肠上皮细胞中性氨基酸载体B0AT1的真核表达及稳定转染体系的建立

目的: 构建可表达人中性氨基酸载体B0AT1基因的真核表达载体,建立重组质粒转染的Hela细胞系,筛选出稳定表达人B0AT1的细胞株. 方法: 提取人正常小肠上皮细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出B0AT1基因片段,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后,将其插入至真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-B0AT1,转化E.coli DH5α菌株感受态细胞,将阳性克隆脂质体法转染Hela细胞,经G418筛选获得稳定表达株,用RT-PCR法检测B0AT1基因的mRNA表达. 结果: 从小肠上皮细胞中成功克隆到人B0AT1基因.酶切和序列测定表明已成功构建真核表达载体pcDNA3.1-B0AT1,将此重组质粒转染的Hela细胞,可稳定表达人B0AT1基因,并筛选出稳定表达B0AT1的Hela细胞系.氨基酸摄取实验证实,转染pcDNA3.1-B0AT1的Hela细胞具有B0AT1基因的生物学活性. 结论: 重组人中性氨基酸载体B0AT1克隆成功,并在Hela细胞中获得稳定表达.     

戊型肝炎病毒ORF3基因转染HeLa细胞及其稳定表达

目的 将戊型肝炎病毒ORF3基因转染HeLa细胞,建立能稳定表达ORF3蛋白(pORF3)的细胞株.方法 将ORF3基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-ORF3.电穿孔法将其导入HeLa细胞中,G418筛选得到稳定抗性的细胞株,并用RT-PCR和Western印迹法分别从mRNA水平和蛋白水平检测ORF3的表达.结果 成功构建了重组表达质粒pcDNA3-ORF3,并筛选获得能稳定表达pORF3蛋白的HeLa细胞株.结论 pORF3蛋白能够在HeLa细胞中稳定表达,为进一步研究其生物学功能奠定了实验基础.     

HO-1不同活性真核表达载体的构建及鉴定

目的构建含有HO-1基因的重组载体并将其稳定转染到肝癌细胞系HepG2中。方法采用PCR技术扩增wtHO-1/mHO-1G143H基因片断,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后连接pcDNA3.1（＋）载体与目的片段,转化DH5a菌株感受细胞,获得阳性重组质粒。采用脂质体法转染HepG2细胞系,G418筛选抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot检测转染细胞系中HO-1基因的表达。结果成功制作了HO-1活性增高和降低的细胞模型。结论 HO-1不同活性真核表达载体的成功构建,为进一步研究HO-1的功能奠定了基础。     

肿瘤转移抑制基因nm23-H1在人肺癌细胞的表达及其检测

目的：选择已分离鉴定的人巨细胞肺癌细胞高转移亚型PGBEl，转染肿瘤转移抑制基因nm23-H1，以获得稳定表达nm23-H1基因的人肺癌细胞株。方法：采用亚克隆方法获得pcDNA3．1（-）／nm23-H1真核表达载体并进行双酶切和测序鉴定；应用脂质体转染法将重组质粒转染PGBE1细胞；用G418筛选获得阳性细胞克隆，命名为pcDNA3．1（-）／nm23-H1-PGBE1细胞株；用RT-PCR法半定量检测nm23-H1基因的mRNA表达水平和免疫组化法检测nm23-H1基因的蛋白质表达。结果：真核表达载体pcDNA3．1（-）中正确插入了具有完整阅读框的nm23-H1基因；倒置显微镜下观察到经G418筛选出的稳定转染的PGBE1细胞，形成“小岛”；RT-PCR和免疫组化显示转染的细胞中nm23-H1 mRNA和蛋白质水平表达均增高。结论：建立了稳定表达nm23-H1基因的PGBE1转染细胞株，可用于进一步研究肿瘤转移的分子机制。     

周期型马来丝虫复合表位基因的构建及在真核细胞中的表达

目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂/3-磷酸甘油醛脱氢酶复合表位基因(CPI502/GAPDH720)真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720, 并观察其在人宫颈癌细胞(Hela细胞)中的蛋白表达。方法根据T细胞表位预测的基因序列设计引物, 以质粒pGEM-T-CPI621为模版, 利用反转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段, 将该片段克隆至原核表达质粒pET-28a(+)中, 构建原核表达质粒pET28a(+)-BmCPI502。根据软件设计合适引物, RT-PCR分别扩增BmCPI502基因和BmGAPDH720基因, pcDNA3.1(+)、BmCPI502、BmGAPDH720分别进行双酶切后进行连接, 构建复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720。将复合表位基因重组质粒转染至Hela细胞后, 进行RT-PCR验证, 获得与预期相符目的条带;将表达产物利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。结果获得了原核表达重组质粒pET28a(+)-BmCPI502, 经...     

人谷胱甘肽硫转移酶A1基因在CHO细胞中的表达

目的构建人谷胱甘肽硫转移酶A1(GSTA1)的CHO细胞表达体系。方法重组质粒pDNA3.1-GSTA1用lipofectamineTM2000转染CHO细胞,用G418筛选细胞的阳性克隆,并用PCR、RT-PCR和Western blot进行鉴定,测定GSTA1酶活性。结果将pDNA3.1-GSTA1转染CHO细胞,用G418筛选,用PCR、RT-PCR和Western blot进行鉴定,表明GSTA1基因已转染到CHO细胞的基因组,并转录表达,生成GSTA1蛋白质,经测定活性达到35mmol/(mg.min蛋白)。结论CHO-GSTA1细胞表达,为基因工程生产具有完整功能GSTA1的进一步纯化提供了材料。     

稳定表达GRIM-19的Hela细胞株的建立及其对STAT3的抑制作用

目的:建立Grim-19基因稳定表达的人子宫颈癌Hela细胞株,探讨Grim-19及其对下游基因STAT3表达的影响。方法:将构建好的质粒采用脂质体法转染人子宫颈癌Hela细胞株,经G418筛选,得到稳定表达Grim-19的Hela细胞株,并分别通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western-blot)检测Grim-19及其下游基因STAT3的表达。结果:成功建立了高表达GRIM-19的Hela/Grim-19细胞株,并在mRNA与蛋白水平上均发现Grim-19在转染细胞中的高表达和其下游基因STAT3表达的明显下调。结论:上调子宫颈癌Hela细胞Grim-19的表达对STAT3的表达有抑制作用。     

全长型人Smac基因真核表达载体构建及表达

目的 构建全长型(full length,FL)人Smac基因(hSmac)真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中表达.方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人宫颈癌细胞株Hela中扩增到Smac CDs基因片段,构建重组真核表达载体peDNA3.1 -FL hSmae.PCR、酶切鉴定重组质粒正确后,通过脂质体介导将其和作为阴性对照的空载体pcDNA3.1 分别转染人肝癌细胞株(SMMC-7721).同时转染含EGFP的质粒pcDNA3.1 -EGFP.利用荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率.采用RT-PCR、western blot法检测外源基因Smac的表达.结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人Smac基因克隆成功.且鉴定证实真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac构建成功.流式细胞术检测到转染效率高达48%,荧光显微镜下也可见非常明亮的绿色荧光.无论是在mRNA水平还是蛋白水平上,转染后的细胞中外源基因Smac表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中明显表达,为研究Smac基因在细胞凋亡过程中的调控作用.以及探讨以Smac基因为基础的肿瘤基因治疗策略提代基础依据.     

IL-15cDNA转染人喉癌细胞系的建立及其表达的研究

目的建立转人白细胞介素-15(hIL-15)基因的喉癌细胞株,并研究hIL-15的表达情况。方法将携带人白细胞介素-15的质粒pcDNA3.1( )-hIL-15转导入人喉表皮样癌细胞Hep-2中,G418筛选阳性克隆,RT-PCR、Westernblot和ELISA法对hIL-15的表达进行检测。结果IL-15基因成功地转导入Hep-2细胞中并能高效表达。RT-PCR电泳结果显示hIL-15基因在mRNA水平有表达;ELISA法测得106个转染阳性细胞24h内培养上清液中hIL-15的含量为(185.0±12.2)pg/ml,空载体转染及未转染的细胞未检测到hIL-15。结论hIL-15基因成功转染人喉癌细胞系Hep-2细胞且能持续大量表达。     

导入MDR1建立肝癌耐药细胞系及其动物实验研究

目的 探讨利用转染多药耐药基因(MDR1)方法建立表肝癌耐药细胞系,为深入研究肝癌多药耐药现象提供理想的细胞模型.方法 将前期构建表达mdr1cDNA转染质粒PCI/mdr1转染人肝癌细胞株HepG2细胞,采用G418和阿霉素短暂诱导,筛选出稳定的耐药细胞株HepG2/mdr1;利用RT-PCR、FCM及体内外的耐药性...     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

垂体肿瘤转化基因1对结肠癌SW480细胞增殖的影响及其机制研究

目的 研究垂体肿瘤转化基因 1(Pituitary Tumor Tansforming Gene1,PTTG1)过表达对人结肠癌细胞SW480增殖和周期的影响及其可能机制。方法 采用脂质体转染法将pcDNA3.1(+)-PTTG1及空载pcDNA3.1(+)质粒转染人结肠癌SW480细胞,G418法筛选阳性克隆。Western blot法检测PTTG1和cyclin D、cyclin E、p21的表达。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期。结果 （1）成功获得PTTG1高表达的SW480细胞pcDNA3.1(+)-PTTG1及对照pcDNA3.1(+)细胞,Western blot结果显示pcDNA3.1(+)-PTTG1细胞PTTG1表达量分别为pcDNA3.1(+)细胞和SW480细胞的3.58倍和3.42倍;（2）过表达PTTG1基因后,SW480细胞周期改变,G0/G1期细胞减少而S期和G2/M期细胞增加;细胞周期调控蛋白cyclin D和cyclin E表达升高,p21表达降低;SW480细胞增殖显著性加快。（3） 过表达PTTG1基因后,SW480细胞中PI3K/AKT信号活化增强,使用PI3K/AKT信号抑制剂LY29400干预后,细胞增殖减弱,周期蛋白cyclin D和cyclin E表达降低,p21表达升高。结论 PTTG1基因过表达可能通过活化PI3K/AKT信号加速SW480细胞从G1期向S期的转化促进细胞增殖,提示PTTG1蛋白可能成为结肠癌治疗的一个潜在靶点。     

多发性骨髓瘤恶性相关基因MYEOV2对NIH/3T3细胞生长的影响

目的　分析多发性骨髓瘤恶性相关基因MYEOV2对NIH/ 3T3细胞生长的影响。方法　将MYEOV2基因克隆到真核表达载体pcDNA3 1( +)上 ,并将阳性重组子通过脂质体转染入NIH/ 3T3细胞中 ,G418筛选获得转染阳性克隆并用RT -PCR检测MYEOV2基因的表达。运用流式细胞分类法、细胞生长曲线分析MYEOV2基因对NIH/ 3T3细胞生长的影响。结果　成功获得转染pcDNA3 1( +) /MYEOV2的细胞阳性克隆。流式细胞分析显示转染pcDNA3 1( +) /MYEOV2、转染空载体及未转染的NIH/ 3T3细胞的S期细胞分别为 3 0 9%、2 0 1%、16 1% ,前者较后两者S期细胞增多 ,有显著性差异 (P <0 0 5 )。细胞生长曲线显示转染pcDNA3 1( +) /MYEOV2、转染空载体、未转染的NIH/ 3T3细胞的倍增时间分别为 13 6h、2 5 3h、2 7 4h ,前者细胞倍增时间较后两者缩短 ,有显著性差异 (P <0 0 5 )。结论　MYEOV2基因的表达增加促进DNA合成增加 ,细胞增殖加快 ,是多发性骨髓瘤瘤细胞恶性增殖的一个重要因素     

VEGF165在哺乳动物细胞中的稳定表达

目的探讨pcDNA3．1-VEGF165质粒对哺乳动物细胞的表达和转染。方法将pcDNA3．1-VEGF165质粒用电转的方法导入CHO细胞中，C418筛选细胞克隆。通过RT—PCR、ELISA、Westen—blot在转录水平和蛋白质水平上检测VEGF165在转基因CHO细胞中的表达。通过内皮细胞增殖实验和血管通透性实验检测所表达的VEGF165的生物学活性。结果获得有C418抗性的CHO细胞克隆。RT—PCR扩增出一条大小约600bp的特异性泳带，测序结果与VEGF165mRNA一致。ELISA显示细胞培养上清的VEGF浓度约为10-20ng／ml。WESTEN—BLOT检测到大小为23KD的特异性蛋白质条带。内皮细胞增殖实验显示细胞培养上清具有促内皮细胞增殖作用。血管通透性实验显示细胞培养上清明显增加毛细血管通透性。结论pcDNA3．1-VEGF165质粒真核表达系统能在哺乳动物细胞中表达具有良好生物学活性的VEGF165蛋白。     

Adr亚型乙型肝炎病毒转染细胞模型的构建

目的建立乙型肝炎病毒（HBV）复制状态的细胞模型。方法利用分子亚克隆技术。将9600bp的adr亚型HBV全基因克隆至pcDNA3的EcoRI和HindⅢ位点构建pcDNA3—3HBV，通过脂质体介导的方法转染HepG2细胞，G418筛选。结果成功构建了质粒pcDNA3—3HBV，稳定转染后培养上清，ELISA检测结果显示，HBSAg、HBeAg阳性，且PCR检测前S／S基因阳性。PCR证实转染细胞中有HBVcccDNA存在，RT—PCR证实HBVS基因mRNA的表达。结论重组质粒pcDNA3．3HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制。     

过表达GCNF对HeLa细胞生物学行为的影响

目的:将成功构建的人pcDNA3.1-GCNF真核表达载体瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,观察GCNF基因对HeLa细胞生物学功能的影响。方法:将重组质粒pcDNA3.1-GCNF转染HeLa细胞,通过MTT比色法、基质胶黏附实验和Transwell侵袭试验对转染后HeLa细胞增殖、黏附和侵袭力进行分析。结果:成功获得瞬时转染的pcDNA3.1-GCNF HeLa细胞,转染目的基因组(0.239±0.014)与转染空质粒组(0.198±0.020)及未转染组(0.204±0.012)相比,细胞增殖最快(P<0.05)。转染目的基因后细胞粘附、侵袭力未见明显改变。结论:GCNF基因促进了体外培养的宫颈癌HeLa细胞增殖,但对HeLa细胞粘附、侵袭力没有明显的影响。     

探讨电穿孔法介导转染32DP210细胞的参数

目的:采用电穿孔法将质粒pGenesil-1(简称pG)转染32DP210细胞,从中寻找最佳的参数。方法:分别采用LipofectamineTM2000、transfast、脂质体DMRIC-E和电穿孔法,将能表达G418抗性蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pG转染32DP210细胞;荧光显微镜下观察GFP表达并测定瞬时转染率;通过G418筛选得到稳定转染的细胞。结果:本实验室电穿孔法介导的32DP210细胞转染其最佳电转条件为电压270 V,电容950μF,DNA剂量14μg。48 h后电穿孔法的转染效率达50.81%,其它三种方法转染效率都小于3%。结论:用电穿孔法将质粒pG转染32DP210细胞是最佳的转染方法。     

真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的构建pcDNA3．1－RASSFl真核表达载体,并检测其对肝癌细胞系HepG2凋亡的影响。方法应用聚合酶链反应技术从人RASSFlcDNA中扩增出RASSF1基因后,以内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切,将其克隆人用相同酶处理的载体pcDNA3．1;将重组质粒pcDNA3．1－RASSF1转染肝癌HepG2细胞,应用Westernblot法检测RASSF1的表达水平;用AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡情况。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3．1．RASSF1构建成功;Westernblot法结果表明转染pcDNA3．1-RASSF1后HepG2细胞中RASSFl表达升高;AnnexinV／PI法用流式细胞术检测凋亡,空白组、pcDNA3．1组和pcDNA3．1-RASSFl组HepG2细胞的凋亡率分别为（5．8±0．42）％、（7．48±0．68）％和（35．1±3．15）％。结论真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1构建成功;RASSF1蛋白在HepG2细胞中高表达,并促进细胞凋亡。