立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的采用TaqMan-MGB探针建立立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测方法.方法依据立氏立克次体外膜蛋白B基因序列设计引物和探针,以克隆的ompB基因片段为DNA模板,在ABI 7900型荧光定量PCR检测仪上建立实时荧光定量PCR检测方法.结果建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数呈线性关系（R2=0.996）,最低检测浓度为5拷贝/μl;用荧光定量PCR方法检测其他相关立克次体和常见非立克次体病原菌,检出结果均为阴性.用该方法检测立氏立克次体感染的豚鼠血液标本、小鼠脾脏标本及细胞培养标本,检测的结果与立氏立克次体感染相关.结论研究建立的检测立氏立克次体实时荧光定量PCR方法具有高特异性和高敏感性,适用于快速检测各种样本中的立氏立克次体和立氏立克次体感染早期的实验室诊断.     

实时荧光定量PCR检测普氏立克次体

目的 采用新型TaqMan—MGB探针建立检测普氏立克次体的实时荧光定量PCR方法。方法 根据普氏立克次体外膜蛋白B的基因（ompB）序列设计引物和探针，以克隆的ompB基因片段作DNA模板，在荧光定量PCR检测仪（ABI7900型）上建立实时荧光定量检测方法。结果 建立的定量标准曲线的循环阈值（Q）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．999）；与巢式PCR相比较，荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测莫氏立克次体及其他相关立克次体和细菌DNA，检出结果均为阴性。用荧光定量PCR检测普氏立克次体感染的豚鼠血标本，某些样本检测为阳性，而用巢式PCR检测的结果均为阴性。结论 研究中建立的检测普氏立克次体实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性，适合于快速检测样本中微量普氏立克次体DNA，可用作临床实验室快速确诊流行性斑疹伤寒。     

荧光定量PCR技术和分离培养法检测小肠结肠炎耶尔森菌的比较研究

目的比较荧光定量PCR法和分离培养法在检测小肠结肠炎耶尔森菌中特异性和灵敏度的差异。方法从686份婴幼儿腹泻患儿的粪便标本中提取细菌基因组DNA,在进行小肠结肠炎耶尔森菌保守基因fox A和黏附侵袭位点基因ail的实时荧光定量PCR检测的同时,也按常规方法进行菌株分离培养,并对2种方法的检出结果进行比较分析。结果686份标本中,分离培养法检测结果为阳性4份,阴性682份;荧光定量PCR法检测结果为阳性5份,阴性681份。荧光定量PCR法检出的5份阳性标本中,分离培养法结果为4份阳性,1份阴性。结论采用fox A联合ail基因的荧光定量PCR法特异性强,灵敏度高,且操作简便快速,检测成本低,对于监测小肠结肠炎耶尔森菌有重要意义。     

浙江省蜱标本中斑点热群立克次体rOmpA和gltA基因检测

目的了解浙江省部分山区蜱中感染斑点热群立克次体的状况,探讨以外膜蛋白A（rOmpA）和柠檬酸合成酶基因（gltA）为靶基因的PCR方法可行性。方法利用PCR方法,检测天台县左溪镇和临安县西天目地区共46组蜱类标本中rOmpA和gltA基因特异片段。对所检测到的阳性结果进行克隆与序列测定,并进行聚类分析。结果从46组蜱标本中检测发现2组长角血蜱中斑点热群立克次体的rOmpA和gltA基因片段均为阳性,核酸序列基本一致,但推测斑点热群立克次体种的进化位置存在差异。结论浙江省部分山区存在蜱中感染斑点热群立克次体的状况。利用rOmpA和gltA基因能从标本中检测到斑点热群立克次体,但从2个结果推测立克次体的分类位置存在差异。     

海南省2009年-2011年发热病人立克次体病检测及结果分析

目的分析海南省2009年-2011年不明原因发热病人中立克次体的感染状况及基因型别,探讨其防制对策。方法利用巢氏PCR方法,检测海南省不明原因发热病人血液标本立克次体gro EL基因的特异性片段,并对阳性结果进行序列测定及聚类分析。结果 236份病人标本中27份gro EL阳性,阳性率为11.4%。阳性PCR产物测序并聚类分析结果显示,恙虫病东方体序列与R.tsutsugamushi(M31887)恙虫病东方体同源性高;斑点热群立克次体和Rickettsia sibirica(AY059014)等11株斑点热群立克次体同源性较接近,而与2007年在澄迈县1例病人血标本中分离到Rickettsia sp Hainan 1(gb|EU402925)斑点热立克次体比较同源性较低;斑疹伤寒群立克次体和Rickettsia typhi str.B9991CWPP(CP003398)斑疹伤寒群立克次体共处于同一分支,同源性为100%。结论海南省不明原因发热病人中持续存在斑点热、斑疹伤寒和恙虫病感染的现象,应加强立克次体病的疾病监测和实验室检测能力。     

海南省发热病人标本中斑点热立克次体groEL基因检测

目的了解海南省发热病人中感染斑点热群立克次体的状况。方法利用巢氏PCR方法,检测海南省2009-2010年医院送检的117份不明原因发热病人血标本的groEL基因的特异性片段,对所检测到的部分阳性结果进行序列测定,并进行聚类分析,分析海南省斑点热群立克次体优势株的流行情况。结果从117份发热病人血标本中发现有18份groEL阳性,取12份groEL阳性核酸产物进行测序,7份核酸序列基本一致。结论海南省发热病人中持续存在斑点热群立克次体感染的状况,应加强对斑点热的实验室检测能力,为其防治提供有力依据。     

实时荧光PCR检测肠产毒性大肠埃希菌耐热肠毒素基因

目的：建立实时荧光PCR的方法检测肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）耐热肠毒素（ST Ia和ST Ib）基因。方法：设计引物和探针,优化实时荧光PCR检测STIa和STIb基因的反应条件。检测ST阳性或阴性的20株大肠埃希菌和2株霍乱弧菌以评估方法的特异性。对90份腹泻病人肛拭子标本,经BP增菌4 h后以煮沸法提取DNA模板,直接检测STIa和STIb基因,阳性标本以普通PCR检测ST基因进行复核,并从阳性的初始肛拭子标本中分离鉴定携带ST的菌株。结果：实时荧光PCR具有较高的特异性。90份腹泻病人标本中,9份标本ST Ib基因阳性（10.0%）,2份标本为ST Ia基因阳性（2.2%）;阳性标本以普通PCR复核,符合率为100%。在9份STIb基因阳性和2份ST Ia基因阳性的初始肛拭子标本中,分别有8份和2份分离到STIb基因阳性的ETEC和STIa阳性的ETEC。结论：建立的实时荧光PCR方法,可用于ETEC菌株ST毒力基因鉴定和临床腹泻粪便标本的直接快速筛检。     

浙江省在蜱中检测到斑点热群——立克次体DNA片段

目的 了解蜱、鼠中自然感染斑点热群立克次体的状况。方法 用聚合酶链反应（PCR）检测鼠类脾脏和蜱类中的斑点热DNA片段。结果 在金华市金东区捕获社鼠2只，黄毛鼠10只，黑线姬鼠4只，用PCR检测结果均为阴性。用PCR检测49只中华硬蜱，阳性8只，阳性率16．33％。结论 初步认定浙江省存在斑点热病原，尚需进一步调查。     

漏声表面波生物传感器直接快速检测病原体DNA的实验研究

目的应用漏声表面波生物传感器直接检测从临床标本中提取的HPV基因组DNA。方法选取36例临床确诊为宫颈癌的患者,提取其生殖器分泌物的基因组DNA,并经荧光定量PCR检测为HPV阳性的标本,以14例健康志愿者为阴性对照;利用漏声表面波生物传感器检测临床样本,并与荧光定量PCR法进行方法学比较。结果传感器法检测35例标本为阳性,阳性率为97.22%,而荧光定量PCR法检测36例均为阳性;14例阴性对照标本中,两种方法的检测结果均为阴性;传感器法的检测限为1.21pg/L。结论传感器法与荧光定量PCR法差异无统计学意义,一致性较好,且漏声表面波生物传感器实现了对临床标本中HPV基因组DNA的直接快速检测。     

实时荧光PCR检测志贺菌特异基因ipaH

目的：建立一种灵敏、快速检测志贺菌的实时荧光PCR方法,研究志贺菌在腹泻病人中的感染情况。方法：针对志贺菌特异性基因ipaH设计引物、探针,应用培养分离的志贺菌进行验证,同时检测360例临床标本并与培养法进行对照。结果：应用实时荧光PCR方法,10株志贺菌检测结果均为阳性,10株非志贺菌结果均为阴性;检测灵敏度达到4 cfu/test。360例临床标本中实时荧光PCR方法检测出29例阳性,培养法检测出12例阳性。结论：实时荧光PCR法检测志贺菌具有灵敏度高、快速方便的特点,可用于检测腹泻病人志贺菌感染。     

用PCR/RFLP技术对黑龙江沿岸蜱类和鼠类中北亚蜱传斑点热的检测

为了解黑龙江沿岸部分地区斑点热自然疫源地存在情况，作者用PCR／RFLP的方法检测该地区蜱类及鼠类中的斑点热群（spottedfevergroup，SFG）立克次体。结果从该地区的森林革蜱、嗜群血蜱、黑线姬鼠、东方田鼠、麝鼠及棕背中均扩增出了斑点热群立克次体的特异片段，而对斑疹伤寒立克次体、恙虫病立克欢体、Q热立克次体则为阴性。PCR产物经PstⅠ及RsaⅠ酶切后发现它们的酶切图谱与西伯利亚立克次体完全相同，而有别于其它斑点热群立克次体标准株。作者认为黑龙江沿岸调查点可能存在北亚蜱传斑点热的自然疫源地。     

我国斑点热立克次体新种检测及其rOmpA基因序列分析

采用斑点热群立克次体特异引物坟增福建南部来源蜱标本和标本中的ＤＮＡ,以发现我国可能存在的新种斑点热群立我闪体。以立氏立克次体ｒＯｍｐＡ基因序列中的相关我为引物,扩增标本扣ｒＯｍｐＡ基因部分片段,用ｐＧＥＭ－Ｔ载体及其宿主菌进行阳性克隆筛,阳性克隆经鉴定这后提取质粒ＤＮＡ,进行序列测定。测定序列用Ｂｌａｓｄｔ软件进行序列同源生比较并采集相关序列,用Ｂｏｏｔｓｒｒｉｐ方法随机取样１００次,用ＰＨＹＬＩ     

实时荧光PCR检测基孔肯雅病毒方法的建立及初步应用

目的 建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法 针对基孔肯雅病毒的基因序列,设计、合成引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应条件,建立TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法.利用建立的方法对30例基孔肯雅热病标本和10份基孔肯雅病毒保存液进行扩增、检测和结果分析,并与常规RT - PCR方法的检测结果进行比对.结果 实时荧光定量PCR法比常规RT - PCR法快速、灵敏.40份标本TaqMan荧光探针法、SYBR荧光染料法和常规RT - PCR方法的阳性率分别为:17.5％、17.5％、15％.统计分析表明,3种方法差异不具有统计学意义.结论 实时荧光定量PCR方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.     

实时荧光定量PCR在HLA-B~*5801等位基因检测中的性能评价

目的:评价采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法检测人类白细胞抗原B位点5801(HLA-B*5801)等位基因的重复性、准确性和最低检出限。方法:选取HLA-B*5801阳性和阴性样本各2例,每一样本每批内测定5次,连续测定2 d,共重复测定10次,评价方法的重复性。收集20例已知阳性和阴性样本,实时荧光定量PCR方法进行检测,同时与金标准DNA测序法的结果进行比对,评价方法的准确性。同时进一步选取其中1例阳性DNA样本进行梯度稀释后再行检测,评价方法的最低检出限。结果:4例样本重复性检测阳性和阴性符合率为100%;实时荧光定量PCR法与DNA测序法检测结果符合率为100%,收集的20例已知阳性和阴性样本中HLA-B*5801阳性8例,阴性12例;实时荧光定量PCR的最低检出限为2.5 ng/μl DNA。结论:实时荧光定量PCR可方便、快捷地检测HLA-B*5801等位基因,其准确度高,重复性好,适用于临床常规样本的检测。     

裂谷热病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于裂谷热病毒的检测。方法通过序列对比在裂谷热病毒L基因保守区设计引物及Taqman探针,建立实时荧光定量PCR反应体系。结果经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达37拷贝/μl,通过检测同为蚊媒传播的日本脑炎病毒、黄热病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒无交叉反应。结论本方法的建立在国境口岸传染病的防控方面有较好的应用前景。     

实时荧光PCR检测HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液中HBV DNA研究

目的对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性、乙型肝炎核心抗体（抗HBc）阳性的献血者血液进行经输血传播乙型肝炎病毒（HBV）的风险评估,为完善HBV血液筛查模式及确保临床用血安全提供依据。方法对献血者血液常规检测阴性的标本进行8×45 μL汇集,应用实时荧光聚合酶链反应(PCR)进行混样核酸检测HBV DNA。对血液常规筛查和混样核酸检测合格的标本,进行随机乙型肝炎血清学5项标志物的酶联免疫吸附试验(ELISA)。对获得的HBsAg阴性、混样HBV DNA阴性、抗HBc阳性的标本,进一步采用单份样本（720 μL）实时荧光PCR法检测并定量分析。结果混样标本共检测12 552份,检出HBsAg阴性、HBV DNA阳性标本2份,阳性率为0.02%。随机筛查混样核酸检测阴性标本614份,检出抗HBc阳性标本320份,对此320份标本进行单份核酸检测,检出阳性标本1份,阳性率为0.31%。结论HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液存在输血传播HBV的风险,应用核酸扩增技术检测血液HBV DNA能大大提高血液安全性。     

泰泽氏菌TaqManMGB探针荧光定量PCR方法的—立及应用

目的 建立泰泽氏菌的TaqMan小沟结合物(MGB)探针荧光定量PCR检测方法.方法 针对泰泽氏菌16S rRNA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008-2011年采集的1156份临床样本进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照.结果 泰泽氏菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肝螺杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌之间无交叉反应,检测灵敏度达2.2 copy/μl.标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.204,PCR效率为100％.对1156份临床样本进行检测,荧光定量PCR检出101份泰泽氏菌阳性样本,而普通PCR则仅检出44份.荧光定量PCR方法从临床样本中检出泰泽氏菌DNA仅需2h.结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有特异、灵敏和稳定性,适于泰泽氏菌的快速检测.     

Detection of Ehrlichia spp. and Anaplasma phagocytophilum in whole blood specimens using a duplex real-time PCR assay on the ARIES instrument

Cases of tick-borne diseases are increasing in the United States, and new tick-borne pathogen species causing human illness are being discovered. The specific etiology is generally difficult to diagnose based on clinical signs and symptoms alone, because of their generalized nature and often lack of a known tick bite. For some infections, such as Lyme disease and spotted fever group rickettsioses, serology remains the most appropriate laboratory diagnostic tool, but for others such as anaplasmosis, ehrlichiosis, and babesiosis, direct detection in the blood is preferred for rapid diagnosis. In Kentucky, USA, the area served by our laboratory, the most commonly reported tick-borne illnesses include spotted fever group rickettsiosis, ehrlichiosis and Lyme disease, but of these three diseases, only ehrlichiosis is well-suited for direct detection using PCR methods during the acute stage of illness. We report here the validation of a duplex real-time PCR assay using whole blood specimens on the Luminex ARIES® instrument, combining DNA extraction, amplification and detection into a one-step process. This method allows for rapid and sensitive detection of acute infections with Ehrlichia spp. and Anaplasma phagocytophilum using whole blood specimens. We included A. phagocytophilum to monitor emergence of this pathogen in Kentucky, since surrounding states have reported many more cases than Kentucky.     

9种蜱媒病原体xMAP悬浮芯片高通量检测方法的建立

目的建立森林脑炎病毒（forest encephalitis,TBEV）、新疆出血热病毒（Xinjiang hemorrhagic fever,XHF）、斑点热群立克次体（spotted fever group rickettsiae,SF）、巴贝西原虫（Babesiaspp.）、埃立克体（Ehrlichieae）、土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis,Fr）、Q热立克次体（Coxiella burneti,Q）、伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi,Bo）、巴尔通体（Bartonella,Barton）9种蜱传病原体的悬浮芯片多重检测方法。方法将9种蜱媒病原体分为两组构建多重PCR体系,各上游引物均带有不同的anti TAG标记,下游引物标记生物素,PCR产物与偶联对应x TAG的磁性微球进行杂交,结合物用Bio plex 100液相芯片系统检测,并对9种蜱媒病原体分别进行单一、多重检测分析。结果将平均荧光强度的判定阈值定为背景对照的3倍,多批次实验均能对混合模板进行准确鉴定,未出现交叉反应,表明该方法的稳定性和特异性均较好;同时对该方法的灵敏性进行鉴定,结果表明本检测方法灵敏度良好。结论通过利用偶联有标签序列及生物素的引物对,成功建立了可同时检测9种蜱媒病原的液相芯片检测技术平台;该平台对于蜱媒病原体的检测具有较好的应用前景。