重组腺病毒载体Ad5-hOPG-EGFP介导hOPG基因在犬牙周韧带细胞中的表达检测

[摘要]目的：观察人骨保护素（humanosteoprotegerin,hOPG）在犬牙周韧带细胞（periodontalligamentcells,PDLCs）中的表达情况,为后期的牙周组织再生实验制备高表达目的基因hOPG的种子细胞。方法：体外构建携带hOPG基因的腺病毒载体Ad5-hOPG—EGFP,并将其转染Beagle犬PDLCs,通过流式细胞术、实时定量RT．PCR、ELISA以及WesternBlot检测目的基因的转录和表达。结果：重组腺病毒Ad5一hOPG—EGFP成功转染犬PDLCs,转染72h后转染效率达到80％以上,转染的细胞发出较强的绿色荧光;基因和蛋白水平检测表明,hOPG在犬PDLCs中得到了有效表达。结论：重组腺病毒介导的hOPG基因可以在PDLCs中有效表达。     

hOPG转染对大鼠BMSCs及种植体周围成骨的影响

目的：研究体内、体外人骨保护素（hOPG）基因对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨功能和种植体周围成骨的影响。方法：构建含hOPG的重组腺病毒,蛋白印迹杂交法Western Blot检测转染细胞OPG蛋白功能表达。倒置显微镜观察转染细胞形态差别,茜素红S染色鉴定转染细胞的体外成骨能力。建立大鼠股骨干骺端羟基磷灰石涂层种植体植入动物模型。植入种植体前,实验组于植入体窝注入10μL的病毒悬浮液;对照组注入10μL的PBS。4周后取材,HE染色,光镜下观察,定量分析。结果：Western blot结果显示OPG在蛋白水平高表达;茜素红S染色转染组和未转染组都出现了较多散在的致密圆形矿化结节,萃取染色后分光光度检测两者无明显差异;体内实验显示实验组种植体周围成骨明显高于对照组。结论：体外pDC316-hOPG-EGFP成功转染大鼠BMSCs,转染hOPG基因的BMSCs能持续稳定的高表达hOPG。转染不影响BMSCs的成骨活性。种植体周围注射hOPG具有促进种植体周围成骨的作用。     

重组人骨保护素抑制破骨细胞及促进羟磷灰石修复去势大鼠下颌骨缺损的研究

目的 探讨转染人骨保护素（hOPG）基因的大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）复合羟磷灰石（HA）支架对去势大鼠下颌骨缺损的修复作用。方法 将重组腺病毒pDC316-hOPG-EGFP转染rBMSCs,蛋白质印迹法和骨磨片试验分别检测hOPG的表达水平和抑制破骨细胞功能;构建骨质疏松大鼠模型,分别将HA支架、未转染rBMSCs复合HA支架、转染rBMSCs复合HA支架植入大鼠下颌骨骨缺损,6周后通过抗酒石酸酸性磷酸酶、苏木精-伊红染色检测骨缺损区破骨细胞及骨修复情况。结果 体外携载有hOPG基因的腺病毒成功转染rBMSCs,转染后的rBMSCs表达具有抑制破骨细胞活性功能的hOPG;表达hOPG的rBMSCs复合HA支架后骨缺损处破骨细胞明显减少,成骨增多。结论 转染hOPG基因的rBMSCs在体内外均具有抑制破骨细胞功能的作用,且转染rBMSCs复合HA支架可促进骨质疏松大鼠的下颌骨缺损修复。     

绿色荧光蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的　体外研究绿色荧光蛋白 (GFP)基因转染骨髓间充质干细胞 (MSCs)的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法　体外分离培养大鼠MSCs,用重组GFP的腺病毒载体Ad GFP及脂质体介导质粒pEGFP C1两种方法转染GFP,流式细胞术观察比较基因转染和表达结果;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果　重组Ad GFP对细胞的感染率达(41 3±1 4)%,感染 6周后仍有表达;脂质体组转染效率最高为 12 5%。病毒感染组阳性细胞与未感染组细胞经成骨诱导分化后碱性磷酸酶表达均逐渐增高;诱导 3周后茜素红钙盐染色均为阳性。结论　重组GFP的腺病毒载体Ad GFP可高效感染MSCs,基因转染后细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义(P>0 05),可以作为一种高效的大鼠MSCs的标记方法。     

矿化液促进犬牙周膜细胞异位成骨实验

目的：探讨矿化液对犬牙周膜细胞（PDLCs）体外诱导分化、体内成骨作用的影响。方法：酶消化法原代培养成年犬前磨牙PDLCs并鉴定。再以含地塞米松、β甘油磷酸钠和抗坏血酸的矿化液连续诱导PDLCs，观察细胞形态变化，检测骨涎蛋白（BSP）表达碱性磷酸酶（ALP）活性。将诱导14d的细胞接种于钠米羟基磷灰石-胶原-聚乳酸复合支架（nHAC／PLA）上，体外培养5d后植入犬自体皮下，8W取材HE、三色法染色评价骨形成情况。以未诱导细胞为对照。结果：PDLCs波形丝蛋白（VIM）表达阳性，角蛋白（CK）阴性。矿化诱导后强阳性表达BSP，ALP活性也显著升高，提示细胞向成骨样细胞分化。体内移植8W，组织学见对照组主要形成纤维样组织而诱导组形成大量骨样组织。结论：矿化液具有促进PDLCs体外向成骨细胞分化和体内成骨作用。     

人转化生长因子-β1基因转染对人牙龈成纤维细胞成骨特性的影响

目的观察并评价基因转染后牙龈成纤维细胞（GF）表达外源目的基因人转化生长因子-β1（hTGF-β1）对其分化、成骨特性的影响。方法采用碱性磷酸酶（ALP）活性检测方法检测转染对GF ALP活性的影响,免疫组化染色及图像分析评价基因转染后骨钙素（OC）、骨桥素（OPN）、骨涎蛋白（BSP）、骨结合素（ON）含量的变化,体外矿化结节形成实验检测转染后细胞成骨特性的变化。结果转染后GF的ALP活性较未转染组有显著的提高（P<0.05）,并且与牙周膜成纤维细胞（PDLCs）的ALP活性接近（P>0.05）。OC含量检测显示转染后GF的OC含量与未转染组和PDLCs组相比,其差异均无统计学意义（P>0.05）。免疫组化染色后,转染组GF所表达的OPN、ON、BSP含量均高于未转染组GF（P<0.05）,而与PDLCs间差异无统计学意义（P>0.05）。第21天和第24天时,在矿化液作用下PDLCs及转染GF在倒置显微镜下可见致密的结节形成,von Kossa染色可见紫色的矿化结节形成。未转染GF未见结节形成。而转染GF在未经矿化液诱导情况下,虽出现显著的细胞聚集,但von Kossa染色未见紫色矿化结节形成。结论转染pcDNA3-hTGF-β1后的GF可表达一定的成骨细胞特性,但这种成骨特性有限。     

冻存骨髓基质细胞和胶原膜在裸鼠体内的成骨研究

目的：研究经超低温冻存后的骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）和支架材料胶原膜BME-10X复合体植入裸鼠体内的成骨情况.方法：体外分离培养Beagle犬 BMSCs,冻存二代生长状况良好的BMSCs.12个月后,复苏冻存的BMSCs,并在体外构建BMSCs和0.5 cm×0.5 cm大小的BME-10X复合体.将胶原膜＋BMSCs＋矿化诱导培养液、胶原膜＋BMSCs＋基础培养液、单纯胶原膜＋矿化诱导培养液培养5 d后,植入裸鼠体内,并于术后第4、8、12周取出标本,进行大体观察和组织病理学分析.结果：单纯胶原膜＋诱导培养液组在植入胶原膜后,胶原膜边界清晰,膜边缘及内部基本没有细胞生长;在胶原膜＋BMSCs＋基础培养液组,术后第4周可见,胶原膜内有细胞长入,并有细小的条索状新生胶原形成,随着时间的延长,支架胶原逐渐分解,新形成的条索状胶原纤维变粗大;在胶原膜＋BMSCs＋矿化诱导培养液组,植入后也可见支架胶原的分解和更多的细胞生长,大量新生的胶原形成类骨质样组织.结论：冻存BMSCs复苏后进行体外培养扩增与诱导分化,并在在体内环境下复合胶原支架材料,仍然具有较强成骨能力.     

重组腺病毒Ad-APN-EGFP的构建与促进种植体周围成骨

目的 构建重组腺病毒Ad-APN-EGFP,研究其转染效率和对种植体周围成骨的影响。方法 构建含脂联素（APN）基因的的重组腺病毒Ad-APN-EGFP,并测序鉴定和酶切鉴定。体外转染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,检测转染效率和APN基因mRNA表达;建立大鼠股骨干骺端羟磷灰石涂层种植体植入动物模型。植入种植体前,实验组于植入体窝注入10 μL的Ad-APN-EGFP悬浮液;对照组注入10 μL的PBS。4周后取材,光镜下观察种植体周围成骨。结果 测序鉴定和酶切鉴定表明,成功构建重组腺病毒Ad-APN-EGFP;转染大鼠BMSCs效率可达90%以上,并能高表达APN基因mRNA;体内实验显示实验组种植体周围成骨明显高于对照组。结论 重组腺病毒Ad-APN-EGFP可以提高大鼠BMSCs的APN基因表达,具有促进种植体周围成骨的作用。     

重组人骨形成蛋白-2结合胶原膜在兔颅骨引导骨再生模型中的成骨效应研究

目的    探讨重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2）与胶原膜靶向结合后在兔颅骨引导骨再生（GBR）模型中的成骨效应。方法    将20只普通级雌性健康新西兰大白兔随机分成2周组和6周组,每组10只。所有大白兔均制备颅骨GBR模型,在颅顶骨植入4个钛筒,分别盖rhBMP-2/CBD胶原膜（rhBMP-2/CBD胶原膜组）、rhBMP-2胶原膜（rhBMP-2胶原膜组）、胶原膜（胶原膜组）和不盖膜（空白组）。分别在2周和6周时处死各对应组的大白兔,取样制作硬组织切片和石蜡切片,染色后进行组织学观察。结果    2周时可见胶原膜阻挡了纤维组织的长入,4组钛筒上层均无新骨生成,其中rhBMP-2/CBD胶原膜组钛筒顶端毛细血管增生量明显较其余3组多。6周时可见rhBMP-2/CBD胶原膜组钛筒上层大量新骨生成,与来源于颅骨骨面的新骨界限明显,而其余3组钛筒顶端未见新骨生成。结论    rhBMP-2与胶原膜靶向结合可形成具有骨诱导性的胶原膜,缓释rhBMP-2使胶原膜下方大量新骨生成,表层成骨可阻止纤维组织的长入和防止植骨床的塌陷,使成骨速度加倍。     

hBMP-7基因转染的骨髓基质细胞与BME-10X胶原膜复合物的体外构建

目的:观察人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因转染的骨髓基质细胞(BMSCs)与胶原膜BME-10X复合后,BMSCs在BME-10X上的生长状态。方法:利用脂质体介导法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSCs,传代与胶原膜BME-10X复合,荧光显微镜、扫描电镜、透射电镜观察。结果:转染细胞复合胶原膜后生长良好,24h细胞已贴附、伸展。透射电镜可见细胞与材料表面连接紧密,包膜部分增厚,形成类似半桥粒样结构。结论:hBMP-7基因转染BMSCs在胶原膜BME-10X上生长良好,hBMP-7基因转染的BMSCs与胶原膜复合物有望应用于牙周组织工程。     

构建过表达hBMP-7基因重组腺病毒及体外转染犬骨髓基质细胞的研究

目的：构建携带人骨形态发生蛋白7（hBMP-7）基因的重组腺病毒载体,体外转染犬骨髓基质干细胞（dMSCs）,检测hBMP-7的表达。方法：利用AdEasy腺病毒表达系统,体外构建高效表达hBMP-7重组腺病毒载体,酶切电泳鉴定后体外转染dMSCs,检测转染情况及目的基因的表达。结果：酶切鉴定表明pAd-hBMP-7已成功构建,体外可高效转染dMSCs,RT-PCR方法及免疫细胞化学检测表明hBMP-7可在dMSCs中表达。结论：成功克隆hBMP-7基因并构建重组腺病毒表达载体,证实了其在dMSCs中的表达,为火器伤致颌骨缺损的早期局部基因治疗打下基础。     

补肾壮骨中药对成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响

目的观察补肾壮骨中药对成骨细胞OPG和RANKL的影响,探讨中药对牵张成骨作用机制。方法 Beagle犬6只,雄性,体重10kg~15kg。实验分为含药血清组（A组）、无药血清组（B组）和胎牛血清组（C组）。含药血清组的血清来自补肾壮骨中药经煎制后,按体表面积折算等效剂量,2只Beagle犬连续喂服7天后经股动脉采血制备而成。无药血清组的血清采用等剂量生理盐水2只Beagle犬喂服7天后经股动脉采血制备而成。胎牛血清组的血清直接购买。另外2只Beagle犬由胫骨获取骨髓,经F icoll分离液进行梯度离心,MSC经含胎牛血清的DMEM培养,传代后分别将MSC在含药血清（A组）、无药血清（B组）和胎牛血清（C组）的诱导矿化液（β-甘油磷酸钠,维生素C和地塞米松）＋DMEM中培养。采用原位杂交的方法检测成骨细胞OPG和RANKL mRNA的表达情况。结果诱导培养5天、7天时,含药血清组成骨细胞OPG mRNA的表达量均高于无药血清组和胎牛血清组（P〈0.05）。无药血清组和胎牛血清组相比无显著性差异（P〉0.05）。诱导培养5天时,成骨细胞RANKLmRNA的表达量三组间两两比较均无显著性差异（P〉0.05）。诱导培养7天时,含药血清组成骨细胞OPG mRNA的表达量均低于无药血清组和胎牛血清组（P〈0.05）。无药血清组和胎牛血清组相比无显著性差异（P〉0.05）。诱导培养5天时,含药血清组OPG/RANKL比率是无药血清组的1.67倍,是胎牛血清组的2.01倍。诱导培养7天时,含药血清组OPG/RANKL比率是无药血清组的2.18倍,是胎牛血清组的2.62倍。结论补肾壮骨中药可以调节成骨细胞分泌OPG、RANKL的功能,从而降低破骨细胞的活力,促进成骨过程。     

骨保护素修饰的Beagle犬骨髓基质细胞表达体系的建立与鉴定

目的利用pSecTag2/B-OPG真核分泌表达穿梭载体,建立经骨保护素基因（OPG）修饰的Beagle犬骨髓基质细胞（BMSC）瞬时表达体系并检测其表达能力,为基因工程与组织工程联合治疗牙周病提供细胞基础。方法体外分离、培养Beagle犬BMSC,通过脂质体法将已鉴定的目的基因瞬时转染至BMSC,并用RT-PCR鉴定OPG是否有录,同时通过Western blot方法检测OPG在6周内的表达水平。结果重组质粒pSecTag2/B-OPG经HindⅢ单酶切及EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,电泳显示切下的片段均与预期大小相符,经测序证实此基因与GeneBank中[gi：33878056]提供的序列一致;鉴定正确的重组质粒在BMSC中有转录,并且在39 d内都明显有OPG表达。结论建立了骨保护素基因修饰的骨髓基质细胞瞬时表达体系。     

腺病毒介导TWEAK对大鼠骨髓间充质干细胞影响的实验研究

目的：探讨腺病毒介导的TWEAK基因对骨髓间充质干细胞（Bone M esenchym al Stem Cells,BMSCs）细胞的影响。方法：构建含有TWEAK基因的腺病毒载体Ad5CMV-TWEAK和含绿色荧光蛋白的对照腺病毒载体Ad5CMV-EGFP;利用全骨髓贴壁法分离纯BMSCs,通过转染Ad5CMV-EGFP确定病毒对BMSCs的转染效率;以未经转染的BMSCs细胞为空白对照组,以转染Ad5CMV-EGFP为实验对照组,以转染Ad5CMV-TWEAK为实验组,通过计数细胞和测定细胞碱性磷酸酶含量观察转染TWEAK对BMSCs增殖和骨形成能力的影响。结果：Ad5CMT-EGFP对大鼠BMSCs的感染率在300partic les/cell时可达到85%;感染后72小时组实验组与空白对照组差异有统计学分析意义（P〈0.05）,实验对照组与空白对照组差异无统计学分析意义;感染后15 d内各时间点3组间碱性磷酸酶的分泌量经t检验,差异无统计学意义。结论：腺病毒介导的TWEAK基因对于BMSCs具有增殖作用,但并不通过碱性磷酸酶影响BMSCs成骨能力,其在骨形成中的作用需要进一步探讨。     

破骨细胞核因子κB受体活化因子配基和骨保护因子在种植体周围软组织及骨组织的表达

目的研究破骨细胞核因子κB受体活化因子配基（RANKL）及其伪受体骨保护因子（OPG）在非负荷期种植体周围软组织和骨组织中的表达变化及时间分布特点。方法选用6只1～2岁龄的雄性Beagle犬建立种植义齿动物模型,分别观测种植体植入后3、7、15、30、60、90 d种植体周围的骨改建情况。取种植体周围软组织进行实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）;取犬下颌骨进行大体标本观察拍摄X线片;取种植体周围骨组织进行免疫组化染色,检测RANKL和OPG随时间的表达变化及分布特点。结果骨改建的最活跃期为种植体植入后的第7天,种植体周围软组织中的RANKL和OPG mRNA及骨组织中的RANKL和OPG均随种植体植入时间的增加而增加,第7天达高峰,而后均逐渐降低。RANKL和OPG在种植体周围软组织及骨组织中的表达变化规律一致。结论OPG和RANKL能在种植体周围软组织中表达,且变化规律与种植体周围骨组织改建过程一致。种植体周围组织可以通过OPG/RANKL系统参与破骨细胞的形成,调节骨质吸收,影响骨组织代谢微环境。     

BMP-2、bFGF和Dex联合应用对犬牙周膜细胞增殖及矿化结节形成能力的影响

目的：联合应用BMP-2、bFGF和Dex诱导牙周膜细胞（PDLCs）,观察其成骨分化能力.方法：体外培养犬PDLCs,将第4代PDLCs进行分组：（1）对照组增加矿化诱导液组（2）bFGF＋Dex组、（3）BMP-2＋bFGF组、（4）加BMP-2＋Dex组、（5）bFGF＋BMP-2＋ Dex组.MTT法观察BMP-2、bFGF和Dex联合应用对犬PDLCs增殖的影响;成骨分化实验观察BMP-2、bFGF、Dex联合应用对犬PDLCs分化的影响.结果：（1）PDLCs细胞呈典型的成纤维细胞样形态：长梭形、纺锤形、三角形等多形性.波形丝蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性.（2）MTT增殖实验显示：bFGF＋Dex、BMP-2＋bFGF、BMP-2＋Dex、bFGF＋BMP-2＋Dex组均促进犬PDLCs增殖,但各诱导组间无明显差异.（3）成骨诱导实验检测结果：bFGF＋BMP-2＋Dex组矿化结节染色深、面积较大、细胞密集而集中.结论：三种诱导因子两两结合均能增强犬PDLCs矿化结节形成能力,但三种因子联合应用成骨能力最强（P＜0.05）.     

重组人白介素-1α对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG影响的荧光定量RT-PCR研究

目的：通过观察重组人白介素-1α（rhIL-1α）对体外培养人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）核因子kB受体活化因子配基（RANKL）和骨保护素（OPG）表达的影响来探讨牙槽骨改建的调节机制。方法：以不同浓度rhIL-1α（0、5、10、20μg/L）作用于体外培养HPDLFs,于24 h后收集细胞,利用荧光定量RT-PCR技术检测RANKLmRNA和OPG mRNA的表达。结果：rhIL-1α同时上调HPDLFs表达RANKL mRNA和OPG mRNA,但RANKL/OPG的比值增加,这种调节作用在10μg/L的作用浓度时最明显。结论：rhIL-1α可在体外影响HP-DLFs表达RANKL mRNA和OPG mRNA,调节RANKL/OPG比值,与牙槽骨改建密切相关。     

hbFGF基因及hBMP-7基因修饰的组织工程化复合物联合应用促进牙槽骨再生动物实验研究

目的 观察人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)基因及人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因修饰的组织工程化复合物联合应用对牙槽骨缺损再生的影响.方法 利用hbFGF基因转染Beagle犬牙龈成纤维细胞(GFs),并将其接种于脱细胞真皮基质(ADM)形成组织工程化复合物,同时以hBMP-7基因转染Beagle犬骨髓基质细胞(BMSCs),将其与胶原膜BME-10X复合,共同植入Beagle犬的人工牙周组织缺损区,通过组织学观察和测量分析,评价其对牙槽骨再生的影响.结果 术后6、12周,光镜下观察可见转染GFs复合ADM组和未转染GFs复合ADM组均较单纯BMSCs复合BME-10X组有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨质样组织生长;术后12周各组相对于术后6周的各组有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨质样组织.新生牙骨质与新生牙槽骨测量显示,转染hbFGF的GFs/ADM复合物的联合应用能显著提高hBMP-7基因修饰的组织工程化复合物修复牙周组织缺损的程度.结论 转染bFGF的GFs/ADM复合物有助于促进hBMP-7基因修饰的组织工程化复合物对牙周组织缺损的修复.     

MT01/PEN复合物对人成骨样细胞MG63表达骨保护蛋白和核因子κB受体活化因子配体的影响

目的 应用聚乙烯亚胺阳离子聚合物（PEN）载体装载寡脱氧核苷酸MT01,制备MT01/PEN复合物,检测该复合物对人成骨样细胞MG63表达骨保护蛋白（OPG）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的影响。方法 制备3种不同配比的MT01/PEN（质量比分别为1∶2、1∶4、1∶6）复合物,以全硫代化修饰MT01（MT01-s）和未修饰的MT01作阳性对照,分别转染MG63细胞。采用酶联免疫吸附测定法和real-time聚合酶链反应法分别检测培养24、48、72 h时各组上清液及细胞内OPG和RANKL的表达水平。结果 经MT01/PEN复合物转染后,上清液及细胞内OPG表达水平均升高（P<0.05）;多数组中RANKL表达水平降低,而OPG/RANKL比值呈升高趋势（P<0.05）;不同质量配比的MT01/PEN均对MG63细胞的成骨具有影响,其中质量比为1∶6时作用最明显。结论 应用PEN作为基因载体装载MT01可增强MT01对MG63细胞的促成骨作用。     

腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染肌卫星细胞诱导成骨的动物实验研究

目的观察腺病毒介导的BMP- 2基因转染肌卫星细胞后体内骨诱导能力。方法采用动物实验方法,将转染BMP- 2基因的绿色荧光蛋白（GFP）转基因鼠肌卫星细胞吸收到胶原支架上,然后将细胞胶原支架复合物移植入野生型129sv小鼠的后小腿肌肉中,应用X线片观察、组织学检查及荧光显微镜观察转染细胞的诱导成骨能力。结果用BMP- 2基因转染的肌卫星细胞复合胶原支架移植入野生型小鼠后小腿筋膜下肌肉后会产生异位骨形成,移植2周后其中有GFP阳性的成骨细胞和骨细胞,3周后形成良好的骨组织,4周时已形成成熟的骨组织,而且骨组织具有GFP荧光。对照组用胶原支架和未转染的肌卫星细胞移植,未出现诱导性异位骨形成。结论Ad- BMP2转染的肌卫星细胞以胶原为支架可以在肌肉内诱导骨组织形成。