汉坦病毒通用型实时荧光定量RT-PCR方法的 建立及应用

摘要:目的　建立一种适应汉坦病毒不同基因型别的通用实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法　利用Beacon Designer7.5软件设计引物和探针,以人工合成汉坦病毒5种具有代表性基因型别的L片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR方法的建立,确定所建立方法的检测限及灵敏度并对采集的112份鼠肺进行快速检测。结果　5种模板RNA的Ct值与其稀释浓度的对数存在良好的线性关系,以HTNV为例建立的标准曲线为:y＝-3.40x+46.8,R2＝0.99,其最低检出限为5.32 copies/μl,对于不同基因型别的汉坦病毒,其检测最低限:HTNV为12.40 copies/μl、SEOV为5.32 copies/μl、PUUV为15.02 copies/μl、DOBV为22.14 copies/μl及SNV为24.26 copies/μl。对112份鼠肺样本的病毒检出率为17.86%,较巢式RT-PCR的检出率（8.04%）高。结论　建立的通用型实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高,检测的广谱性好,适合啮齿类动物中携带的汉坦病毒的快速检测。     

柯萨奇病毒B3的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立一种检测柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3)的实时荧光定量RT-PCR方法,为临床CVB3的快速、准确检测提供一种新的方法。方法:针对CVB3基因的VP4区和管家基因β-actin的核苷酸序列分别设计了特异性的引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18-T-CVB3为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并构建CVB3的荧光定量RT-PCR标准曲线。结果:建立的方法在1.0×101～1.0×108copies/μl模板范围内具有良好的线性关系(r2>0.999),扩增效率高于98.0%,至少可检测10 copies/μl的阳性标准品。用CVB3感染HeLa细胞来模拟实际样品,灵敏度可达到1.0×101copies。结论:建立的荧光定量RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为CVB3的快速诊断方法,为CVB3感染的临床治疗提供快速可靠的诊断依据。     

非洲型寨卡病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立

目的 建立非洲型寨卡病毒（ZIKV）实时荧光定量PCR检测技术。方法 人工合成非洲型ZIKV E基因上引物为5’ - TCAAAGATGATGTTGGAGCT - 3’、下游引物5’ - CCTCTCACAGTGGCYTCA - 3’、探针5’FAM - CCACCATTTGGGGATTCTTACATTGTC - BQ1 - 3’,采用实时荧光定量PCR检测其特异性、灵敏度及重复性。结果 非洲型ZIKV质粒标准品浓度为76.61 ng/μl;以非洲型ZIKV质粒标准品制作标准曲线,在2.47×（108～102） copies/μl之间有较好线性关系,Rsq为1;能特异检测出非洲型ZIKV质粒标准品,与登革病毒1～4、亚洲型ZIKV质粒标准品、HCV - 1b病人血清RNA无交叉反应,检测限为2.47×101copies/μl。结论 本研究建立了可用于非洲型ZIKV实验室检测的实时荧光定量PCR技术。     

拉克罗斯病毒和雪靴野兔病毒双重RT-PCR方法的建立

目的建立针对拉克罗斯病毒(LAC)和雪靴野兔病毒(SSH)的双重RT-PCR检测方法。方法分别针对LAC和SSH病毒的S基因设计2对特异性引物,建立同时检测LAC和SSH的双重RT-PCR方法。以黄病毒属的黄热病毒(YFV)、库京病毒(KUNV)、登革病毒(DENV)、乙型脑炎病毒(JEV),布尼亚病毒属的塔希纳病毒(TAHV)和甲病毒属的巴马哈森林病毒(BFV)、玛雅罗病毒(MAYV)、盖塔病毒(GETV)为模板验证方法的特异性,以不同拷贝数的病毒RNA检测该方法的敏感性。结果建立的双重RT-PCR方法能同时扩增到LAC和SSH的目的片段;敏感度分别达到LAC1.41×105copies/μl,SSH 5.6×104copies/μl;与YFV、KUNV、BFV、MAYV无交叉反应。结论建立了双重RT-PCR方法,可用于LAC和SSH病毒的快速检测。     

新型细菌耐药基因NDM-1实时PCR检测方法的建立

目的 建立灵敏、特异、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测新型细菌耐药基因NDM-1.方法 根据NCBI数据库中β-内酰胺酶类相关耐药基因的序列,详细进行比对,选择特异性最高的片段设计引物和TaqMan探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光PCR方法.对所建立的实时荧光PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价.结果 本方法对各种细菌病原体的新型细菌耐药基因NDM-1的检测具有高度特异性和灵敏度.优化后的引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为100 nmol/L,灵敏度和特异度均为100％.该方法的检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,远远高于普通PCR1.0×105拷贝/μl的检测下限.结论 所建立的方法能够特异和敏感地检测携带NDM-1基因的超级细菌,能够作为携带有该基因细菌的灵敏快速的检测方法.     

伯氏疏螺旋体分型多重实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种检测伯氏疏螺旋体的分型多重实时荧光定量PCR方法,可对3种致病基因型伽氏疏螺旋体B.garinii、阿氏疏螺旋体B.afzelii、狭义伯氏疏螺旋体B.burgdorferi sensu stricto检出并分型。方法针对3种基因型菌株的外膜蛋白osp C基因,在保守序列设计通用引物并分别设计型特异Taqman探针,3条探针分别标记FAM、Texas Red和CY5荧光报告基团,建立和优化多重实时荧光定量PCR反应体系,检测其敏感性和特异性。结果建立的多重荧光定量PCR的最低检测值为B.garinii 40copies/μl、B.afzelii 5.17copies/μl和B.burgdorferi sensu stricto 37.8copies/μl,通过检测立克次体、土拉弗朗西斯菌无交叉反应,检测100只游离蜱与常规PCR结合测序结果分型一致,说明本方法有较好的灵敏性和特异性。结论该方法能快速检测伯氏疏螺旋体并同时分型,为莱姆病的诊断提供新方法。     

应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法

目的应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus,JEV)、黄热病毒(YellowFeverVirus,YFV)、西尼罗病毒(WestNileVirus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)和登革病毒(Dengue virus,DV)5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法。方法利用Primer Premier5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性。结果应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142 bp、293 bp、377 bp、630 bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5 000 PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105copies/μl、2.6×104copies/μl和1.37×104copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应。结论应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测。     

贵州省2006-2010年脊髓灰质炎实验室监测与评价

目的分析贵州省脊髓灰质炎（脊灰）实验室监测数据,评估运转情况,为贵州省继续维持无脊灰状态提供实验室数据。方法采用病毒分离、鉴定与核苷酸序列分析的方法,对贵州省2006-2010年报告的急性弛缓性麻痹（AFP）病例、接触者及其他人群粪便标本进行病毒学检测和结果分析。结果 2006-2010年贵州省脊灰实验室共收到2 204份AFP病例粪便标本,332份AFP病例接触者粪便标本,310份其他人群粪便标本。从AFP病例中分离到非脊灰其他肠道病毒（NPEV）209株,脊灰病毒（PV）54株;从AFP病例接触者中分离到NPEV33株,PV6株;其他人群中分离到NPEV27株,PV9株。所有PV阳性分离物均送到国家脊灰实验室进行型内鉴定,全部为疫苗相关株。贵州省脊灰实验室每次均通过WHO和国家脊灰实验室的能力验证和现场认证评估。结论 2006-2010年贵州省脊灰实验室监测系统运转正常,未发现脊灰野病毒（WPV）或疫苗衍生脊灰病毒（VDPV）。贵州省继续保持无脊灰状态。     

江西省脊髓灰质炎病毒的型内分析

目的：建立快速准确的方法鉴别脊灰病毒的疫苗株、野毒株和变异株。方法：RT—PCR—RFLP法进行脊灰型内鉴别。结果：216例AFP病例粪便标本，经鉴定为：脊灰Ⅰ型3株，Ⅱ型12株，Ⅲ型7株，均为疫苗相关株，未发现脊灰野毒株和变异株或衍生株。结论：在省级脊灰实验室建立脊灰型内鉴别方法，不仅可以提高脊灰野病毒和变异株或衍生株的检测速度，更有利于维护无脊灰状态，为该疾病预防控制提供重要的科学依据。     

肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立

目的 建立和优化一种灵敏、特异的检测肝组织中乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR).方法 设计检测HBV DNA(tDNA)和cccDNA特异性引物及探针,用3.44×100-3.44×109copies/μl含HBV全基因组序列(C基因型)质粒作为标准品,建立荧光定量PCR检测标准曲线.取33例乙肝肝癌患者肝组织标本、13例慢性乙肝患者肝活检组织标本和10例非乙肝患者肝组织标本,验证该法灵敏度和特异度.提取肝组织中DNA,取一部分进行质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切;另一部分不酶切作为tDNA和β-globin检测样本,分别进行HBV cccDNA、tDNA和p-globin定量检测,以β-globin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和tDNA含量进行标准化.结果 检测肝组织中HBV cccDNA和tDNA定量的线型范围均为3.44 × 100-3.44×109 copies/μl.检测HBV cccDNA和HBV DNA下限均为3.44×100copies/μl.33例乙肝肝癌患者和13例慢性乙肝患者的肝组织中HBV cccDNA最低含量分别为0.003 copies/cell和0.031 copies/cell;检测10份非乙肝肝癌患者的肝组织标本均为阴性.应用PSAD消化肝组织中提取的DNA可减少假阳性,提高cccDNA检测法特异度达7.24× 102倍.对2例乙肝肝癌患者的肝组织标本重复检测5次,Ct值的变异系数为0.224%～0.609%.结论 该方法灵敏度和特异度高,重复性好,可用于检测肝组织中HBV cccDNA.

Abstract：

Objective To establish and optimize a sensitive and specific quantitative realtime polymerase chain reaction(PCR)method for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA(HBV cccDNA)in liver tissue. Methods Specific primers and probes were designed to detect HBV DNA(tDNA)and cccDNA. A series of plasmids(3.44 × 100-3.44 × 109 copies/μl)containing a full double-stranded copies of HBV genome(genotype C)were used to establish the standard curve of real-time PCR. Liver samples of 33 patients with HBV related hepatocellular carcinoma(HCC), 13 Chronic hepatitis B patients(CHB)and 10 non-HBV patients were collected to verify the sensitivity and specificity of the assay. A fraction of extracted DNA was digested with a Plasmid-Safe ATP-dependent Dnase(PSAD)for HBV cccDNA detection and the remaining was used for tDNA and β-globin detection. The amount(copies/cell)of HBV cccDNA and tDNA were measured by a real-time PCR, using β-globin housekeeping gene as a quantitation standard. Results The standard curves of real-time PCR with a linear range of 3.44 × 100 to 3.44 × 109 copies/μl were established for detecting HBV cccDNA and tDNA, and both of the lowest detection limits of HBV cccDNA and tDNA were 3.44 × 100 copies/μl. The lowest quantitation levels of HBV cccDNA in liver tissues tested in 33 HBV related HCC patients and 13 CHB patients were 0.003 copies/cell and 0.031copies/cell, respectively. HBV cccDNA and tDNA in liver tissue of 10 non-HBV patient appeared to be negative. The true positive rate was increasing through the digestion of HBV DNA by PSAD, and the analytic specificity of cccDNA detection improved by 7.24 × 102 times. Liver tissues of 2 patients were retested 5 times in the PCR for detecting cccDNA and the coefficience of variations on cycle threshold (Ct)were between 0.224%-0.609%. Conclusion A highly sensitive and specific quantitative real time PCR method for the detection of HBV cccDNA in liver tissue was established and could be used for clinical and epidemiological studies.     

基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,检测基孔肯雅病毒。方法通过序列比对挑选出基孔肯雅病毒基因组中高度保守的序列,在此序列上设计引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR反应体系。结果经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达21拷贝/μl,通过检测与传播媒介相似的流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应。结论该方法的建立在基孔肯雅热的疾病防控方面有较好的应用前景。     

鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测

目的 建立一种快速检测鼠疫耶尔森菌的方法.方法 以编码F1抗原的基因caf1为靶序列,人工合成基因序列,制备重组质粒作为鼠疫耶尔森菌检测的标准样品;用实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)技术,针对pMT1质粒上的caf1基因设计引物和TaqMan荧光探针,进行实时FQ-PCR检验,评价该方法的准确性、敏感性及特异性.建立鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时FQ-PCR检测方法.结果 本研究成功构建了质粒pUC57-caf1,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.03×102～5.03×107拷贝数之间,具有较好的线性关系,相关系数1.0.实时FQ-PCR检验最低可检测出5.03×102拷贝数的重组质粒,灵敏度比普通PCR高100倍.特异性检测试验可选择性检测出鼠疫耶尔森菌,与其他细菌无交叉反应,结果与普通PCR一致.对同一浓度的重组质粒进行15个平行样品的重复性试验,Ct值标准差为0.28.结论 建立TaqMan探针实时FQ-PCR检测技术,能够快速、准确、特异的检测鼠疫耶尔森菌,为鼠疫监控、诊断提供技术支持.     

HBV cccDNA SYBR GreenⅠ荧光定量检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种稳定、特异、敏感的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA (cccDNA) SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法.方法 根据乙肝病毒松弛环状DNA (HBVrcDNA)与cccDNA的结构差异,设计跨越双缺口的特殊引物,并利用一种ATP依赖不降解质粒的DNA酶(Plasmid-SafeTMATP dependent DNase,PSAD)提高反应的特异性;建立荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性检验.应用所建立的方法评价拉米夫定和阿德福韦酯对HBVcccDNA的抑制效果.结果 该方法能特异性检测到HBV cccDNA,在2.68×1082.68×103 copies/μl检测范围之间有良好的线性关系,相关系数为-1.00,扩增效率为102％;最低检测限为2.68×101 copies/μl.拉米夫定和阿德福韦酯对HBVcccDNA均有很好的抑制效果.结论 该实验所建立的方法稳定性强、特异性好、灵敏度高,可快速定量检测HBVcccDNA,用于抗HBV药物的评价.     

基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。