HIV-1 vif基因的RNA干扰体外研究

 目的 利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录后水平进行下调,达到抑制vif蛋白表达的目的,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础。 方法 通过体外转录法合成siRNA,与转接有vif基因的表达质粒共同转染HEK 293T'细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,并利用Real-time PLR和Western blot对HIV-1 vif分别从转录和表达水平进行验证。 结果 将pECGFP-N1-vif重组载体转染H EK 293T细胞后,结果显示vif蛋白可以在细胞中高水平表达;针对vif设计的3段特异的siRNA可以有效且特异地降低vif蛋白的表达。 结论 RNAi技术可以下调HIV-1蛋白的表达,此技术可以作为一项新的治疗和预防HIV-1的方法用于进一步的研究。     

Survivin干扰RNA载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:探索合成survivin siRNA和RNAi载体的构建,及其在HEK293细胞中的表达?方法:分别采用化学合成的针对survivin的siRNA和shRNA载体(pGCsi载体),转染HEK293细胞后观察HEK293细胞中survivin的RNA及蛋白表达?结果:不同序列的siRNA和shRNA转染入HEK293细胞后,survivin的RNA及蛋白表达出现不同程度的下降?结论:化学合成与shRNA载体均可有效抑制HEK293细胞的survivin基因表达,为利用survivin作为靶点治疗胰腺癌等恶性肿瘤提供了技术基础?     

人凋亡相关因子基因RNA干扰慢病毒载体的构建与包装

目的:构建人凋亡相关因子(Fas)基因短发夹RNA慢病毒载体,实现沉默人脐带间充质干细胞Fas基因的表达.方法:根据Fas基因mRNA序列,设计4组靶向Fas基因的短发夹RNA序列,合成、退火形成双链DNA片段,与经过DNA内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞,对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序及比对分析.通过转染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定.结果:经酶切及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,通过荧光显微镜观察证明病毒转入293T细胞,感染效率 > 90%,并获得高滴度的慢病毒载体,病毒滴度为3×108TU/ml.结论:成功构建人Fas基因RNA干扰慢病毒载体,为下一步转染脐带间充质干细胞提供理论参考.     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α治疗骨肉瘤的实验研究

目的　观察靶向缺氧诱导因子 (HIF)- 1α的短发夹状小干扰RNA基因转染对骨肉瘤生长的影响。方法　针对HIF- 1α构建短发夹状siRNA真核表达载体 (pSilencer) HIF并转染骨肉瘤细胞系(SaOS) 2。骨肉瘤细胞置于缺氧诱导培养基中培养。逆转录 聚合酶链反应 (RT -PCR)和免疫印迹沉淀观察HIF -1α的基因沉默效果。四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色分析检测细胞体外增殖活力,透射电镜,原位末端标记TUNEL法,AnnexinV/PI双标记法检测细胞的凋亡。同时,通过裸鼠移植瘤模型观察HIF- 1α基因沉默后对骨肉瘤体内治疗效果。结果　测序证实成功构建HIF- 1α的短发夹状siRNA真核表达载体pSilencer HIF,转染骨肉瘤细胞后,HIF -1α基因表达显著抑制 ( 90% )。与对照组比较,pSilencer HIF转染组骨肉瘤细胞缺氧状态下的增殖活性显著降低。缺氧培养 72h后,透射电镜、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征,AnnexinV/PI双标检测转染组细胞凋亡率为 18. 71% ±0. 98%,明显高于pSilencer neo空载体转染组和未转染组 (P< 0 .01 )。裸鼠移植瘤实验显示pSilencer HIF转染组肿瘤生长减慢,成瘤率下降,肿瘤组织中可见大量坏死组织。结论　靶向HIF- 1α基因的短发夹状siRNA可以有效阻断骨肉瘤缺氧耐受转导通路,抑制骨肉瘤细胞的生长。     

小鼠NOMO1基因RNA干扰载体的构建及其功能的初步研究

目的:构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,比较其对P19细胞NOMO1基因的抑制效率,以研究NOMO1基因与P19细胞向心肌细胞方向分化的关系?方法:利用Designer3.0软件设计小鼠NOMO1基因干扰片段,合成shRNA序列,再行寡核苷酸双链的合成,退火后形成的寡核苷酸双链克隆到pGPU6/Hygro载体的黏性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒扩增,质粒DNA抽提,使用PstⅠ?BamHⅠ进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆?将小鼠NOMO1基因RNA干扰载体转染P19细胞,以RT-PCR技术验证NOMO1基因在P19细胞中的mRNA表达?以DMSO诱导分化方案诱导P19细胞向心肌细胞分化,采用定量 RT-PCR技术检测P19细胞中α-MHC等基因mRNA的表达,评估NOMO1与P19干细胞向心肌细胞方向分化的关系?结果:双酶切证实shRNA正确插入质粒,测序结果表明插入的序列正确?载体转染的P19细胞筛选稳定表达株,经RT-PCR和Western blot验证4个位点设计的干扰质粒对NOMO1在P19细胞中的mRNA表达均具有较高的抑制效率?转染后P19细胞的α-MHC基因mRNA表达则显著下调(P < 0.05)?结论:成功构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,为研究NOMO1基因与P19细胞向心肌细胞方向分化的关系提供了稳定的转染细胞工具,NOMO1可能通过诱导α-MHC等基因表达,促进P19干细胞向中胚层的分化?     

HIV-1 vpr基因表达载体 pAFVPRA 的构建

目的　构建可在肝癌细胞中特异性表达人HIV 1vpr基因的重组表达载体。方法　用PCR的方法从 pBSX CYPYVPR xcTHY(简称vpr质粒 )中扩增HIV 1vpr基因片段 ,克隆到pGEM T载体中 ,构建克隆载体 pGEM T/vpr,切下vpr片段后插入到 pCI质粒中 polyA的上游 ,构建中间载体pCI/vpr ,再切下vprA(vpr+polyA)插入到pAF5 .1中AFP启动子的下游 ,从而把AFP启动子和polyA尾分别克隆到vpr基因的上游和下游 ,构建成 pAFVPRA载体。 结果　成功构建了带有AFP启动子和polyA尾的载体 pAFVPRA。结论　pAFVPRA质粒构建成功后 ,可进一步通过合适的方式把HIV 1vpr基因导入肝细胞 ,以探讨vpr基因对原发性肝癌细胞的杀伤作用     

肺癌相关基因的RNA干扰实验研究

目的为研究点突变的PP2Aα基因对单克隆抗体N-35相关蛋白N35表达的影响，探讨其作为肺癌基因治疗侯选靶基因的可行性．方法将云南个旧肺腺癌细胞系GLC-82作为靶细胞，点突变的PP2Aα基因作为靶基因，设计并构建shRNA质粒表达载体，通过阳离子脂质体导入GLC-82细胞，经G418筛选阳性克隆，采用蛋白质印迹法检测N35表达量的变化．结果所有shRNA质粒表达载体均成功导入GLC-82细胞并能使它们在含G418培养基中长时间生长：[第一段]     

小鼠睾丸组织特异基因RNA干扰载体的构建及其表达的研究

目的构建并筛选小鼠睾九组织特异基因Fank1干扰载体，为进一步研究Fank1基因功能及与Fank1基因相关男性不育的基因治疗奠定基础。方法根据Fank1基因cDNA序列，利用http：//www．dharmacon．com/在线设计软件设计2条干扰序列，分别克隆至带有H1启动子的质粒载体pSuper-neo-GFP中，同时从成年B6小鼠睾丸组织扩增Fank1基因全序列，构建Fank1基因与红色荧光蛋白表达融合载体pdsRED—Fank1。采用脂质体法将2个Fank1基因干扰载体及阴性对照分别与Fank1基因表达载体共转染293T细胞，并观察siRNA对Fank1基因的抑制效应及红色荧光蛋白表达情况，分别采用RT—PCR和Western blot方法检测mRNA及蛋白质表达水平。结果经PCR检测鉴定，含干扰序列的重组质粒pSuper-shFank1 631#,pSuper-shFank 1247#及pdsRED—Fank1表达载体构建成功，测序分析完全正确。转染293T细胞36h后，荧光显微镜检查发现shFank1631、247均能明显抑制红色荧光蛋白表达，抑制效率分别为95％和90％，RT-PCR和Western blot结果表明Fank1基因在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制（P〈0．05）。结论成功构建出小鼠睾丸特异基因干扰载体，为制备Fank1基因敲减转基因小鼠及研究Fank1基因在精子生成过程中的作用奠定了基础。     

基因沉默与RNA干扰

生物体经过漫长的进化和自然选择后逐渐形成了对异常基因活动进行监控和防御的能力,这种天然免疫机制在最近几年的研究中得到了进一步认识。所谓异常基因活动是指病毒基因侵入和复制,转座子和转基因表达。正常基因活动几乎不产生双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),而异常基     

RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响

目的:观察RNA干扰沉默ERCC1基因对卵巢癌细胞耐药的影响。方法:体外合成靶向于ERCC1基因的小干扰RNA(ERCC1-siRNA),用脂质体法转染至卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP,RT-PCR方法检测转染前后细胞内ERCC1 mRNA的表达,W estern blot方法检测ERCC1基因蛋白表达的改变,MTT实验检测转染前后COC1/DDP细胞对顺铂敏感性的变化。结果:转染ERCC1-siRNA后,COC1/DDP细胞中ERCC1基因的mRNA和蛋白表达均明显减少。RNA干扰联合顺铂用药能明显提高COC1/DDP细胞对顺铂的敏感性。结论:RNA干扰ERCC1基因能明显抑制COC1/DDP细胞内ERCC1基因mRNA和蛋白的表达,增加COC1/DDP细胞对化疗药顺铂的敏感性。     

基因沉默的维持——长效RNA干扰

自揭示了哺乳动物细胞中的RNA干扰（RNAi）现象以来，对其进行了大量的研究与资金投入，期望将其发展成一种切实可行的治疗手段。毫无疑问，RNAi是最具发展潜力的基因治疗策略。由于许多采用RNAi治疗的疾病需要长期用药，因此，有关RNAi类药物长期应用的安全性问题成为关注重点。     

PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建靶向PIK3CA（P110α）基因的RNA干扰慢病毒载体。方法针对PIK3CA—mRNA（NM_006218）设计4个RNA干扰靶点序列和一个阴性对照靶点,构建慢病毒转移质粒pGCL—GFP。构建成功的RNA干扰质粒与PIK3CA表达质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观测转染效果,Western Blot检测PIK3CA蛋白表达,筛选出干扰效果最好的RNA干扰质粒。将该质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒并检测其滴度。结果4个靶点和阴性对照靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过Westem Blot检测获得最有效干扰靶点,并成功包装成滴度为2×10^8TU／ml的慢病毒。结论成功构建可供感染的PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体,为进一步研究PIK3CA功能和用慢病毒进行卵巢癌基因治疗奠定了基础。     

RNA干扰沉默食管癌COX-2基因的实验研究

目的:观察人食管鳞癌细胞(Eca-109)在RNAi抑制其环氧合酶2(COX-2)基因表达后生物学行为的变化。方法:采用DNA载体细胞内表达siRNA技术,以含RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的质粒pSUPER,针对人COX-2 mRNA分别构建重组质粒psiRNA-C1、psiRNA-C2,转染Eca-109细胞,对照组采用空白质粒pSU-PER。ELISA测定培养液上清PGE2浓度,Real Time PCR检测细胞COX-2 mRNA水平,流式细胞术分析细胞凋亡与周期分布,绘制细胞生长曲线。结果:在psiRNA-C1p、siRNA-C2转染Eca-109细胞24 h后,细胞COX-2mRNA水平分别下降了17.9%、56.1%,培养液上清PGE2浓度分别下降了10.8%5、4.9%;psiRNA-C2组细胞生长明显减缓,G0~G1期细胞比例增加(P<0.01),G2~M期细胞减少(P<0.05)、细胞凋亡率增加(P<0.01)。结论:RNAi技术可显著抑制人食管鳞癌细胞COX-2基因表达,从而导致肿瘤细胞增殖减缓、凋亡增加。     

vpr基因在GFP荧光基因转染SHIV病毒模型中的作用

【目的】通过在vpr基因区不同部位插入EGFP基因,探讨vpr非结构基因的改变对SHIV病毒复制及感染能力的影响。【方法】利用分子克隆的方法,将EGFP基因插入SHIV基因组中的调节基因vpr基因中,最终获得相应的SHIV XJDC6431-EGFP全长克隆,然后在细胞水平检测该病毒感染活性及荧光蛋白表达情况。【结果】通过定点突变及在vpr基因不同部位插入GFP报告基因,检测改造后的质粒虽表达绿色荧光,但经细胞水平检测后均来得到具有感染活性的病毒颗粒。【结论】vpr基因定点突变可使全长SHIV病毒复制大大降低,共至失去感染活性。     

Rictor基因特异性RNA干扰表达载体的构建和筛选

目的构建针对Rictor基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人膀胱癌T24细胞,观察其对目的基因Rictor表达的影响,为探讨沉默Rictor基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响奠定基础。方法根据GENEBANK提供Rictor基因系列,设计并化学合成三对Rictor-RNAi和一对阴性对照寡核苷酸序列,定向克隆入真核质粒载体pGCSIL-PUR中,构建pGCSIL-RICTOR-RNAi表达载体。各质粒载体瞬时转染到T24细胞,Western-Blot检测筛选载体。筛选出的载体稳定转染,Realtime-PCR和Western-Blot筛选干扰效果明显的稳定株。结果重组质粒pGCSIL-RICTOR-RNAi经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,成功构建Rictor-RNAi载体。瞬时转染T24细胞,RICTOR蛋白表达明显降低。稳定转染T24细胞,Rictor基因表达在mRNA水平和蛋白水平均明显降低。结论成功构建Rictor-RNAi表达载体,转染T24细胞后可有效抑制Rictor表达。     

ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascu lar smooth musc le cells,VSMCs)ORC1基因,探讨ORC1基因表达抑制后VSMCs增殖的变化。方法实验设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性(ORC1 A、ORC1 B、ORC1 C)siR-NA组。应用W estern b lot检测ORC1基因表达的变化;应用MTT比色试验、3H-TdR掺入试验检测VSMCs增殖的情况。免疫细胞化学染色观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuc lear antigen,PCNA)表达。结果①siRNA转染后,3个阳性siRNA转染组ORC1基因表达水平均降低,尤以第2对阳性siRNA抑制效果最为显著,而空白对照组及阴性对照组间ORC1基因表达水平无显著差异。②siRNA转染使ORC1表达减弱后,VSMCs的MTT吸光度值3、H-TdR掺入量和PCNA表达量均较空白对照组及阴性对照组显著降低。结论RNA干扰介导的ORC1基因沉寂可显著抑制VSMCs增殖。     

Mpl基因RNA干扰载体的构建及荧光显微镜筛选

目的:建立荧光显微镜快速筛选对血小板生成素受体(Mpl)基因RNA干扰片段的方法.方法:通过体外重组技术将Mpl与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合基因,克隆进pDs载体中产生pDs-Mpl-GFP载体,将人U6启动子及5个Mpl shRNA发夹结构(shMpl-A,shMpl-B,shMpl-C,shMpl-D,shMpl-E)分别克隆至pDs-Mpl-GFP真核载体中,构建出针对Mpl 5个不同位点的RNA干扰载体,然后将获得的上述干扰载体通过脂质体方法转染至293T细胞中,用荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数,判定构建的RNA干扰载体对靶基因RNA的干扰效果.结果:构建的5个干扰载体都能对转染的293T细胞中的Mpl-GFP融合基因进行有效的基因敲减作用,在pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A、pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-B与pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-E的干扰作用下,293T细胞中的荧光强度及发荧光细胞数目变得更少和更弱,干扰效果较好,而其它两个效果较差;在这三个较好的干扰载体中,pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A的干扰效果最好.结论:成功构建Mpl基因的真核RNA干扰载体,并筛选出有效的RNA干扰片段.     

β3GalT7基因的小干扰RNA筛选及其表达载体构建

目的: 以β3GalT7(人β1,3-半乳糖基转移酶7)基因为研究对象,运用RNA干扰技术平台,筛选出该基因的有效小干扰siRNA并构建该基因的RNA干扰表达载体,建立其下调表达模型.方法: 通过PCR方法筛选针对β3GalT7基因的有效小干扰siRNA,并合成带有荧光标记的RNA oligo进一步验证其有效性,进而构建该基因的RNA干扰表达载体建立其下调表达模型.结果: 成功筛选到β3GalT7基因的有效小干扰siRNA, 并进一步成功构建β3GalT7的RNA干扰真核表达载体.结论: 成功构建β3GalT7的真核干扰表达载体,继而可以获得β3GalT7表达受抑制的人胃癌细胞SGC7901克隆,为研究该基因在肿瘤发生发展中的作用提供实验模型.     

小分子干扰RNA下调星形细胞上调基因1的表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)下调星形细胞上调基因1(AEG-1)表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响。方法卵巢癌细胞株SKOV3分为3组:空白对照组(不做任何处理)、阴性对照组(对照siRNA转染)和观察组(AEG-1 siRNA转染)。用反转录聚合酶链反应观察AEG-1 siRNA对AEG-1基因表达的影响;甲基噻唑基四唑法观察AEG-1 siRNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测AEG-1 siRNA对卵巢癌SKOV3细胞凋亡和细胞周期的影响。结果空白对照组和阴性对照组AEG-1 mRNA表达、SKOV3细胞增殖、细胞凋亡率及在DNA合成前期(G0/G1期)、合成期(S期)、合成后期(G2/M期)的细胞比例差异均无统计学意义(P>0.05)。观察组SKOV3细胞AEG-1 mRNA表达显著低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。观察组SKOV3细胞增殖在24、48、72 h较空白对照组和阴性对照组均显著减慢,差异有统计学意义(P<0.01)。观察组SKOV3细胞凋亡率显著高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01);观察组SKOV3细胞在DNA合成前期(G0/G1期)细胞比例显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),而合成期(S期)、合成后期(G2/M期)的细胞比例均显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),差异均有统计学意义。结论 siRNA可通过下调卵巢癌SKOV3细胞AEG-1基因的表达,抑制其增殖,促进其凋亡。