深低温保存生物材料快速复温方法的研究进展

生物材料的深低温保存已经越来越广泛地应用于生物学、医学等领域,其主要特点是通过低温保存生物材料,从而缓解供求之间的矛盾。同快速降温一样,快速复温在提高冷冻保存的生物组织的活性中也扮演了重要的角色。快速复温冷冻生物材料能够有效避免其在复温过程中的重结晶现象,减小热应力,降低细胞损伤,提高细胞的存活率。近年来许多国内外学者在快速复温低温保存的生物材料方面做了很多研究,探索出多种可行的复温方法。本文对传统以及新出现的复温方法逐一论述。通过查阅大量国内外相关文献,同时结合本单位的相关研究成果分析总结进行综述。目前所使用的快速复温的方法主要有传统的水浴法、Cryotop法、微波法、激光法和磁热法等。通过对几种复温方法的综合分析,认识到它们的优势和不足,以及各种方法在应用上的局限性。所以有必要寻找一种新的可靠的复温方法来实现快速均匀的生物组织的加热,并提出了一种新的快速均匀复温生物材料的方法,该方法具有重要的研究意义和应用背景。     

低温保存后生物组织微波复温过程的数值分析

在液氮中低温保存的生物组织,使用前需要将其复温到正常温度.而复温过程中的反玻璃化与加热不均匀引起的热应力将对生物组织造成极大的伤害,而采用微波复温能够利用其快速加热的优点减少伤害.本文通过数值方法对麦克斯韦方程和传热方程进行了耦合求解,得到微波复温时组织内温度随时间的变化过程,讨论分析了加热过程中的组织内部温度分布的不均匀性,并提出了一些改善不均匀性的方法.     

组织工程化肌腱种子细胞深低温保存的实验研究

对肌腱种子细胞进行深低温保存，研究保存过程中多个环节的影响因索对细胞存活率的影响及深低温保存对种子细胞生物学特性、胶原分泌功能的影响。实验结果表明二甲基亚砜是肌腱种子细胞深低温保存中比较好的抗冻保护剂；冻存后使用与培养时不同的营养血清处理对细胞有损害，可降低细胞存活率；在冷冻保存过程中，细胞存活率与细胞浓度有一定关系，浓度太低可能降低细胞存活率；细胞在冷冻保存时，降温速度对细胞存活率有影响，慢速的分步降温组细胞存活率明显高于直接人液氮的快速降温组；采用10％二甲基亚砜加15%小牛血清加75% DMEM配方保存肌腱种子细胞，对其分泌胶原功能无明显影响，对其生长曲线、细胞周期及染色体众数无明显改变，适于肌腱种子细胞的保存。     

不同方法深低温保存兔肢体再植后血管组织的病理学变化

背景:虽然对于单一组织的冷冻保存获得了空前的成果,并且已逐渐应用于临床,但是对于复合组织的冷冻保存及应用还鲜有研究。目的:通过实验研究深低温冷冻不同复温方法下兔肢体再植后血管形态学变化,找出一种对复合组织中血管损伤最小的复温方法,从而为深低温处理后断肢再植可行性提供理论依据。方法:30只健康新西兰大白兔随机数字表法均分为对照组、慢速冷冻-慢速复温组、慢速冷冻-快速复温组,均给予大白兔右后肢自膝上1 cm处离断。慢速冷冻两组复温后均行断肢再植,再植肢体成活6 h后给予再次离断右后下肢。3组兔断肢均取股血管组织采用染色光镜及电镜进行形态学观察及大体观察,光镜病理计分结果用显著性分析。结果与结论:慢速冷冻-慢速复温组、慢速冷冻-快速复温组兔肢体再植6 h后的病理变化(大体标本、光镜、电镜)均较对照组差,但慢速冷冻-慢速复温组与慢速冷冻-快速复温组相比血管内皮细胞完整性较好,细胞器破坏较少。证实,经过深低温冷冻-复温处理后兔断肢再植6 h,离断肢体血管组织能保持一定的结构完整性,再植后6 h兔肢体获得成活,且慢速冷冻-慢速复温组更为适合离断肢体的保存,为深低温处理后离断肢体行断肢再植远期成活可行性提供了依据。     

深低温保存同种瓣移植后的免疫排斥反应及临床意见

深低温保存技术的出现使同种瓣更广泛地应用于各种心脏外科手术.深低温很大程度上保持了同种瓣的生物活性,这是它能够在体内保持耐久性的重要条件,但随之产生的特异性免疫排斥反应不容忽视.本文讨论了深低温技术对同种瓣抗原性的影响以及移植后的免疫排斥现象、发生机制及其意义.     

依达拉奉对断肢再植后肢体的保护作用

背景：怎样减轻断肢再植后缺血再灌注损伤的严重程度,目前尚无有效方法。 目的：探讨依达拉奉能否对断肢再植术后肢体起到保护作用。 方法：根据不同的干预方法,将18只健康兔随机数字表法均分为3组(n=6),分别为依达拉奉组、缺血再灌注组和空白对照组。建立左下肢的离断肢体模型,其中,依达拉奉组于再灌注前给予以依达拉奉为主的灌注液进行灌注(1.5 mg/kg),分别于2,4,8,12 h于兔的胫骨前肌取材,分别测定骨骼肌超氧化物歧化酶、髓过氧化物酶、丙二醛、Ca²⁺-ATP酶、Na⁺-K⁺-ATP酶,湿质量/干质量比值,光镜下观察骨骼肌结构的病理变化。 结果与结论：缺血再灌注后兔骨骼肌的肌纤维水肿,损伤明显,大量炎性细胞浸润,依达拉奉干预后损伤程度减轻,但均随时间增加而加剧。依达拉奉能够明显提高缺血再灌注后机体内超氧化物歧化酶、过氧化物酶、Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶含量,降低丙二醛、湿质量/干质量比值,各项指标差异均存在显著性意义(P < 0.05),可见依达拉奉对断肢再植后肢体有着明显的保护作用。依达拉奉为主的混合灌注液能够有效地预防再植后肢体(特别是骨骼肌)的缺血再灌注损伤。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

库血复温输血对失血性休克兔肠系膜微循环的影响

目的 探讨库血复温输血对失血性休克兔肠系膜微循环的影响。方法 将30只新西兰兔随机分成两组，建立失血性休克模型。一组采用低温（4℃）输血，另一组采用复温（37℃）输血，分别观测肠系膜微循环的变化。结果 复温输血组与低温输血组相比较。肠系膜微动脉管径，微静脉管径显著增大（P〈0．001），微动脉血流速度和微静脉血流速度明显增快（P〈0．005），毛细血管血流流态由线流变为线粒流。结论 复温输血对改善肠系膜微循环。并对因输血引起的多器官损害具有一定作用。     

兔许旺细胞与猪小肠黏膜下层的体外复合培养

背景：国内外研究以大鼠许旺细胞与小肠黏膜下层复合修复神经缺损,取得了较好结果。 目的：观察兔许旺细胞与猪小肠黏膜下层体外共培养的生物相容性。 方法：采用分步酶消化法分离培养新西兰大白兔许旺细胞,取第3代许旺细胞接种在猪小肠黏膜下层上。 结果与结论：①苏木精-伊红染色：复合培养24 h后细胞在材料上良好黏附。1周时部分细胞在猪小肠黏膜下层基质层表面呈单层生长,细胞扁平,细胞核呈长梭形,细胞间连接紧密。2周后,细胞呈多层生长。②扫描电镜：复合培养2 d,细胞黏附于材料表面并伸展,细胞体呈纺锤形,从胞体伸出两根细长突起,相邻细胞的突起首尾相接连成细胞链或融合或交联或在纤维的侧方平行生长;1周后细胞在材料上大量增殖,呈串珠链黏附于支架上,类似于神经中的Bunger带。表明小肠黏膜下层与许旺细胞有良好的相容性。     

深低温保存兔颈总动脉体外灌注后的结构和力学性能研究

 目的 探讨深低温保存对动脉血管组织学和力学性能的影响。方法 取 20 只新西兰兔的颈总动脉，用含 1.5 mol/L 1, 2-丙二醇的低温保护剂深低温（－196℃）保存 10 ~ 15 d，并在预冷的冰袋内缓慢复温；以新鲜血管作为对照。对新鲜和冷冻-复温血管的平滑肌细胞（SMC）进行体外培养，观察和分析新鲜、冷冻-复温和冷冻复温后体外灌注 6、12 和 24 h血管的内皮细胞、SMC、血管壁组织构和力学性能（轴向、周向弹性模量和断裂应力）的变化。结果 冷冻-复温后血管的 SMC 在体外培养中开始生长时间与新鲜血管基本相同（24 ~ 36 h），生长速度接近。深低温保存后，血管内皮细胞数量减少，电镜观察SMC数量和形态无明显变化，但血管的轴向弹性模量（5.82 ± 0.55）、轴向断裂应力（58.78 ± 6.96）和周向弹性模量（1.44 ± 0.22）、周向断裂应力（3.45 ± 0.40）均明显低于新鲜血管（分别为6.45 ± 0.80、146.96 ± 23.60 和 1.83 ± 0.17、5.33 ± 0.50， P < 0.05或 P < 0.01）。体外灌注后，冷冻-复温血管的内皮细胞脱落，SMC 变性、坏死，内弹力纤维和胶原出现不同程度崩裂，力学性能指标中除了轴向弹性模量外，均进一步降低（P < 0.05 或 P < 0.01）。结论 兔颈总动脉 SMC 深低温保存效果满意，但体外灌注对经深低温保存血管的内皮细胞、SMC 和血管壁结构具有明显损伤作用，导致血管力学性能显著降低。     

库血复温输注对失血性休克兔血液流变学和血气的影响

目的探讨库血复温输注对失血性休克兔血液流变学和血气的影响。方法将30只新西兰兔随机分成两组,建立失血性休克模。一组采用低温(4℃)输血,另一组采用复温(37℃)输血,分别于输血后30、60 min观测血液流变学和血气的变化。结果复温输血组与低温输血组相比较,全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数明显降低(P<0.001),二氧化碳分压(PaCO2)也明显降低(P<0.05);氧饱和度(SatO2)、氧分压(PaO2)、剩余碱(BEecf)、pH明显升高(P<0.05)。结论复温输血对改善血循环,纠正酸碱平衡紊乱方面有一定作用。     

Optimal freezing and thawing for the survival of periphheral nerves in severed rabbit limbs

This study aimed to investigate the optimal freezing and thawing procedures for the survival of peripheral nerves in severed rabbit limbs. Twenty New Zealand White rabbits were randomized into four groups: normal control, slow-freezing fast-thawing, slow-freezing slow-thawing, fast-freezing fast-thawing, with five animals in each group. The hind limbs of the rabbits were severed at 1 cm above the knee joint. The severed limbs were cryopreserved with various freezing and thawing procedures. The sciatic nerves were harvested and trypsinized into single nerve fibers for morphological evaluation. The cell viability of the nerve fibers was examined by staining with Calcein-AM and propidium iodide. The fluorescent intensity of the nerve fibers was measured with a laser scanning confocal microscope. The morphology of the nerve fibers in the slow-freezing fast-thawing group was very similar with that of the normal control group, with only mild demyelination. The slow-freezing fast-thawing group and slow-freezing slow-thawing group showed severely damaged nerve fibers. The fluorescent intensities of the nerve fibers was significantly different among the four groups, with a decreasing order of normal control, slow-freezing fast-thawing, slow-freezing slow-thawing, and fast-freezing fast-thawing (P < 0.05). Of the various cryopreservative procedures, slow-freezing fast thawing has the minimal effects on the survival of nerve fibers in severed rabbit limbs.     

干式融化箱与水浴锅复苏细胞因子诱导的杀伤细胞的比较

目的对比干式融化箱与水浴锅复苏冻存细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）的效果。方法提取10份健康志愿者外周血单个核细胞分别诱导培养CIK细胞并冻存于一80℃冰箱。1个月后从每份CIK细胞中取出相同的两个冻存管,分别采用干式融化箱和水浴锅进行复苏。记录复苏时间,检测复苏后细胞存活率及对K562细胞的杀伤作用。结果干式融化箱较水浴锅复苏时间较长[（4．33±0．19）min、（2．47±0．30）rain],差异有统计学意义（P〈0．05）。但两种方法复苏的CIK细胞存活率[（89．55＋5．36）％、（89．86±4．63）％]和对K562细胞的杀伤活性[（44．76±9．53）％、（46．97±10．17）％]差异无统计学意义（P〉0．05）。结论干式融化箱可以代替水浴锅进行冻存CIK细胞复苏。     

不同冷冻方案对家兔卵巢组织卵泡细胞增殖活性的影响

目的探讨不同冷冻方案对家兔卵巢组织卵泡细胞增殖活性的影响。方法应用PROH慢速程序化冷冻及DMSO+EG玻璃化冷冻方案冻存家兔卵巢组织,复苏后机械性分离卵泡,采用3H标记的胸腺嘧啶核苷掺入试验测定2~5层颗粒细胞包裹的小次级卵泡(小OGC组)及5层以上颗粒细胞包裹的大次级卵泡(大OGC组)的cpm值,并以新鲜组为对照。结果PROH组及DMSO+EG玻璃化组复苏后形态正常的小OGC的cpm值分别为2554.67±93.59及2510.67±100.03,新鲜对照组为2507.00±25.94,两冷冻组与新鲜组比较,差异无显著性(P>0.05);而各大OGC组的cpm值分别为5784.00±188.95、5481.33±112.38及9629.00±265.64,两冷冻组与新鲜组比较,差异有显著性(P<0.05);两冷冻组间比较,大OGC及小OGC的cpm值均无显著性差异(P>0.05)。结论①两种冷冻方法对形态正常的小OGC的细胞增殖活性无明显影响,这些卵泡复苏后体外培养及成熟可能为今后卵巢组织冷冻复苏体外培养的研究方向。②两种冷冻方法使形态正常的大OGC细胞增殖活性受到明显抑制,冷冻复苏可能对颗粒细胞造成了损害。③两种冷冻方法对大小OGC细胞增殖活性的影响相似,其具体机制尚需进一步研究。     

大鼠冻存卵巢组织自体异位移植后长期功能评估

目的 评估成年大鼠冻存卵巢组织自体异位移植后的长期生殖、内分泌功能. 方法 78只Wistar成年大鼠,随机分为假手术组(1组,15只)、新鲜组织移植组(2组,24只)、冻存组织移植组(3组,24只)、去势组(4组,15只).将去势后成年大鼠的新鲜卵巢组织及冻存卵巢组织自体异位移植于肾被膜下,分别于移植后5、8、10个月处死各处理组1/3数量动物,取卵巢及子宫组织作组织学检查.通过阴道脱落细胞学检查、动情期雌、孕激素水平监测评估移植后卵巢组织的生殖内分泌功能. 结果 所有动物模型中,新鲜及冻存卵巢组织移植后都可观察到存活组织块.2、3组动情期雌、孕激素水平与假手术组无显著性差异(P>0.05),且均明显高于去势组(P<0.01).冷冻复苏后组织与新鲜组织各级卵泡构成比无显著性差异(P>0.05),各组不同时间取得的卵巢组织各级卵泡构成比相比较均无显著性差异(P>0.05).移植后5个月,2、3组原始卵泡明显减少,分别为假手术组的59.1%和54.5%. 结论 小块卵巢组织可耐受冻融过程;冻存卵巢组织自体肾被膜下移植后,卵巢组织形态无明显改变,原始卵泡总数虽然明显减少,但有成熟卵泡发育并排卵,并能长期维持生殖内分泌功能.     

Chloride activity in cells of isolated perfused cortical thick ascending limbs of rabbit kidney

Muscle strips were excised from the circular and longitudinal layers of the fundus, corpus and antrum of canine stomach, and from the inner portion of the pyloric ring (inner pylorus). Substance P (SP) induced strong contractions, with the greatest sensitivity in fundus and circular corpus preparations (threshold near 10 -10 mol/l). The sensitivity to SP decreased in the sequence circular corpus - longitudinal antrum - circular antrum (threshold near 10(-7) mol/l); it re-increased towards the pylorus, and in the inner pylorus was nearly as high as in the fundus. The SP responses of fundus and longitudinal corpus were purely tonic, similar to acetylcholine (ACh) and histamine (H) responses. In circular corpus, SP induced a combined phasic-tonic response. SP induced in antrum strips purely phasic-rhythmical contractions of low frequency (similar to the H response), whereas ACh induced phasic contractions of high frequency, and in addition an increase of tone in the longitudinal antrum strips. The SP responses of the inner pylorus were not uniform; in some preparations purely tonic contractions were observed, and large phasic fluctuations of low frequency occurred in others. The phasic components of all the responses were completely suppressed by nifedipine (10(-6) mol/l). Tetrodotoxin as well as blockade of adrenoceptors, of ACh and of H receptors had no effect on the SP responses. Comparative studies with preparations from guinea-pig showed that species differences exist in the SP responses of gastric muscle.     

Potassium activity in cells of isolated perfused cortical thick ascending limbs of rabbit kidney

The Na⁺2Cl^–K⁺ cotransporter in the apical membrane of the cortical thick ascending limb of the Henle's loop (cTAL) of rabbit nephron utilizes the electrochemical gradient for Na⁺ to transport K⁺ and Cl^– against an unfavorable electrochemical gradient from lumen to cell interior. In the present study attempts are made to measure intracellular K⁺ activity ( ) under control conditions and after inhibition of the cotransport system by furosemide (50·10^–6 mol·l^–1). 70 cTAL segments of 55 rabbits were perfused in vitro. Conventional Ling-Gerard and K⁺-selective microelectrodes were used to measure the PD across the basolateral membrane (PD_bl) as well as the PD sensed by the single barrelled K⁺-selective electrode ( ). PD_bl was –64±1 (n=65) mV and +15±1 (n=32) mV under control conditions. The positive value, significantly different from zero, indicates that is higher than predicted for passive distribution. The estimate for obtained from PD_bl and was 113±8 mmol·l^–1. Furosemide lead to the previously reported hyperpolarization of PD_bl by 17±4 (n=13) mV and to a reduction of from 15±1 to 5±1 (n=20) mV. The , obtained from this set of data, was 117±9 mmol·l^–1, and was not different from the control value. The present data indicate that is significantly above Nernst equilibrium under control conditions. The source for this above equilibrium accumulation of K⁺ stems from the carrier mediated uptake of Na⁺2Cl^– and K⁺. Consequently, the electrochemical gradient for K⁺ is rapidly reduced when the carrier is blocked by furosemide. The electrochemical gradient for K⁺, under control conditions, energizes the back leak of K⁺ from cell to lumen. This K⁺ flux is one component responsible for the lumen positive transepithelial PD.Parts of this study have been presented at the 58th Tagung Deutsche Physiologische und Deutsche Pharmakologische Gesellschaft, Mainz 1983; 67th Federation Meeting, Chicago 1983. This study was supported by Deutsche Forschungsgemeinschaft Gr. 480/5-7     

快速冷冻与慢速冷冻条件下复合组织血管内皮的生物活性

背景：恢复良好血供对于复合组织保存及再植至关重要,但不同冷冻方法对血管活性影响不同。 目的：比较快速冷冻与慢速冷冻方法对复合组织血管内皮活性的影响。 方法：新西兰大白兔后肢分别进行快速冷冻与慢速冷冻,快速冷冻的兔后肢直接放入液氮中,慢速冷冻组经4 ℃,-20 ℃,-80 ℃冷冻后再投入到液氮中,各组依次保存12 h,3 d,7 d后快速复温,并设对照组。所有新西兰大白兔后肢均经甲醛溶液固定后行苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色检测各组血管内皮的病理变化。 结果与结论：快速冷冻组和慢速冷冻组冷冻12 h,3 d,7 d时兔血管组织形态评分均低于对照组(P < 0.05)。快速冷冻组冷冻12 h,3,7 d时血管内皮组织血管内皮生长因子评分低于慢速冷冻组(P < 0.05)。证实,慢速冷冻法能更好的维持复合组织中的血管内皮细胞的生物学活性。关键词：深低温冷冻;复合组织;冷冻方法;内皮细胞活性;组织构建 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.20.011     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较

背景：通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。 目的：对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。 方法：①预损伤法：预损伤SD乳鼠坐骨神经,3 d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法：直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5~7 d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。 结果与结论：预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P > 0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

高压氧联合许旺细胞移植脊髓损伤大鼠电生理及后肢功能的变化

背景：高压氧治疗可以改善脊髓损伤区微环境,联合许旺细胞移植有望提高大鼠脊髓损伤疗效。目的：观察高压氧联合许旺细胞移植对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响。方法：80只雌性SD大鼠建立脊髓损伤模型后随机分成4组,每组20只,空白对照组和细胞移植组分别在建模6 h后尾静脉注射L-DMEM培养液和许旺细胞(3×10⁶个)悬液,高压氧组建模1 h后开始高压氧治疗,联合组进行高压氧和许旺细胞移植联合治疗。于移植后1,3 d以及1,2,3,4周进行斜板试验、改良Tarlov 评分,BBB评分评定大鼠后肢运动功能恢复情况;移植第4周PCR检测各组脊髓组织中SRY基因表达;移植第8周行辣根过氧化物酶示踪及神经电生理检测。结果与结论：联合组下肢运动功能优于细胞移植组和高压氧组,细胞移植组和高压氧组优于空白对照组。细胞移植组和联合组有SRY基因表达,对照组和高压氧组未检测到SRY基因。辣根过氧化物酶阳性神经纤维数：联合组>细胞移植组和高压氧组>空白对照组,差异有显著性意义(P < 0.01)。联合组大鼠体感诱发电位及运动诱发电位的潜伏期、波幅明显优于其他3组(P < 0.05或P < 0.01)。结果提示高压氧与许旺细胞移植联合应用可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,改善肢体运动功能和电生理功能,其治疗效果优于单独应用高压氧或许旺细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：