枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响

目的：研究枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞（DC）表型及功能成熟的影响。方法：小鼠骨髓细胞用GM-CSF和IL-4培养5d，然后用免疫磁珠法纯化DC细胞，实验组加入枸杞多糖（100μg／ml），空白对照组加等量RPMI1640，阳性对照组加LPS（100ng／ml），3组分别同时作用48h。流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力，ELISA检测产生的细胞因子IL-12，混合淋巴细胞反应检测细胞提呈抗原的能力。结果：用枸杞多糖刺激的小鼠骨髓DC表达I-A／I-E、CD11c和分泌IL-12能力比空白对照组增加，吞噬FITC-dextran的能力下降，并可促进同种异基因T细胞的增殖。结论：枸杞多糖可以促进体外培养的小鼠骨髓DC的成熟，促进DC诱导的免疫应答启动。     

落新妇苷对小鼠骨髓来源树突状细胞成熟及免疫功能的抑制作用

目的：探讨落新妇苷对小鼠骨髓来源树突状细胞（dendritic cell, DC）成熟和免疫功能的影响。 方法：采用体外条件培养法得到小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞,加入脂多糖刺激细胞成熟。落新妇苷（低浓度25 μg/mL、中浓度50 μg/mL、高浓度100 μg/mL）处理细胞后,流式细胞仪分析各组细胞凋亡,细胞表面主要组织相容性抗原复合物分子Ⅰa和共刺激分子CD40、CD80和CD86表达;异硫氰酸荧光素标记葡聚糖内吞实验分析各组DC抗原吞噬功能;酶联免疫吸附测定法检测各组DC培养液上清白细胞介素12亚单位p40（p40 subunit of interleukin-12,IL-12p40）水平;氚-胸腺嘧啶核苷掺入法检测体外混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction, MLR）中各组DC刺激同种反应性T细胞的增殖能力,酶联免疫吸附测定法检测MLR上清IL-2、IL-4、IL-10、γ干扰素水平。 结果：各组DC凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。与脂多糖组相比,高、中、低浓度落新妇苷组细胞表面主要组织相容性抗原复合物分子Ⅰa和共刺激分子表达明显降低,抗原吞噬能力明显升高,分泌IL-12p40明显减少,刺激同种反应性T细胞增殖的能力显著下降（P〈0.05）。与脂多糖组相比,高、中、低浓度落新妇苷组MLR上清中IL-2和γ干扰素水平明显降低（P〈0.05）,而IL-4、IL-10水平比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论：落新妇苷（25、50、100 μg/mL）能够剂量依赖性地抑制体外培养小鼠骨髓来源DC的成熟,并对其免疫功能具有一定的负性调节作用。     

香菇多糖对小鼠骨髓树突状细胞表型和功能的影响

【目的】 纯化的香菇多糖(lentinan, LNT)为香菇子实体提取物中的有效成分,是兼有抑制肿瘤和提高免疫功能的多糖类生物反应调节剂,在临床上有广泛应用。树突状细胞(dendritic cells, DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞,它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原,激活T细胞应答并在抑制肿瘤的发生、发展和转移中起到重要作用,同时DC疫苗也在防止多种传染病和肿瘤治疗等方面展现广阔前景。我们在科研见习期间通过研究发现LNT对DC有显著调节作用。但是具体的机理不清,而且国内外未见报道。因此,我们立项对LNT影响小鼠骨髓树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells, BMDCs) 表型及功能的变化进行了如下系统研究。 【方法】 取6~8周龄C57BL/6小鼠,颈椎脱臼处死,于75%酒精中浸泡10~15 min,无菌手术取出四肢放入75%酒精中,剔去肌肉,剪掉骨头两端,用1 mL无菌注射器吸取RPMI1640反复冲洗骨髓腔,收集细胞悬液,1 500 r/min,离心6 min,倒掉上清,加入1~2 mL红细胞裂解液1~2 min,用PBS洗3遍后重悬于含双抗和10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液中,接种于6孔板,24 h后弃去未贴壁细胞,再加入含GM-CSF、IL-4、双抗和10%FCS的RPMI1640,隔天半量换液,培养至对数期,加药刺激。LNT溶解于RPMI1640中,配制其浓度为50 μg/mL,然后加入培养至对数生长期的BMDCs细胞培养液中, 用RPMI1640培养作为空白对照组,10 ng/mL的LPS(Sigma)刺激培养作为阳性对照。分别应用酸性磷酸酶活性检测、流式细胞仪术、吞噬实验及酶联免疫吸附试验,检测酸性磷酸酶活性、细胞表型及细胞因子IL-12、IL-10及TNF-α含量。 【结果】 与RPMI1640对照组相比,LNT处理组(50 μg/mL)BMDCs酸性磷酸酶活性明显下降(P<0.01);表面关键膜分子CD80、CD86,CD40、CD83,MHC Ⅱ、和CD205的表达水平明显增高(P<0.01);吞噬FITC-dextran量(反映摄取抗原能力)减少(P<0.05);细胞上清液中IL-12、IL-10及TNF-α含量明显增高(P<0.01)。 【结论】 本研究表明适宜浓度的LNT能够显著促进BMDCs表型和功能成熟。     

人骨髓间质干细胞对树突状细胞成熟和功能影响的实验研究

目的探讨人骨髓间质干细胞对树突状细胞成熟和功能的影响以及人骨髓间质干细胞发挥免疫抑制作用的可能机制。方法以Friedenstein法分离培养骨髓间质干细胞,以密度梯度离心法分离培养外周血单个核细胞,在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和重组人白介素-4的培养条件下制备树突状细胞。在LPS(1ng/mL)诱导下获得成熟树突状细胞。将骨髓间质干细胞与成熟树突状细胞共培养48h后,混合淋巴细胞反应检测经骨髓间质干细胞处理前后树突状细胞对同种异体T细胞的增殖能力,流式细胞仪检测处理前后其表面共刺激分子CD86和成熟标记物抗原CD83的表达,ELISA法测定混合淋巴细胞反应上清中细胞因子的表达。结果与未成熟DCs组比较,成熟DCs组表面抗原CD86,CD83的表达均增加,对T淋巴细胞刺激能力增强,致炎细胞因子分泌(IL-12,IFN-γ)增多,而抑炎因子(IL-10)分泌减少,成熟DCs组经hMSCs处理后,表面抗原表达水平明显下降,致炎细胞因子分泌减少,而抑炎因子分泌增加,对T淋巴细胞刺激能力减弱,与未处理成熟组比较差异具有显著性,而与未成熟组比较差异无显著性。结论hMSCs能逆转成熟DCs为未成熟DCs状态,从能间接抑制DCs启动的T淋巴细胞增殖,抑制炎症因子的分泌,发挥免疫抑制作用。     

青藤碱对小鼠骨髓树突状细胞免疫功能的影响

目的研究青藤碱对小鼠骨髓树突状细胞(dendritic cell DC)免疫功能的影响.方法小鼠骨髓细胞用GM-CSF培养7 d,再加入不同浓度青藤碱培养12 h.流式细胞仪检测细胞表达HLA-DR的能力,ELISA检测细胞产生的细胞因子,混合淋巴细胞培养检测细胞提呈抗原的能力.结果青藤碱刺激后的DC细胞表达HLA-DR、产生细胞因子和刺激同种同基因T细胞增殖的能力显著低于正常DC细胞.结论青藤碱可抑制DC的发育成熟和免疫应答功能.     

HBcAg和HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞功能的影响

目的 探讨HBcAg和HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞功能的影响.方法 分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,用rmGM-CSF和rmIL-4体外诱导为树突状细胞(DCs)后,按照干预条件分为对照组、HBcAg组和HBeAg组.混合淋巴细胞反应(MLR)检测DCs刺激T淋巴细胞增殖能力,酶联免疫法(ELISA)检测培养上清中IL-12、IL-10和IDO的分泌水平, Western blot法检测Akt 磷酸化水平,设置LY294002组为阳性对照探讨细胞因子分泌的可能调节机制.结果 HBcAg组上清液中IL-12水平以及DCs刺激淋巴细胞增殖能力较对照组明显升高(P<0.01).HBeAg组上清液中IL-12水平以及DCs刺激淋巴细胞增殖能力较对照组明显降低(P<0.05),而IL-10和IDO的水平较对照组明显升高(P<0.01).HBeAg组Akt的磷酸化水平较对照组明显升高(P<0.05).LY294002组Akt的磷酸化水平较HBeAg组明显降低(P<0.05),并且上清液中IL-12水平较HBeAg组明显升高(P<0.01),IL-10和IDO的水平较HBeAg组明显降低(P<0.01).结论 相对于HBcAg的正性作用,HBeAg通过PI₃K-Akt信号通路调节DCs细胞因子分泌,减弱DCs的免疫功能,这可能是乙型肝炎慢性化的机制之一.     

小鼠骨髓干细胞体外诱导成熟的树突状细胞对T细胞增殖的影响

目的：研究小鼠骨髓干细胞体外诱导分化的树突状细胞对T细胞增殖的影响,为进一步研究树突状细胞的功能及临床肿瘤的治疗提供有效的实验方法。 方法：应用IL-4和GM-CSF培养小鼠骨髓细胞5~7 d,光镜下观察细胞形态学变化;培养至第5~6天,加入黑色素瘤（B16）冻融抗原继续培养1~2 d,流式细胞仪检测细胞表面分子CD83、CD86,并与同种异体T细胞混合培养72 h,终止培养前16 h加入³H-TdR（18.5 kBq/孔）,γ-液体闪烁仪测定cpm值。 结果：用IL-4和GM-CSF培养3 d可见细胞形态发生改变,细胞形状不规则,培养5~6 d时,有刺状突起、拉长,为典型树突状细胞形态学特征;抗原装载后流式细胞仪检测CD83、CD86表达,IL-4+GM-CSF+TNF-α组（61.68%、71.25%）及IL-4+GM-CSF+冻融抗原组（63.11%、76.88%）明显高于对照组（2.41%、3.88%）及单纯IL-4+GM-CSF培养组（21.86%、28.69%）（P<0.001）,IL-4+GM-CSF+TNF-α组与IL-4+GM-CSF+冻融抗原组比较,CD83和CD86表达差异无显著性;液闪仪检测结果显示,IL-4+GM-CSF+冻融抗原组刺激T细胞增殖的能力明显强于其他组,且差异具有显著性（P<0.001, P<0.05）。 结论：小鼠骨髓细胞体外培养成功地诱导扩增出足量树突状细胞,经肿瘤抗原刺激后绝大部分成熟,并能够刺激同种异体T细胞大量增殖,参与免疫应答。     

小鼠骨髓源半成熟树突状细胞的培养与初步鉴定

目的探索培养与鉴定小鼠骨髓来源半成熟树突状细胞(smDC)的可行方法。方法分离、纯化6周龄C57BL/6小鼠骨髓单核细胞,以含10%胎牛血清、2 ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/ml重组小鼠白细胞介素(IL)-4的RPMI-1640培养基培养9 d;再以肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(40 ng/ml)刺激24 h获得smDC,同时以脂多糖(1μg/ml)刺激和不加刺激培养24 h获得成熟DC(mDC)和未成熟DC(iDC)。扫描电子显微镜、流式细胞术、ELISA检测iDC、smDC和mDC的形态、细胞表面标志及细胞因子的表达。建立体外淋巴细胞反应模型,采用细胞计数试剂盒检测smDC对异基因淋巴细胞的活化作用。结果smDC的体积介于iDC和mDC之间、多呈类圆形或圆形,胞体直径约为15μm,树突长度多在5~10μm。smDC、iDC与mDC均高表达CD11c,smDC表达CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ介于iDC和mDC之间。smDC分泌IL-1β、IL-6和IL-12显著低于mDC(P<0.01)、分泌IL-12显著低于iDC(P<0.05),分泌IL-1β、IL-6与iDC比较差异无显著性(P>0.05);smDC、iDC与mDC分泌IL-10差异无显著性(P>0.05)。smDC对异基因淋巴细胞激活作用显著低于mDC和阳性对照(P<0.01),而与阴性对照和iDC差异无显著性(P>0.05)。结论smDC可能是一个功能和形态上相对独立的DC亚群,体外利用GM-CSF、IL-4和TNF-α诱导骨髓单核细胞是获得smDC的有效方法。     

丹参多酚酸盐负性调节小鼠骨髓来源树突状细胞成熟及其部分免疫功能

目的:观察丹参多酚酸盐对小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)成熟及其部分免疫学功能的影响。方法:小鼠BMDC体外培养时加入促成熟剂脂多糖(DCLPS)或同时加入脂多糖及丹参多酚酸盐(DCSV),其中丹参多酚酸盐设3个浓度:低浓度50μg/ml(SVL)、中浓度100μg/ml(SVM)、高浓度200μg/ml(SVH)。流式细胞仪分析各组细胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达;FITC-Dextran内吞实验分析各组DC抗原吞噬功能;酶联免疫吸附实验(enzyme linked i mmunosorbent assay,ELISA)检测各组DC培养液上清白细胞介素(interleukin,IL)-12 p40水平。[3H]-TdR掺入法检测各组DC体外混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reactions,MLR)刺激同种反应性T细胞的增殖能力;ELISA法测定MLR上清IL-10、IL-2、干扰素(interferon,IFN)-γ水平。结果:与DCLPS相比,SVL、SVM、SVH细胞表面M...     

小鼠肝癌细胞外泌体对树突状细胞成熟与功能的影响

目的 探讨小鼠肝癌细胞(Hepa1-6)来源的外泌体对树突状细胞成熟和功能的影响.方法 提取小鼠Hepa1-6细胞的外泌体,用透射电镜来鉴定外泌体的外形,Western blot方法测定外泌体的标志蛋白CD63和TSG101的表达,使用小鼠Hepa 1-6细胞外泌体冲击树突状细胞(DCs),DCs成熟相关表面分子CD4...     

miRNA调控树突状细胞成熟机制研究进展

微小核糖核酸(miRNA)是一类内源性非编码小RNA分子,主要通过抑制其靶基因而起到调控作用,在人体发育、细胞增殖、凋亡、激素分泌及肿瘤发生等多种生理和病理过程中发挥着重要作用。树突状细胞(DC)是目前已知功能最强的抗原呈递细胞,并且不同成熟状态的DC对T细胞免疫有双向调节的作用。DC的成熟过程也受到miRNA的调控。现就近年来关于miRNA参与调节DC成熟相关信号机制的研究进展予以综述。     

荷瘤小鼠骨髓来源树突状细胞诱导的抗肿瘤作用

目的:探讨能否从荷瘤小鼠骨髓细胞诱导出功能正常、具有抗肿瘤作用的树突状细胞(DC),与正常小鼠骨髓来源的DC比较有无差异。方法:于体外用mGM-CSF和mIL-4分别从正常小鼠和CT26结肠腺瘤小鼠的骨髓细胞诱导DC,并用CT26肿瘤细胞抗原冲击致敏。用相差显微镜观察DC的形态学变化;流式细胞术检测CT26肿瘤细胞抗原致敏前后DC表面分子变化;3H-TdR掺入法检测肿瘤抗原致敏DC刺激T细胞增殖的能力;乳酸脱氢酶(LDH)4 h释放法检测肿瘤抗原致敏DC诱导同基因T细胞增殖、分化为细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤活性。结果:荷瘤小鼠骨髓来源DC与正常小鼠骨髓来源DC的Ia-Kd、H-2Kd、CD80、CD86I、CAM-1表达水平和它们刺激T细胞增殖的能力以及所诱导产生的CTL杀伤活性均无显著性差异。结论:荷瘤小鼠骨髓来源的DC与正常小鼠骨髓来源的DC具有相似的功能和抗肿瘤作用,提示可以从荷瘤机体的DC前体诱导出具有抗肿瘤作用的DC用于肿瘤的免疫治疗。     

猪苓多糖经TLR4刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟

目的：研究猪苓多糖（polyporus polysaccharides,PPS）诱导小鼠骨髓树突状细胞（dendriticcell,DC）表型及功能成熟的分子机制。方法：从小鼠骨髓中分离单个核细胞（MNC）,用rmGM-CSF、IL-4培养5 d后将其分为三组：实验组中加入50μg/mL PPS;阳性对照组中加1μg/mL LPS;加等量RPMI 1640培养基作为阴性对照组,继续培养48 h。苏木精-伊红（HE）染色观察细胞形态;流式细胞仪（FACS）分析DC表面CD80、CD86及MHC II（I-A/I-E）表达情况;经20μg/mL Toll-like receptor（TLR）4、TLR2单抗作用1 h后,ELISA法检测培养上清中IL-12 p40含量;混合淋巴细胞反应（MLR）检测DC对T淋巴细胞的刺激能力。结果：PPS处理的DC具有毛刺状突起,呈典型的DC形态;细胞表达MHC II、CD80及CD86增加;对T淋巴细胞刺激能力增强;分泌IL-12增加且可被抗TLR4单抗所阻断。结论：PPS通过TLR4促进体外培养的小鼠骨髓DC表型与功能成熟。     

MyD88 RNA干扰抑制小鼠骨髓树突状细胞成熟的实验研究

针对小鼠骨髓树突状细胞（DC）髓性分化因子88（MyD88），采用RNA干扰技术抑制其合成，观察脂多糖（LPS）刺激后DC生物学活性的变化，探讨获得耐受性DC的方法，为DC的临床应用提供新思路和理论依据。培养小鼠骨髓源性DC，分为对照组、LPS组及RNA干扰组，对照组不予任何处理，LPS组加入终浓度为1μg／ml的LPS，RNA干扰组于加入MyD88 siRNA 12h后给予1μg／ml LPS刺激，继续培养3d。     

HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞表型及功能的影响

目的 研究HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)表型及功能的影响。 方法 以rmGM-CSF和rmIL-4定向体外诱导C57BL/6小鼠骨髓细胞分化成未成熟DC,随机分为空白对照组、HBeAg刺激组、脂多糖(LPS)刺激组和HBeAg+LPS刺激组。以流式细胞术检测DC表型变化,混合淋巴反应(MLR)检测DC促T淋巴细胞增殖能力,酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液中IL-12的分泌水平,CCK-8法检测HBeAg对骨髓源性树突状细胞活力影响。 结果 HBeAg刺激后,CD11c阳性细胞百分数下降。 HBeAg可抑制DC表面MHC-Ⅱ、CD86的表达和DC促淋巴细胞增殖的能力,且HBeAg可抑制LPS诱导的树突状细胞IL-12的分泌,细胞活力检测显示HBeAg对细胞没有明显毒性作用。 结论 HBeAg对树突状细胞的成熟有一定的负性调节作用,这可能是HBV的持续感染的机制之一。     

Smad3小干扰RNA在转化生长因子β1作用下对树突状细胞成熟及功能的影响

目的 研究通过RNA干扰技术阻断外周单核细胞来源的树突细胞(DC)内的Smad3,并在转化生长因子β1(TGF-β1)作用下对DC的成熟和免疫抑制作用的影响.方法 设计针对Smad3特异性小干扰RNA(siRNA),利用RNAiMAX转入DC,并用RT-PCR检测转染效果.实验分Control-DC组、TGF-β1-Control-DC组、TGF-β1-Negative siRNA-Smad3 DC组和TGF-β1-siRNA-Smad3 DC组.流式检测各组DC成熟表型的变化,ELISA检测各组DC上清白细胞介素12(IL-12)的水平,CCK-8法检测DC刺激同种异体T细胞增殖的能力.结果 TGF-β1-siRNA-Smad3 DC组表面成熟标志CD80、CD83、CD86、HLA-DR及IL-12分泌水平明显高于TGF-β1-Control-DC组和TGF-β1-Negative siRNA-Smad3 DC组(P＜0.05),且TGF-βNegative siRNA-Smad3 DC组刺激同种异体T细胞增殖的能力显著增强.结论 通过阻断DC的Smad3表达,可以逆转TGF-β1对DC成熟和免疫功能的抑制.     

人骨髓间充质干细胞抑制单核细胞来源的树突状细胞的成熟和功能

目的研究人骨髓间充质干细胞(MSC)的免疫调节作用以探讨防治异基因造血干细胞移植中移植物抗宿主病(GVHD)的可能途径。方法将培养第5天的人单核细胞来源的树突状细胞(DC)以每孔1×106密度种于24孔培养板,与等体积3~6代MSC上清混合培养48h,加脂多糖(100ng/m l)、肿瘤坏死因子α(TNF-α,10ng/m l)促DC成熟,观察试验组与对照组树突状细胞免疫表型的变化及其分泌细胞因子白细胞介素(IL)-10、IL-12的变化,并通过混合淋巴细胞反应检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力的变化。结果流式免疫分型显示与对照组相比,树突状细胞成熟表面标志CD83、协同刺激分子CD80表达降低,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IL-12浓度混合培养组减少41.7%(P<0.05),IL-10浓度无变化,刺激淋巴细胞增殖能力混合培养组降低(P<0.01)。结论骨髓间充质干细胞上清可抑制单核细胞来源的树突状细胞的成熟和功能,诱导免疫耐受。     

刺梨汁对骨髓抑制小鼠造血功能的调控作用

目的 探讨刺梨汁对环磷酰胺合并⁶⁰Co致骨髓抑制小鼠造血功能的影响,研究其促进血细胞上调的作用机制。方法 双抗体夹心法检测外周血象、骨髓基质中红细胞生成素（EPO）、血小板生成素（TPO）、粒细胞生长因子（GCSF）的量。结果 刺梨汁能明显改善骨髓抑制小鼠外周血象;能有效平衡微环境中TPO的量;改善EPO的表达;对骨髓抑制小鼠骨髓细胞上清中GCSF有明显的正调控作用。结论 刺梨汁能提高骨髓抑制小鼠外周血血细胞和骨髓有核细胞计数;可促进骨髓抑制小鼠骨髓细胞从G₀/G₁期进入增殖周期;并能有效调节骨髓微环境中TPO、EPO、GCSF的表达,从而促进骨髓抑制小鼠的造血功能,可作为一种治疗贫血的辅助保健药物。     

刺梨汁对骨髓抑制小鼠造血功能的调控作用

目的 探讨刺梨汁对环磷酰胺合并⁶⁰Co致骨髓抑制小鼠造血功能的影响,研究其促进血细胞上调的作用机制。方法 双抗体夹心法检测外周血象、骨髓基质中红细胞生成素（EPO）、血小板生成素（TPO）、粒细胞生长因子（GCSF）的量。结果 刺梨汁能明显改善骨髓抑制小鼠外周血象;能有效平衡微环境中TPO的量;改善EPO的表达;对骨髓抑制小鼠骨髓细胞上清中GCSF有明显的正调控作用。结论 刺梨汁能提高骨髓抑制小鼠外周血血细胞和骨髓有核细胞计数;可促进骨髓抑制小鼠骨髓细胞从G₀/G₁期进入增殖周期;并能有效调节骨髓微环境中TPO、EPO、GCSF的表达,从而促进骨髓抑制小鼠的造血功能,可作为一种治疗贫血的辅助保健药物。