幽门螺杆菌napA基因的克隆及生物信息学分析

[目的]获取幽门螺杆菌NCTC11639中性粒细胞激活蛋白基因（napA），预测其编码蛋白作为幽门螺杆菌疫苗候选抗原的可行性，为耶疫苗研制奠定基础。[方法]提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA，参照GeneBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR扩增napA基因，克隆入pMD18-T载体中，对重组质粒测序后进行生物信息学分析。[结果]克隆的napA基因全长为435bp，在GenBank上登录（No．DQ341279），与Gen-Bank公布的其它Hp菌株的核酸同源性为94％～98％，与国际测序模式株Hp26695、HpJ99同源性达97％。[结论]成功扩增Hp标准株NCTC 11639 napA基因，通过同源性检索分析表明Hp与人及其它哺乳动物的基因组DNA同源序列低，在不同耶菌株中高度保守，符合疫苗候选抗原的基本特征；抗原表位预测显示有4条高抗原性肽段，其中118-140肽段抗原指数最强，可能存在良好的抗原表位，结合Hp-NAP二级结构、亲水性分析认为Hp—NAP是很有前景的幽门螺杆菌疫苗候选抗原。     

幽门螺杆菌cagA基因对胃癌细胞影响

目的观察幽门螺杆菌（Hp）野生株与cagA基因同源缺失突变株对人胃癌细胞株BGC823的细胞增殖和凋亡的影响,探讨与Hp毒力基因cagA相关的细胞水平的毒性效应。方法将幽门螺杆菌野生株与cagA基因缺失突变株与BGC823细胞共培养,分别在6,12,24和48 h观察细胞形态学变化,采用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果野生株和突变株Hp攻击BGC823细胞6 h,即可引起细胞的形态学变化,48 h时均可观察到细胞形态呈分散及蜂鸟样改变（细胞拉伸）。MTT法检测显示,野生株对BGC823细胞增殖具有抑制作用,而缺失cagA基因的突变株可刺激细胞增殖,且在24,48 h的2个时间点上均高于对照组和野生株组（P〈0.05）。流式细胞分析显示,在攻击BGC823细胞48 h后,野生株和突变株均可引起细胞凋亡,凋亡率高于对照组（P〈0.05）,2个实验组的凋亡率差异无统计学意义。结论Hp作用后细胞呈分散和蜂鸟样改变（伸长）并不是cagA基因特有的细胞学效应;cagA基因是Hp抑制细胞增值所必需的元素;cagA基因的有无对Hp致凋亡效应的影响不大,在Hp致细胞凋亡的效应中作用可能有限。     

球形幽门螺杆菌vacA基因表达质粒构建及表达

目的构建球形幽门螺杆菌vacA基因的重组表达质粒,初步观察其在E.coli中的表达。方法采用亚克隆技术,用BamHⅠ和SacⅠ从重组质粒pMD-18T-vacA上切下vacA基因,插入表达载体pET32a（＋）质粒,转化大肠埃希菌BL21,在氨苄青霉素阳性的LB平板上筛选阳性重组子,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET32a（＋）-vacA转化大肠埃希菌,（IPTG）诱导表达后进行（SDS-PAGE）电泳和凝胶扫描定量分析。结果重组质粒酶切和PCR鉴定与预期结果相符,成功构建携带vacA基因的重组原核表达质粒pET32a（＋）-vacA。核酸序列测定及同源性分析证实,表达质粒pET32a（＋）-cagA中所含vacA基因与GenBank中的vacA序列同源性达到99.2%。vacA基因在大肠埃希菌中诱导表达后获得约156 kD蛋白,蛋白含量占全菌体蛋白含量15.5%。结论成功构建球形H.pylori vacA基因重组表达质粒,并获得高效表达,为研究该基因蛋白的生物学特性及DNA疫苗研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌超氧化物歧化酶基因克隆及表达

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种可长期定植于人类胃粘膜的革兰阴性螺旋形微需氧菌,是慢性活动性胃炎的病原体。Hp感染是消化性溃疡、胃癌和胃粘膜相关淋巴组织瘤的重要危险因素^〔1〕。研究发现,Hp中超氧化物歧化酶(SOD)基因可能与细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associated gene A,CagA)存在着密切关系^〔2〕,而CagA是Hp重要的毒力因子之一^〔3-5〕。因此,本实验进行体外扩增sod基因并诱导表达、纯化SOD蛋白,为进一步研究sod基因、SOD蛋白在Hp致病中的作用提供参考依据。     

幽门螺杆菌感染对胃癌组织中Fas基因蛋白表达的影响

目的研究幽门螺杆菌(Hp)感染对胃癌组织细胞凋亡的影响,探讨Hp在胃癌发生、发展中的作用.方法用Warrthin-Starry染色法检测胃癌组织中Hp,以流式细胞学方法测定胃癌组织Fas基因蛋白的表达.结果正常胃组织中Fas表达阳性率为12.05%±3.59%,胃癌组织中Fas表达明显低于正常胃粘膜,Hp阳性癌组织低于阴性癌组织;Fas基因表达不与肿瘤的分化程度有关.结论Hp在胃癌的发生发展过程中对细胞的增殖影响较小,主要通过减弱细胞凋亡而起作用.     

细胞壁缺陷幽门螺杆菌尿素酶基因活性检测

目的 了解细胞壁缺陷变异对幽门螺杆菌尿素酶活性及其基因的影响.方法 用抗生素诱导幽门螺杆菌稳定L型(HPL)并分离培养,检测幽门螺杆菌及其稳定L型的尿素酶活性,并对HPL型及其亲代细菌型进行尿素酶结构基因UreA和UreB基因的PCR检测.结果 幽门螺杆菌可在头孢曲松钠作用下发生细胞壁缺陷变异,经传代培养可获得稳定L型的纯培养物;幽门螺杆菌尿素酶试验阳性,稳定L型的尿素酶试验则为阴性;L型及亲代细菌型UreA和UreB基因的PCR检测均可见分子量分别为400和200 bp的扩增产物.结论 幽门螺杆菌在抗生素作用下可发生细胞壁缺陷变异成为L型;幽门螺杆菌L型仍然保留UreA和UreB基因.     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌分离株iceA基因克隆及序列分析

目的 克隆幽门螺杆菌中国郑州市慢性萎缩性胃炎患者分离株MEL-Hp27iceA基因,测序后对其进行序列分析。方法 根据iceA基因上下游基因序列设计引物,PCR扩增iceA基因,并将其连接至pMD19-T载体,测序后采用相关数据库和生物信息学软件对基因序列进行分析。结果 成功克隆幽门螺杆菌Hp27菌株iceA基因序列,扩增产物大小约为790 bp;重组质粒pMD19-T-iceA单酶切产生3 820 bp片段,双酶切产生3 000和820 bp的2个片段;Hp27iceA基因与大多数美国来源菌株同源性>85%,与日本、印度等地区来源菌株同源性<70%。序列分析结果表明,所克隆到的基因为iceA2亚型,与美国株Alaska strain 219、Alaska strain 213关系最近,同源性分别为87%和95%,与芬兰株Finland strain 9496等菌株存在聚类关系,同源性88%～93%,与CR9等其他菌株距离较远。结论 成功克隆幽门螺杆菌Hp27菌株iceA基因序列;不同地区幽门螺杆菌分离株的iceA基因间存在着一定差异。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的 构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据.方法 提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定.结果 扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中.结论 成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL.     

psiRNA—hHDEK的构建及其对CasKi细胞生物学特性影响的研究

目的观察DEK基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖、细胞周期及凋亡、衰老的影响,为探索防治人类宫颈癌的新方法提供依据。方法根据siRNA设计原则和Genebank中DEK核苷酸序列,利用软件设计出针对DEK位点的特异性小干扰RNA,克隆至siRNA真核表达载体psiRNA-hHlneo中,应用脂质体介导重组质粒转染宫颈癌CaSki细胞株,用RT-PCR和Western blot检测转染后DEKmRNA和蛋白表达,转染后48hMTr法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期改变、SA-β-半乳糖苷酶细胞化学染色鉴定细胞衰老。结果转染质粒psiRNA—hHDEK组DEKm RNA及蛋白的表达明显减少（0．28±0．02）,DEK基因沉默后CaSki细胞增殖能力下降,细胞周期阻抑,细胞凋亡率增加,衰老细胞增多。结论成功构建表达DEK siRNA的真核表达质粒psiRNA-hHDEK,并能够有效沉默CaSki细胞中DEK基因表达。DEK基因沉默后能够诱导CaSki细胞凋亡和细胞衰老。DEK基因在宫颈癌发生和演变中发挥重要作用,其既是衰老抑制基因,又是凋亡抑制基因。     

长乐地区居民血清胃蛋白酶原和幽门螺杆菌抗体水平分析

[目的]分析长乐地区居民血清胃蛋白酶原（PG）含量和幽门螺杆菌（Hp）感染率,了解基本人群分布特征,探索相关影响因素。[方法]用ELISA法检测224名居民血清PGⅠ、PGⅡ含量,并计算PGⅠ/Ⅱ比值;用ELISA法检测血清Hp IgG抗体水平。[结果]长乐地区居民血清PGⅠ、PGⅡ及PGⅠ/Ⅱ中位值分别为110.8μg/L、13.9μg/L、7.9,在不同性别、不同年龄组中3者类似。Hp感染率为49.6%,感染者血清PGⅡ值（中位数为15.8μg/L）高于非感染者（11.6μg/L,P〈0.01）,但PGⅠ/Ⅱ比值（7.3）较后者低（8.5,P=0.023）。[结论]长乐地区居民血清PG水平呈明显偏态分布,与Hp感染密切相关,是否受性别、年龄影响有待进一步研究。     

垂体肿瘤转化基因1对结肠癌SW480细胞增殖的影响及其机制研究

目的 研究垂体肿瘤转化基因 1(Pituitary Tumor Tansforming Gene1,PTTG1)过表达对人结肠癌细胞SW480增殖和周期的影响及其可能机制。方法 采用脂质体转染法将pcDNA3.1(+)-PTTG1及空载pcDNA3.1(+)质粒转染人结肠癌SW480细胞,G418法筛选阳性克隆。Western blot法检测PTTG1和cyclin D、cyclin E、p21的表达。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期。结果 （1）成功获得PTTG1高表达的SW480细胞pcDNA3.1(+)-PTTG1及对照pcDNA3.1(+)细胞,Western blot结果显示pcDNA3.1(+)-PTTG1细胞PTTG1表达量分别为pcDNA3.1(+)细胞和SW480细胞的3.58倍和3.42倍;（2）过表达PTTG1基因后,SW480细胞周期改变,G0/G1期细胞减少而S期和G2/M期细胞增加;细胞周期调控蛋白cyclin D和cyclin E表达升高,p21表达降低;SW480细胞增殖显著性加快。（3） 过表达PTTG1基因后,SW480细胞中PI3K/AKT信号活化增强,使用PI3K/AKT信号抑制剂LY29400干预后,细胞增殖减弱,周期蛋白cyclin D和cyclin E表达降低,p21表达升高。结论 PTTG1基因过表达可能通过活化PI3K/AKT信号加速SW480细胞从G1期向S期的转化促进细胞增殖,提示PTTG1蛋白可能成为结肠癌治疗的一个潜在靶点。     

2型糖尿病患者的执行功能现状及其影响因素研究

摘要:目的　探讨2型糖尿病患者执行功能现状及其主要影响因素。方法　选取三甲医院内分泌科确诊的2型糖尿病患者280例,采用执行功能缺陷综合征的行为学评价测验对患者进行执行功能的评测,采用自行设计问卷收集患者一般情况及病例资料。结果　2型糖尿病患者BADS测评总均分为（10.62±2.30）分。多元线性回归分析显示,性别、文化程度、糖尿病神经病变、病程及糖化血红蛋白控制情况是影响2型糖尿病患者执行功能的主要危险因素。结论　2型糖尿病患者执行功能水平偏低,主要与性别、文化程度、病程、神经病变及血糖控制情况有关。     

湖州地区幽门螺杆菌对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药情况及耐药基因突变位点分析

目的：研究湖州地区幽门螺杆菌（Hp）对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性及与相关基因突变的情况,为临床根除Hp提供依据。方法收集湖州市中心医院267例胃炎、胃溃疡及胃癌患者的胃黏膜样本,并成功分离136株Hp,采用平板掺入法检测Hp对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性;提取基因组DNA,采用基因芯片法针对23S rRNA V区（可变区）的2142位点和2143位点及gyrA基因QRDR区（含喹诺酮类耐药决定区）的87位点和91位点进行基因突变的检测。结果136株Hp中对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药率分别为7.35%（10/136）和17.65%（24/136）;基因芯片结果检测出2143位点突变17例,2142位点未发生突变;同时也检测出gyrA基因突变27例,其中87位点突变25例,91位点突变2例。结论湖州地区Hp对克拉霉素耐药率不高,突变位点主要为2143位点,宜将克拉霉素继续作为一线药物使用;对左氧氟沙星耐药率高,gyrA基因突变的位点以87位点为主,建议临床用药依据药敏试验结果。     

妇婴诊断相关组进展及分组研究探讨

摘要:目的　本文研究应用较广的10个诊断相关组（Diagnosis-Related Groups,DRGs）妇婴分组,以探讨建立适合我国国情的妇婴DRGs体系,以及建模中可汲取的经验和需注意的问题。方法　采用文献研究和专家评议的方法。资料来源于Cochrane Database of Systematic Reviews、MEDLINE、Web of Science、Internet及中国知网全文数据库。结果　各国妇婴DRGs分组逻辑和并发症与合并症再分组方法及分组结果差异较大,女性生殖系统疾病或紊乱组（MDC13）Nord-DRGs的DRGs分组最少（17个）,GHM的分组最多（94个）。妊娠、分娩和产褥期（MDC14）组DRGs分组最少为MS-DRGs（15个）,最多为CMG+（88个）。新生儿（MDC15）组Adjacent DRGs（ADRGs）和DRGs最少的都为MS-DRGs（6个ADRGs,7个DRGs）,最多也为CMG+（分别为29组和116组）。结论　我国的妇婴DRGs研究与应用应借鉴国际经验,重点关注妇幼专科特色、分组数据标准和质量、模型预测效率、分组的保健与临床意义、综合DRGs研究与管理团队等。     

成都市91株副溶血性弧菌血清型、 耐药性及毒力基因检测

摘要:目的　了解成都市副溶血性弧菌食物中毒疫情分离菌株和生鲜冻水产品分离菌株血清型分布、耐药性及毒力基因携带状况,为成都市副溶血弧菌疾病防治提供科学依据。方法　对检出的91株副溶血性弧菌采用血清凝结实验血清分型;采用E-test药敏试验进行耐药性检测;用荧光PCR检测菌株的tdh、trh、tlh毒力基因。结果　91株菌分属于8个群26个血清型,主要为O1群（36.26%）,其次是O4群（23.07%）和O2群（16.48%）;46株疫情患者肛拭分离株O4群（48.71%）、O1群（35.89%）为主;22株鲜冻海产品分离株O1群（45.45%）为主;18株生鲜淡水产品分离株O2群（55.55%）为主。91株副溶血性弧菌均检出tlh,检出tdh基因均为食物中毒患者肛拭菌株,仅有1株食物中毒患者肛拭菌株检出trh基因。E-test实验结果显示,除青霉素和氨苄西林外的其他12种试验抗生素均敏感。结论　成都市引起食物中毒疫情的副溶血性弧菌主要为携带tdh基因的O4、O1群菌株。     

一种复合型生物消毒剂杀菌性能和毒性试验研究

摘要:目的　研究一种复合型生物消毒剂的杀菌效果、稳定性和毒性,为实际消毒应用提供科学的依据。方法　采用悬液定量杀菌试验、稳定性试验和现场试验及动物试验方法,对该消毒剂的消毒相关性能进行试验观察。结果　该消毒剂以溶葡萄球菌酶为主要成分,原液pH值3.50。以该消毒剂原液作用5 min对悬液内金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌和白色念珠菌的杀灭对数值均＞5.00。用该消毒剂原液对30人次皮肤喷涂消毒作用5 min,对自然菌的杀灭对数值均＞1.00。该消毒剂经37℃存放90 d,存放后原液对白色念珠菌作用5 min杀灭对数值≥4.00。该消毒剂原液对小鼠急性经口毒性试验LD50均大于5000 mg/kg.bw,对家兔皮肤皮肤刺激指数为0,对豚鼠皮肤致敏率为0%。结论　该消毒剂具有较好的杀菌效果和稳定性,属实际无毒物质,对皮肤无刺激性,无致敏作用。     

基因重组人三叶因子2对实验性大鼠胃溃疡的疗效及其作用机制

目的探讨人三叶因子2对实验性大鼠胃溃疡愈合的影响及其机制。方法将48只Wistar大鼠随机分为治疗组和对照组。应用冰乙酸法制作大鼠慢性胃溃疡模型,治疗组24只应用pcDNA3．1-hTFF2100μg／只,在造模时经胃壁黏膜下注入,并每日肌肉注射生理盐水100μl／只至标本采集。对照组24只应用等容积pcDNA3．1100μg／只,在造模时经胃壁黏膜下注入,并每日肌肉注射生理盐水100μl至标本采集。术后第3天、第7天、第14天各处死治疗组和对照组各8只大鼠。测定治疗组和对照组胃溃疡指数、溃疡旁胃黏膜内PCNA阳性细胞增值指数及溃疡底部血管生成的变化。结果第3天,治疗组与对照组的上述各项指标无显著性差异（P〈0．05）。第7天、第14天治疗组较对照组的溃疡旁胃黏膜内PCNA阳性细胞增值指数及溃疡底部新生血管明显升高,两者相比差异有显著性（P〈0．05）,而其中胃溃疡指数在第14天治疗组较对照组显著缩小,差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论hTFF2对实验性大鼠胃溃疡愈合有促进作用,促进胃黏膜上皮细胞增殖和溃疡底部血管生成是其促进溃疡愈合的机制之一。     

创新支付制度下门诊患者服务满意度调查

摘要:目的　了解宁夏地区创新支付制度试点县门诊服务满意度,为进一步推进支付制度改革提供参考依据。方法　选择宁夏回族自治区新农合创兴支付制度改革试点县海原县和盐池县,调查参合农民就诊满意度。结果　创新支付制度试点县的新农合参合者整体就诊满意率为72.1%,高于改革前2009年的基线调查（64.4%）。15～30岁组、未婚、高中以上文化程度、自感健康状况一般和非常差、没有从医疗保险得到报销的人群满意度低于各人群中其他分组（均P＜0.05）。结论　宁夏创新支付制度试点县门诊满意率较高,政府在制定农村医保政策时,需要结合农民的家庭年收入水平和医疗卫生资金支出水平,合理划定报销补偿比例和报销门槛。