脊髓灰质炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的 建立及应用

摘要:目的　在省级脊髓灰质炎（脊灰）实验室建立一种快速、灵敏、准确的脊灰病毒（Poliovirus,PV）型内鉴定（Intratypic Differentiation,ITD）及基因型鉴定的方法。方法　以PV衣壳蛋白（Capsid Protein）VP1编码区基因序列为目标,设计并合成引物和 Taqman 探针,建立实时荧光定量RT-PCR（Real-time RT-PCR,rRT-PCR）检测体系,并考察该方法的重复性、灵敏性和特异性。结果　该方法能快速、灵敏地鉴定出PV血清型及毒株类型,在1.0×108 copies/μl～1.0×103 copies/μl检测范围之间有良好的线性关系,相关系数为0.993,最低检测限为103.5CCID50/0.1 ml。结论　成功在省级实验室建立了PV的r RT-PCR检测技术,该技术特异性强,敏感性高,操作简便快速,适用于PV的型内鉴定和基因型鉴定,可应用于实验室诊断,为免疫策略快速提供依据。     

贵州省环境水体肠道病毒监测分析

目的研究贵州省环境水体中肠道病毒(Enterovirus,EV),尤其是脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)的感染和分布情况,为最终根除脊灰计划提供科学依据。方法环境水样经浓缩处理后进行病毒分离、鉴定和核苷酸序列分析。结果 22份水样中检出阳性14份,阳性率为63.6%,其中PV 3株,非脊灰肠道病毒(Non-Polio Enterovirus,NPEV)58株。结论 EV广泛存在环境水体中,分离出的3株PV均为疫苗株,未发生变异,未在环境及人群中发生循环,贵州省继续维持无脊灰状态。     

水体中病毒富集方法研究进展

近年来,由于水污染的加剧,在多种水体中均发现了致病病毒。水传播病毒导致人体感染的病例时有报道,已经引起了人们的广泛关注^〔1-2〕。对水体中的病毒进行快速有效的检测,是阻断病原体传播,减少疾病流行的首要条件。水体中的病毒含量较少,浓度较低,一般很难直接检测,常需要预先富集才能检测。病毒的富集方法多种多样,主要包括絮凝沉淀法、吸附洗脱法、免疫学方法、超滤法等。病毒富集方法的选择和待测水样体积的确定与水中病毒的密度、水样类型以及水中干扰物质的影响有关。合适的病毒富集方法不仅可以提高病毒的回收率,而且对提高后续病毒检测的灵敏度大有帮助。现对不同的水体病毒富集方法综述如下。     

阳电滤膜法浓缩水中病毒效果的实验研究

本文报道了国产改性玻璃纤维阳电滤膜吸附洗脱法浓缩水中病毒的效果。人工加毒水样用此滤膜过滤吸附后,用3%pH9.5牛肉膏液洗脱,病毒回收率为70±%。此法有效、简便、经济。与目前国外各种类型的阳电滤膜回收效果相同。     

西尼罗病毒PCR检测方法的建立

[目的]应用通用引物建立快速、敏感、特异的PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染相关疾病的实验室监测和早期诊断。[方法]以西尼罗病毒感染者血清分离得到的病毒RNA逆转录cDNA为检测样本,通过对多株病毒基因组序列各区段保守性进行分析比较,在基因组非编码区设计引物和探针,分别用巢式PCR和荧光定量PCR方法对样本进行扩增。[结果]以西尼罗病毒RNA逆转录cDNA为模板,采用所建立的两种PCR方法,均可得到阳性检测结果。[结论]本研究设计的PCR扩增引物具有较好的通用性;建立的实时荧光定量PCR结合巢式PCR用于检测WNV的分析方法具有互补性,为研制成熟的西尼罗病毒检测试剂盒提供实验基础。     

三种阳电滤膜法浓缩水中病毒的效果比较研究

报道了三种阳电滤膜吸附洗脱法浓缩水中病毒的效果。人工加毒水样分别用Zeta Plus 30s、50s、 Zetapore IMDS滤膜吸附后,用pH9.5、3％牛肉膏洗脱病毒,回收率分别为51±％、62±％、67％,此法有效、简便、经济。与目前国外报道回收效果基本一致。     

水中诺如病毒浓缩与应急检测研究

目的探索适合于基层实验室开展的水中诺如病毒浓缩与应急检测的方法,评估钙离子法对水体中诺如病毒的富集效果及检测灵敏度,为水源性诺如病毒突发疫情的病原检测提供可靠的检测数据。方法将不同浓度的指示病毒(GⅡ型诺如病毒)加入到不同水样中,用钙离子法进行富集,用荧光定量PCR检测,根据富集前后的病毒浓度,评估方法的回收率;根据不同梯度的检测值,评估方法的灵敏度。同时制备不同的模拟水样进行荧光定量PCR检测。结果钙离子法的平均回收率为81.6%,检测灵敏度为模拟样本中病毒浓度为10 copy/μl。而10份不同模拟水样荧光定量PCR检测阳性9份。结论钙离子法浓缩水样中的诺如病毒,回收率与灵敏度均较高,操作简单;同时,荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏的优点,适用于基层实验室开展水体中诺如病毒的应急检测。     

性别和年龄对湖北地区人群外周血Toll样受体3 和7基因表达的影响

摘要:目的　观察不同性别和年龄的健康人群外周血单个核细胞（PBMC）中Toll样受体3（TLR3）和Toll样受体7（TLR7）mRNA表达,探讨性别和年龄对TLR表达的影响。方法　选择健康人群113名,取抗凝全血,实时荧光定量PCR检测TLR3和TLR7 mRNA表达。结果　健康青年女性TLR3表达量比中老年女性高,差异有统计学意义（t＝34.65,P＜0.05）,而TLR7基因表达水平的差异无统计学意义（t＝1.72,P＞0.05）,健康青年男性TLR3,TLR7表达量比中老年男性高,差异均有统计学意义（t＝17.63,7.17,P＜0.05）。健康中老年女性TLR7表达量比中老年男性高,差异有统计学意义（t＝4.03,P＜0.05）,但是TLR3表达量的差异没有统计学意义（t＝-0.41,P＞0.05）。健康青年女性TLR3,TLR7表达量比青年男性高,差异均有统计学意义（t＝20.57,11.66,P＜0.05）。结论　性别和年龄与对Toll样受体的表达有一定关系,为疾病预防和临床个体化治疗提供新的思路。     

水中有毒蓝藻的荧光定量PCR检测法

目的建立水中有毒蓝藻的荧光定量PCR检测方法。方法取20 ml纯培养藻液和500 ml采集水样用0.22μm滤膜进行过滤,收集藻体提取DNA,应用SYBR Green对微囊藻毒素合成酶基因mcy A进行实时荧光定量PCR检测,根据软件获取的以模板标准品与Ct值建立的标准曲线,计算样品中的mcy A基因拷贝数和产微囊藻毒素(MC)的蓝藻的浓度。结果在13.8~1.38×106拷贝/L的线性范围内,所得回归方程为y=-3.45 lgx+36.2,r=0.989 9。方法检出限为10.7拷贝/L,加标回收率为88.4%~106.0%,RSD为3.6%~4.0%。应用该方法和传统的显微镜检法对实验室纯培养产毒铜绿微囊藻的检测结果呈正相关(r=0.994 0,P0.05)。结论该方法灵敏度高、精确度高、检测范围宽、重复性好,适合用于蓝藻水华暴发的早期预警。     

2015年济南市环境中禽流感病毒监测与分析

目的 通过对济南市涉禽环境禽流感病毒监测,了解H5、H7和H9亚型禽流感病毒在外环境分布情况,为禽流感的防控提供科学依据。方法 2015年按季度采集济南市3类涉禽场所不同种类环境样本1 260份,采用实时荧光定量PCR法检测禽流感病毒核酸,使用Epi Info统计分析数据。结果 甲型流感病毒(Influenza A virus, FluA)在活禽农贸市场和大型家禽养殖场阳性率分别为29.67%和2.86%,集中散养户未检出FluA,3类场所检出率差异有统计学意义(χ2 = 55.77,P ＜ 0.001)。活禽农贸市场H9和H5亚型检出率分别为16.11%和6.67%,未检出H7亚型,3种亚型检出率差异有统计学意义 (χ2 = 18.18,P ＜ 0.001)。FluA在案板涂抹物、清洗禽类污水、禽类饮水、笼具涂抹物和禽粪检出率分别为50.00%、37.90%、20.66%、13.21%和13.11%,不同种类标本FluA的检出率差异有统计学意义(χ2 = 54.69,P ＜ 0.001)。采样季度对FluA检出率差异无统计学意义(χ2 = 0.53,P ＞ 0.05)。结论 济南市环境中存在H5和H9亚型禽流感病毒,以H9亚型为主;活禽农贸市场是感染禽流感的危险场所。应加大对活禽农贸市场的消毒力度,加强对禽流感病毒的持续监测。     

广元市城区居民生活饮用水水源卫生现状调查

摘要:目的 了解广元市城区饮用水水源卫生现状,发现问题并提出建议,更好的保证饮用水卫生安全。方法 对广元市城区5个水厂的水源地进行现场调查,查阅分析西湾水厂水源水质监测报告。结果 调查广元市城区5个以嘉陵江为水源水的水厂,60%的水源地划分明确,按照距离由近及远依次为一级、二级和准水源保护区,明确设立了标志牌,标明地域范围及其禁止进行的活动,并有专人进行定时和不定时巡查,密切监测水源安全状况。80%的水源地周围存在采砂活动,且堆砂较多;另外,80%的水源与高速公路、铁路相互交叉、伴行,时刻面临交通事故特别是危化品的威胁。结论 广元市城区居民生活饮用水水源卫生状况总体上安全,水质良好,但也存在小规模供水水厂水源保护较差,水源保护区划定不规范,无备用水源等问题。     

2011-2014年云南省罗平县农村饮水安全工程水质 监测结果分析

摘要:目的　掌握罗平县农村饮用水安全工程水质卫生状况,为预防控制水性疾病和饮用水公共卫生事件提供可靠依据。方法　根据《云南省农村饮用水水质卫生监测技术方案》的要求,按照《生活饮用水卫生标准检验方法》（GB/T5750-2006）进行水样采集和检测,《生活饮用水卫生标准》（GB5749-2006）进行结果评价。结果　2011-2014年共检测供水点80个,各年检测20个供水点,检测水样320份,合格水样37份,合格率仅为11.6%。不合格项目主要为微生物指标,合格率枯水期为12.5%,丰水期为10.6%;合格率比较差异无统计学意义（χ2＝0.275,P＞0.05）。水源类型有地面水和地下水,其中地面水276份,地下水44份,微生物指标地面水合格率为3.3%,地下水合格率为63.6%,地下水合格率明显高于地面水（χ2＝50.833,P＜0.005）;感官性状指标地面水合格率为77.5%,地下水合格率为100.0%,差异具有统计学意义（χ2＝12.250,P＜0.005）。一般化学指标地面水合格率为92.8%,地下水合格率为100.0%,差异无统计学意义（χ2＝3.401,P＞0.05）。结论　罗平县农村饮用水微生物污染是主要的卫生问题。目前建设的农村安全饮水工程,只是改变了供水方式,供水未处理现象普遍存在,应引起有关部门的高度重视,建议加强对农村集中式供水的管理和监督。     

Quantification of Saprolegnia parasitica in river water using real-time quantitative PCR: from massive fish mortality to tap drinking water

Since 2010, the Loue River (Franche-Comté, East of France) has been suffering from massive fish kills infested by Saprolegnia parasitica. The river supplies inhabitants of the city of Besançon in drinking water, raising the question of a potential risk through both water consumption and use. We developed a real-time quantitative PCR (qPCR) to quantify S. parasitica in the Loue River as well as in the drinking water. A weak spatial trend is suggested with greater quantities of S. parasitica observed at the sampling station close to the main pumping station. No S. parasitica DNA was detected in the tap water connected to pumping stations. The use of qPCR, which combines specificity, practicality, speed and reliability, appears to be an effective tool to monitor the spatial and temporal dynamics of this oomycete and identify the risk period for wild salmonid populations in the field, for fishery management or in aquaculture.     

氯灭活水中脊髓灰质炎病毒机制的研究

目的探讨氯对脊髓灰质炎病毒核酸和衣壳蛋白的破坏在灭活病毒中的作用,并对病毒基因组受损区域进行定位,阐明氯灭活脊髓灰质炎病毒的机制。方法以不同剂量(0.1、0.5、1.0、1.5和2.0mg/L)的有效氯对脊髓灰质炎病毒作用不同时间(0、15、30、45和60min),采用大片断逐步步移PCR(long-overlapping PCR)分析氯对病毒全基因组的损伤,以ELISA技术分析氯对病毒衣壳蛋白的破坏,以细胞培养检测病毒感染性。结果脊髓灰质炎病毒各部分对氯的抵抗力强弱存在如下关系:病毒衣壳>基因组蛋白编码区>基因组5′端非编码区(noncoding region,NCR)>基因组3′端NCR>poly A尾;脊髓灰质炎病毒的polyA尾和3'端NCR破坏可造成病毒的感染性下降,但不能完全灭活病毒;5′端NCR的破坏与病毒感染性的消失一致,损伤区域主要位于富含二级结构的区域。结论氯主要通过破坏脊髓灰质炎病毒核酸而非衣壳蛋白灭活病毒;病毒基因组5′NCR内二级结构区域的破坏对脊髓灰质炎病毒具有致死效应。     

致泻性大肠埃希菌2种检测方法的比较

摘要:目的　通过对致泻性大肠埃希菌2种检测方法的比较,为今后的细菌鉴定工作提供参考。方法　分别按照GB/T4789.6-2003和食源性疾病监测工作手册,检测本市某次因市政施工损坏供水管道,导致的饮水污染事件中分离出的大肠埃希菌。并对结果进行比较分析。结果　按照国标方法检出1株EPEC、2株EIEC。按照工作手册进行PCR鉴定后,2株EIEC应为EAEC。结论　工作手册采用的PCR技术可提高致泻性大肠埃希菌检测的准确率和及时率,建议修订国标。     

氯化镉对大鼠肾细胞内MAPK基因mRNA表达的影响

目的 观察不同浓度氯化镉(CdCl2)对大鼠肾(NRK)细胞MAPK基因mRNA表达的影响.方法 应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度CdCl2(0、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μmol/L)染毒24 h后对NRK细胞存活率的影响;应用带有SYBR Green Ⅰ的实时荧光定量PCR技术观察不同浓度CdCl2(0、2.5、5.0和10.0μmol/L)对NRK细胞内MAPK基因(ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2)mRNA表达的影响.结果 以阴性对照组(CdCl2 0μmol/L)NRK细胞存活率为100%,各染毒组(CdCl25.0、10.0、20.0和40.0μmol/L)NRK细胞存活率分别为72.28%、39.95%、15.66%、10.39%,且与对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),并存在剂量-效应关系,经CdCl2染毒后,各实验组(CdCl2 2.5、5.0和10.0μmol/L)NRK细胞的ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2基因的mRNA的相对表达量均低于阴性对照组(P<0.05或P<0.01).结论 CdCl2可能引起NRK细胞内MAPK基因mRNA的表达水平发生改变.