法对K562细胞红系诱导分化的效果,优化诱导剂成分组合和剂量组合,建立一种高效的红系诱导,鉴定指标选用细胞形态学、联苯胺染色阳性率计数及RT-PCR测定红系细胞标志物膜带3蛋白(band3)的表达。结果多因素协同诱导K562细胞红系分化120 h后,显微镜下观察细胞形态呈红系中、晚期特征,联苯胺染色阳性率可达(52.7±8.2)%,红系标志物band3在mRNA水平明显高于对照组(P<0.01)。结论多条信号途径协同参与K562细胞红系分化的过程,多因素共同诱导可显著提高K562细胞的红系分化。     

K562细胞红系分化过程中miR-451表达的变化

目的:观察K562细胞红系分化过程中miR-451表达的变化,探讨miR-451在红细胞(RBC)形成过程中的作用.方法:应用Northern印迹法分析小鼠不同组织细胞(肝、骨髓、红细胞、白细胞)及人RBC、鸡RBC中miR-451的表达情况.采用氯高铁血红素(hemin,50 μmol/L)诱导K562细胞红系分化,诱导36 h后应用联苯胺染色及血红蛋白mRNA RT-PCR鉴定K562细胞红系分化结果,采用Northern印迹法及茎环RT-PCR分析K562细胞经hemin诱导不同时间点(24、48、72、96 h)miR-451表达的变化.结果:除红细胞外,小鼠白细胞、肝脏及骨髓Northern印迹均未检测到miR-451表达;人RBC及具有细胞核的鸡RBC亦检测到miR-451表达.小鼠及人RBC检测到2种miR-451,发现了1条较Sanger中心报道的序列3′端多1个尿嘧啶的miR-451序列.50 μmol/L hemin诱导后K562细胞出现红系分化,与诱导前相比,诱导36 h后联苯胺染色阳性细胞增多(P＜0.05),γ、δ及ε血红蛋白表达增加(P＜0.05).Northern印迹未能检测到K562细胞诱导前后miR-451表达变化,但更敏感的茎环RT-PCR分析显示,诱导前K562细胞本身低丰度表达miR-451,hemin诱导24 h后,miR-451表达丰度开始增加,随着血红蛋白(δ-globin)表达增加,miR-451表达进一步增加,72 h达高峰.结论:miR-451是红系分化终末特异高表达的miRNA,在人及小鼠RBC中均存在相差1个碱基的2种序列,其在K562细胞红系分化过程中表达升高.     

三七总皂苷对K562细胞增殖、凋亡及周期的影响及机制

目的研究三七总皂苷（PNS）对K562 细胞增殖、凋亡、周期的影响及其相关分子机制。方法采用MTT法检测PNS对
K562细胞增殖的影响;AO/EB双荧光染色法及Annexin V-FITC/PI双染色法观察细胞凋亡及死亡状况;流式细胞术检测K562
细胞的周期变化;RT-PCR检测mTOR信号通路主要分子mRNA的表达变化;Western blot 检测cleaved caspase-3 蛋白、cyclin
D1蛋白及mTOR信号通路主要蛋白及磷酸化蛋白的表达量变化。结果100~800 μg/mL的PNS 作用于K562细胞后能够抑制
细胞增殖。PNS能够上调cleaved caspase-3蛋白表达,促使K562细胞发生凋亡。并且下调cyclin D1蛋白表达,促使K562细胞
阻滞在G0/G1期。同时,PNS 能够抑制K562 细胞mTOR mRNA 表达,降低mTOR 蛋白和磷酸化蛋白p-mTOR（Ser2448）、
p-p70S6K（Thr229/389）及p-4E-BP1（Thr37/46）的表达,从而抑制mTOR信号通路活性。结论PNS 对体外培养K562细胞有抑
制增殖,促进凋亡,使其发生周期阻滞的作用。其机制可能与PNS抑制mTOR信号通路活性、上调cleaved caspase-3蛋白表达
及抑制cyclin D1蛋白表达有关。
     

吲哚美辛对K562细胞株BCR/ABL-Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的探讨吲哚美辛对K562细胞增殖的影响及其分子机制。方法采用不同浓度的吲哚美辛作用于K562细胞,MTT法
检测其对细胞增殖的影响,克隆形成实验检测吲哚美辛对K562细胞克隆形成能力的影响。RT-PCR分别检测bcr-abl、β-catenin
的mRNA表达变化,Western blot分别检测pBCR/ABL、总BCR/ABL、β-catenin、pGSK-3β、c-myc的蛋白表达变化。结果100、
200、400 μmol/L吲哚美辛作用细胞48 h后,以浓度依赖性方式抑制K562细胞的增殖和克隆形成能力。3种浓度的吲哚美辛处
理K562细胞后,pBCR/ABL、总BCR/ABL的蛋白表达依次减少,而bcr-abl mRNA水平没有明显变化。β-catenin mRNA和蛋白
水平依次减少;pGSK-3β、c-myc 的蛋白水平均明显降低。结论吲哚美辛可通过抑制BCR/ABL-Wnt/β-catenin 信号通路的活
性,从而抑制白血病K562细胞的增殖和克隆形成能力。
     

PPARγ通路对模拟微重力条件下大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）通路对模拟微重力条件下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）向成骨细胞
分化的影响,并通过调节PPARγ信号通路开闭影响这一分化过程。方法以大鼠BMSCs作对象,以回转器模拟微重力效应。
将细胞随机分为5组,包括实验组：模拟微重力组、模拟微重力+10 μmol/L吡格列酮组、模拟微重力+10 μmol/L GW9662组、模
拟微重力+10 μmol/L吡格列酮+10 μmol/L GW9662组;对照组：正常重力组。体外成骨诱导14 d后,利用茜素红进行成骨结节
染色、油红-O进行脂肪细胞染色,并计算成脂率;测定各组细胞ALP活性;利用RT-PCR技术检测各组细胞PPARγmRNA表达水
平。结果吡格列酮明显抑制BMSCs向成骨细胞分化,GW9662通过抑制PPARγ的激活而增加BMSCs向成骨细胞分化。结
论推测PPARγ信号通路的激活是模拟微重力条件下抑制BMSCs向成骨细胞分化的主要因素之一,而通过抑制这条通路的激
活可以有效预防及治疗失重导致的骨质疏松症。
     

SHP1基因诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡及红系分化

目的探讨SHP1基因在诱导K562细胞凋亡及红系分化中的作用。方法应用RT-PCR法克隆SHP1基因全长cDNA序列并克隆于真核表达载体pcDNA3.0,脂质体转染使其基因在K562细胞中过表达。Hoechst33258染色和FACS(AnnexinⅤ-PI双标)分析检测转基因后K562细胞凋亡;联苯胺蓝染色和血型糖蛋白A(GPA)表达检测分析细胞分化情况。结果 pcDNA3-SHP1转染K562细胞,RT-PCR、蛋白免疫印迹分析证实SHP1在K562细胞中表达。转染48h后,K562细胞出现凋亡,AnnexinⅤ-PI双标FACS分析细胞凋亡率为16.84%,与转染空载体pcDNA3.0(6.23%)相比差异有统计学意义(P=0.000)。联苯胺蓝染色细胞阳性率14.67%,GPA表达率19.38%,与转染空载体组比较差异也有统计学意义(P=0.005)。结论 SHP1能有效地诱导K562细胞凋亡与红系分化。     

蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B真核载体的构建及对K562细胞的影响

目的初步研究作为p210负性调控物的PTP1B,探讨其对K562细胞凋亡、红系分化的影响。方法应用RT-PCR法克隆PIP1B全长cDNA序列并定向亚克隆于真核表达载体pcDNA3.0,应用脂质体转染技术使PTP1B在K562细胞中过表达。结果PTP1B在K562细胞中出现超表达并具有较高PIP活性。转染48 h后,K562 细胞凋亡不明显,Annexin V-PI双标后FAcs分析细胞凋亡率为7.54%,与转染空载体(6.44%)相比,差异无显著性。PTP1B基因转染后细胞出现明显红系分化,联苯胺染色细胞阳性率(28.67±1.25)%,GPA表达率为43.15%, 与转染空载体组(3.34±1.25)%和12.88%比较显著提高。结论应用RT-PCR法可以成功克隆出PTP1B基因全长cDNA序列,脂质体法能有效地将pcDNA3-PTP1B转入K562细胞并表达。PTP1B能诱导K562细胞出现明显红系分化,但对细胞的凋亡无明显影响。     

外源性Wnt5a激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca2+信号途径研究

目的 观察外源性Wat5a对K562细胞非经典WntSa/Ca2 途径的影响,进一步研究外源性Wnt5a诱导K562细胞的分化机制.方法 激光共聚焦显微镜观察Ca2 内流的变化,以RT-PCR及免疫组化检测β-catenin的表达变化,以Western blot检测cyclin D1的表达变化.结果 外源性Wnt5a能明显促进K562细胞Ca2 内流,显著下调cyclin D1表达,且能下调K562细胞β-catenin表达,但β-catenin表达下调无统计学意义.结论 外源性Wnt5a能激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca2 途径,外源性Wnt5a诱导K562细胞分化机制可能与此相关.     

急性髓系白血病CDX2和β-catenin基因表达的相关性

目的研究急性髓系白血病（AML）患者CDX2与β-catenin基因表达的相关性。方法实时定量PCR方法检测92例初诊
AML、30例非恶性血液病患者（对照）CDX2及β-catenin mRNA表达,Western blot检测其中的26例AML、8例非恶性血液病患
者CDX2、β-catenin蛋白表达。结果AML组CDX2 mRNA和蛋白表达阳性率分别为84.78%和76.92%,对照组未检测到表达
（P<0.01）;β-catenin mRNA和蛋白在两组均表达,但AML组显著高于对照组（P<0.01）。CDX2、β-catenin mRNA表达均与初诊
时白细胞数、LDH水平呈正相关（P<0.01）。AML患者获得完全缓解时,CDX2 mRNA转阴、β-catenin mRNA表达显著下降,复
发时两者均增高。AML患者CDX2与β-catenin无论在mRNA和蛋白水平表达均呈显著正相关（P<0.01）。结论AML患者存
在CDX2基因过表达及Wnt/β-catenin信号通路激活,且CDX2与β-catenin表达呈显著正相关。
     

模拟微重力抑制CD34＋细胞向红系分化的实验研究

目的探讨模拟微重力对CD34＋细胞分化的影响及其调控机制。方法在旋转细胞培养系统（RCCS）模拟微重力和正常重力条件下培养CD34＋细胞,流式细胞仪检测各组细胞的系特异性抗原比例,考察CD34＋细胞分化的改变。同时,进行PI细胞凋亡染色检测,考察细胞凋亡情况。另外,采用实时荧光定量PCR检测短期培养中流式分选出的CD34＋细胞中的转录因子GATA-1mRNA的表达。结果GlyA＋在RCCS组中和l-g液态对照组的表达量分别是（22．21±3．02）％和（60．05＋3．08）％;CD33’在RCCS＋组和1-g液态组中的表达量分别为（52．12±1．92）％和（18,87±1．41）％,差异均有统计学意义（P〈0．05）。1-g液态对照组和1-g甲纤组的分化比例（GIyA＋％=54,39％±2．86％,CD33＋％=21．09％±3．19％）相似,差异无统计学意义。各组凋亡比例均在1％以下。实验组中的GATA-1mRNA的相对表达量约是对照组表达量的20％。结论模拟微重力抑制CD34＋细胞向各系血细胞的分化,尤其抑制其向红系细胞的分化。红系分化调控转录因子GATA-1mRNA下降,推测其可能是模拟微重力导致红系分化减少的原因之一。     

模拟失重致心肌细胞凋亡及其相关机制探讨

目的探讨模拟失重对体外培养大鼠心肌细胞凋亡的影响及其可能的调控机制。方法以原代培养的新生大鼠心肌细胞为研究对象,以细胞回转器模拟失重效应,通过RT-PCR检测心肌细胞凋亡相关分子c-myc mRNA在模拟失重后的变化,以western blot观察模拟失重96 h对心肌细胞c-myc和转录因子GATA-4和MEF2A蛋白表达的影响。结果与对照组相比,模拟失重可致心肌细胞凋亡相关分子c-myc mRNA及蛋白表达显著升高（P〈0.05）,而转录因子GATA-4和MEF2A蛋白表达显著降低（P〈0.05）。结论回转器模拟失重96 h可致心肌细胞的凋亡表达增加,其机制可能与转录因子GATA-4和MEF2A表达降低有关。     

鳖甲煎丸对肝细胞癌中Wnt/β-catenin信号通路及抑制基因DKK-1、FrpHe表达的影响

目的通过研究鳖甲煎丸对肝细胞癌中Wnt 信号通路及抑制基因DKK-1、FrpHe 表达的影响,探讨其抗肝细胞癌转移
侵袭的作用机制与Wnt/β-catenin 信号通路的关系。方法24 只Wistar 大鼠随机分为3 组（8 只/组）,分别以临床剂量的20 倍、
10 倍的鳖甲煎丸和生理盐水灌胃3 d,3 d 后采血,离心,获取血清。分别将3 组血清加入DMEM培养液中培养肝癌细胞
HepG2,48 h 后采用流式细胞术检测细胞中的β-catenin 蛋白含量,qRT-PCR法检测DKK-1、FrpHe基因的表达情况,以进一步
阐明药物的作用机制与Wnt/β-catenin 信号通路的关系。结果流式细胞术结果：高剂量组和中剂量组含药血清均可显著降
低细胞中β-catenin 蛋白表达,且该作用与药物浓度有关。RT-PCR结果：高剂量组和中剂量组含药血清均可显著下调DKK-1
基因的表达,且该作用与药物浓度有关。而高剂量组和中剂量组含药血清对FrpHe 基因的表达影响不明显。结论鳖甲煎
丸能显著抑制肝细胞癌的生长、粘附和转移,且这种抑制作用与显著降低肝癌细胞中β-catenin 蛋白表达、显著下调DKK-1 基
因的表达,从而阻断Wnt/β-catenin 信号通路有关。
     

高糖环境对肝星状细胞TLR4表达及脂多糖诱导的炎症因子表达的影响

目的研究高糖环境对肝星状细胞Toll样受体4(TLR4)表达及脂多糖（LPS）诱导的炎症因子表达的影响。方法体外培养
大鼠肝星状细胞株HSC-T6,采用高糖刺激,Western blot及RT-PCR检测细胞TLR4蛋白及mRNA表达;低糖或高糖培养基预处
理肝星状细胞24 h 后采用LPS（100 ng/ml）刺激,2 h 后Western blot 检测NF-κB核转位,24 h 后RT-PCR 检测MCP-1 和IL-6
mRNA表达,ELISA检测细胞上清两种炎症因子的浓度。结果高糖环境可上调肝星状细胞TLR4 蛋白及mRNA表达（均为P<
0.01）,且呈明显的时效-量效关系。高糖可促进肝星状细胞NF-κB核转位（P<0.01）,并促进MCP-1和IL-6表达及分泌（均为P<
0.01）。高糖预处理可增强LPS诱导的肝星状细胞NF-κB核转位（P<0.01）、MCP-1和IL-6表达及分泌（均为P<0.01）。结论高
糖可上调肝星状细胞TLR4的表达,并可促进脂多糖激活NF-κB而增加炎症因子表达及分泌。
     

慢病毒介导ACE2过表达对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肝细胞的白蛋白表达及迁移能力的影响

目的探讨血管紧张素转换酶2（Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2）过表达对血管紧张素Ⅱ（Angiotensin II, Ang
Ⅱ）诱导的肝细胞白蛋白表达下调及细胞迁移性增强的抑制作用。方法常规培养大鼠肝细胞系BRL-3A细胞株,予以Ang II
（10-7 mol/L）进行刺激,观察不同处理时间（24、48 h）组肝细胞内白蛋白、波形蛋白（vimentin）表达及细胞迁移性的改变;通过构
建lentiACE2慢病毒载体,建立稳定过表达ACE2的细胞系,并分别用AngⅡ、A779进行干预,观察肝细胞内相应蛋白表达及其
迁移性的改变。采用细胞免疫荧光、Western blot检测细胞中蛋白水平变化;Transwell迁移实验观察不同处理组细胞迁移能力
的改变。结果AngⅡ处理组肝细胞内vimentin表达显著增加、albumin表达减低,细胞迁移能力显著增强,并具有时间依赖效
应。ACE2 过表达大鼠肝细胞albumin 表达明显升高,vimentin 蛋白表达下降,该作用被MAS受体抑制剂A779 阻断。同时
ACE2过表达显著抑制AngⅡ的作用,vimentin合成显著下降,albumin表达水平显著升高,细胞迁移能力受到抑制。结论ACE2
过表达可抑制AngⅡ诱导的肝细胞albumin表达下调及迁移能力增强。