白念珠菌FLO8基因高表达菌株构建及鉴定

目的 :构建白念珠菌FLO8基因高表达菌株。方法 :将白念珠菌FLO8基因插入p CP20质粒载体ADH1启动子后,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)将ADH1-FLO8-Lox P-ARG4-Lox P-ADE2片段扩增,并通过同源重组技术将该片段整合至SN152的ADE2位点。结果:通过测序鉴定FLO8基因高表达质粒载体构建成功;通过同源重组及实时反转录PCR验证表明FLO8基因整合到SN152菌株的ADE2位点并且表达量增高。结论:以p CP20质粒为载体,通过同源重组等技术,可高效构建白念珠菌FLO8基因高表达菌株。     

都柏林念珠菌和白念珠菌的分子生物学鉴定

近年来分子生物学技术的大量应用为真菌的鉴定提供了快速、可靠的鉴定方法，我们对分离自阴道念珠菌病患者的325株白念珠菌进行了研究，试图从表型和基因型分型角度了解都柏林念珠菌在阴道念珠菌病的临床分离率。     

CDHR2基因条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定

目的:构建CDHR2基因条件性敲除小鼠模型,为研究CDHR2基因的生物学功能提供条件。方法:构建CDHR2基因条件打靶载体,电转入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用G418和GANC筛选阳性细胞克隆。胚胎注射阳性ES细胞入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。嵌合体小鼠与Cre小鼠交配获得条件性敲除小鼠。分别通过PCR方法和免疫组织化学方法对CDHR2的敲除结果进行验证。结果:成功构建打靶载体,并获得6个正确同源重组的ES细胞阳性克隆。阳性ES细胞克隆注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得5只嵌合鼠。嵌合鼠再与Flp小鼠交配,获得6只阳性F1代去Neo小鼠。去Neo小鼠与Cre小鼠杂交,获得CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠。免疫组织化学检测表明,阳性小鼠肠道组织中的CDHR2基因被特异性敲除,而肾脏组织CDHR2基因的表达没有受到影响。结论:成功构建CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠,为进一步研究CDHR2基因的作用奠定了基础。     

外阴阴道念珠菌病患者白念珠菌分离情况及ERG5基因位点突变分析

目的 了解外阴阴道念珠菌病(VVC)患者白念珠菌分离及ERG5基因突变情况.方法 收集无锡市妇幼保健院2018年6—12月妇产科门诊VVC患者阴道分泌物500例,通过镜下观察菌丝及孢子选取可疑标本,经沙保弱琼脂平板增菌后接种科玛嘉显色平板,进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定;用真菌快速...     

白念珠菌β-葡萄糖苷酶2的原核细胞表达、鉴定及免疫反应性

目的构建白念珠菌β-葡萄糖苷酶2(BGL2)的原核细胞表达质粒,诱导其表达后加以鉴定,并初步判定重组蛋白质的免疫反应性。方法 PCR法获取白念珠菌SC5314的bgl2基因,插入原核细胞表达载体pET30a中,以重组质粒转染感受态细胞大肠埃希菌(E.coli)BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测蛋白质的表达情况,梯度透析法对包涵体蛋白质复性,用抗His标签单克隆抗体鉴定。用临床侵袭性念珠菌病(IC)患者血清判定重组蛋白质的免疫反应性。结果成功构建原核细胞表达质粒pET30a-bgl2,诱导后的重组蛋白质以包涵体形式表达,经梯度透析复性成功。重组蛋白质能被抗His标签抗体识别,并与IC患者血清有良好的反应性。结论用原核细胞表达体系成功表达了白念珠菌BGL2,该蛋白质具有良好的免疫反应性,为进一步研究其在IC诊断中的作用打下基础。     

ERG11基因突变与白念珠菌对氟康唑耐药性的初步研究

目的探讨白念珠菌氟康唑作用的靶酶编码基因（ERG11）突变与氟康唑耐药性的关系。方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增临床分离的23株白念珠菌ERG11基因,包括2株耐氟康唑株、9株氟康唑剂量依赖敏感株和12株氟康唑敏感株,并进行双向测序。应用B last软件,将测序结果与网上已发表序列（GenBankAY856352）进行比对,以确定是否发生基因突变。结果23株白念珠菌的ERG11基因序列共检出16个同义突变位点和18个错义突变位点。错义突变中Y205E、I437V、A255V、E260V、K487N、G472R、N435V、D502E、K143Q为新发现的突变位点。结论Y205E、I437V、A255V位点突变发现于敏感株,可能与白念珠菌耐药无关;K487N、G472R、N435V、D502E、E260V发现于剂量依赖敏感株,K143Q发现于耐药株,可能与耐药的形成有关。     

抗白念珠菌IgY对白念珠菌性阴道炎小鼠的保护作用

目的　研究抗白念珠菌IgY对阴道感染白念珠菌小鼠的保护作用。 方法　用环磷酰胺造成BALb/C小鼠免疫功能低下 ,经阴道感染白念珠菌 ,用IgY治疗 ,2天后取阴道冲洗液进行细菌学培养 ,计算菌落数 (CFU )。 结果　感染标准菌株实验组菌落数的几何均数为 0 .5 85 3,对照组为 2 .110 0 ;感染临 1菌株实验组菌落数的几何均数为 0 .5 2 2 7,对照组为1.9131;两两比较有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。结论　抗白念珠菌IgY对免疫功能低下鼠阴道感染白念珠菌有明显的保护作用。     

介绍两种鉴定白色念珠菌的方法

应用含０．０１％阿尼林蓝ＷＳ染料的ＹＭ固体培基（ＹＭＡＢ）和以对－硝基苯酚－Ｎ－乙酰－β－Ｄ－氨基半乳糖苷（ＮＧＬ）为底物鉴定白色念珠菌（白念菌），同时进行芽管试验。生长于ＹＭＡＢ上的白念菌温育１２～１８小时后在伍德灯下可观察到黄绿色荧光。ＮＧＬ酶法温育９０分钟后，白念菌酶类可分解底物呈现明显黄色。两种方法均正确鉴定了５５例白念菌中的５４例（９８．２％）。阿尼林蓝法中，１株类星形念珠菌也出现荧光，特异性９２．８％，敏感性及预示值均高于芽管法。ＮＧＬ酶法中，７株近平滑念珠菌呈阳性，特异性５０％，但反应快速。将两种方法并用，可使正确鉴定率达１００％，且两种方法简便、价廉，易于推广。     

生物膜中白念珠菌的耐药性研究

白念珠菌（Canida albicans）是人类最常见的条件致病真菌,健康者带菌率以口腔最高,约80％。当机体免疫力下降或使用免疫抑制剂时,白念珠菌可导致严重的感染性疾病,在美国医院感染中列第4位,其病死率为30％～70％。研究发现,在难治性白念珠菌感染的病灶中大多存在生物膜。自然界中99％微生物以生物膜的形式存在,65％人类感染性疾病与生物膜相关。     

白念珠菌烯醇化酶重组蛋白质的制备及鉴定

目的 制备具有高免疫原性的白念珠菌重组烯醇化酶蛋白质。 方法 以白念珠菌C1标准株基因组DNA作为模板,用PCR法扩增烯醇化酶的全长DNA序列,以pET28a(+)为载体,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组融合蛋白质表达。用抗his标签的单克隆抗体和白念珠菌抗体阳性的病人血清进行western blot鉴定,亲和层析柱纯化重组蛋白质。 结果 获得了含白念珠菌烯醇化酶全长基因的重组表达载体和相应工程菌株,经IPTG诱导后能高效表达重组融合蛋白质。经已含抗体的病人血清进行western blot鉴定,表明诱导的重组蛋白质有良好的免疫原性。 结论 成功克隆了白念珠菌烯醇化酶全长基因并在大肠埃希菌中获得高效表达;重组蛋白质具有良好的免疫原性。     

白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶重组蛋白的制备及鉴定

摘要：目的：制备有免疫原性的白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶（fructosebisphosphate aldolase, Fba1)重组蛋白。 方法：以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,用PCR法扩增Fba1 DNA序列,与克隆载体pMD18-T连接、测序,再与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组表达质粒pET28a(+)/Fba1,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组融合蛋白表达,亲和层析柱纯化重组蛋白。用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊为侵袭性白念珠菌病（ICAI）、且抗白念珠菌烯醇化酶抗体阳性的患者血清进行抗原性鉴定。 结果：Fba1 DNA序列与GenBank中的序列一致。在大肠埃希菌中获得白念珠菌Fab1重组蛋白的高效表达,表达产物以可溶性蛋白为主,最终蛋白质得率为7.6 mg/g湿菌。经免疫印迹鉴定,重组蛋白与抗His标签的单克隆抗体和确诊ICAI患者血清呈特异性反应,显示出良好的抗原反应性。 结论：成功制备了具有良好抗原反应性的重组蛋白,为建立特异性诊断ICAI的新方法打下基础。     

白念珠菌耐药机制及治疗的研究进展

白念珠菌是目前最常见的局部及系统真菌感染,随着抗真菌药物的广泛使用,其耐药性明显增强。研究表明,耐药性形成主要原因为耐药相关基因如ATP结合盒转运蛋白超家族和主要易化扩散载体超家族等表达异常,生物膜形成。而联用抗真菌药物、中药、植物提取物及抗真菌新药的使用,可抑制耐药菌株的生长。     

基因敲除的新技术——RNAi

RNA干扰（RNAi）是一种新兴的基因阻断技术,它通过双链RNA分予介导,特异降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默,自1995年首次报道以来已取得了重大研究进展。近8年来,研究者对RNAi现象进行了广泛、深入的探索研究,预示RNAi有望成为今后分析人类基因功能的有力工具,并将在人类疾病的基因表达显像和治疗方面发挥重要作用。     

MIF基因敲除小鼠各脏器中的炎症因子的表达

目的 探索巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)基因敲除小鼠各脏器中的炎症因子的表达状态及其在动物模型中的应用.使用MIF基因敲除(knockout,KO)小鼠,检测基础状态下及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激状态下各个脏器...     

2 mol/L尿素溶血试验在UT-B基因敲除小鼠核型鉴定中的应用

目的 探讨2mol/L尿素溶血试验在UT-B基因敲除小鼠核型鉴定中的作用.方法 (1)按SP级动物饲养标准进行饲养和繁殖;以UT-B基因敲除纯合子(UT-B-/-)成年雄鼠与C57/bl雌鼠合笼,繁殖出UT-B基因敲除杂合型小鼠(UT-B /-,F1代),F1代UT-B /-雄、雌鼠交配获F2代小鼠.(2)取F2代小鼠剪尾提取基因组DNA进行核型鉴定筛选纯合子小鼠(UT-B-/-)和野生型小鼠(UT-B / );(3)应用2 mol/L尿素溶血试验和肾脏RT-PCR进行UT-B-/-(Jknull)表型鉴定.结果 (1)在SP级饲养和繁殖的条件下,已获得足够的UT-B-/-和UT-B / 小鼠;(2)2 mol/L尿素溶血试验证明,UT-B / 小鼠和UT-B /-小鼠的红细胞加入到2mol/L尿素中立刻溶血,UT-B-/-小鼠的红细胞10 min内不溶显示溶血抵抗.结论 2 mol/L尿素溶血试验可准确地鉴定出UT-B-/-小鼠,与基因组DNA的PCR鉴定方法联合应用,可以使引进的UT-B-/-小鼠稳定繁殖、传代.     

Prdm1基因敲除小鼠的繁育和基因型鉴定

本研究目的是繁育和鉴定prdm1基因敲除的小鼠,为进一步研究Blimp-1蛋白的功能奠定基础。将所引进的2种转基因纯合子小鼠B6.prdm1flox/flox和B6.Lck-Cre进行饲养并繁殖,繁殖成功后获得第1代小鼠,将第1代小鼠再次进行交配获得基因型为:B6.prdm1wild/wild.Lck-Cre、B6.prdm1wild/wild、B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre、B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6.prdm1flox/wild。提取第2代小鼠基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增Cre和loxp基因片段后琼脂糖凝胶电泳分别检测cre和loxp基因组DNA的大小。取基因型为B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre即为条件性基因prdm1敲除小鼠,选择B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6小鼠作为对照,应用磁珠分选脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞,并应用Western blot方法检测Blimp-1目的蛋白。结果表明,2种转基因纯合子小鼠均有繁殖能力,其子代相互繁殖后第2代小鼠分离比例基本符合孟德尔遗传规律,亦可以成功获得较多的prdm1基因敲除小鼠。结论:应用Cre-loxp系统可以成功地获得prdm1基因敲除的小鼠。     

人类抗白念珠菌感染免疫机制的研究进展

白念珠菌作为一种条件致病菌,在酵母相通常不引起临床症状。当其大量繁殖,并转变为菌丝相时,会引发临床上各种感染症状。宿主的固有免疫和适应免疫能够帮助机体抵抗白念珠菌感染。近年来,有关抗白念珠菌感染免疫机制的研究有了很大发展,包括Toll样受体、C型凝集素受体样家族、核苷酸结合寡聚域样受体(NLRs受体)、黑色素瘤分化相关基因5受体(MDA5受体)、Th17细胞和IL-17等。本文着重介绍几种模式识别受体以及Th17/IL-17、Treg介导的固有免疫和适应性免疫在宿主抗念珠菌感染免疫中的研究进展。     

白念珠菌致外耳道感染1例

近年来,真菌感染的发病率不断上升,真菌感染者病情亦十分严重。念珠菌属中有11种对人有致病性,包括白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、其他念珠菌等等,以白念珠菌最为常见[1]。白念珠菌广泛分布于自然界,可从正常人的口腔、皮肤、胃肠道及阴道分离出,通常不致病,当机体免疫力下降时,或者长期使用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂、化学药物治疗、放射治疗等,易引起白念珠菌的继发感染[2]。本文报告白念珠菌致外耳道感染1例。     

分离自艾滋病患者白念珠菌唑类药物耐药株中Erg11基因突变研究

目的:探讨分离自艾滋病患者的白念珠菌唑类药物耐药株中Erg11基因的突变及其与唑类耐药的关系.方法:分离自艾滋病患者的100株真菌标本,经科玛嘉显色培养鉴定为白念珠菌85株,根据美国临床实验室标准化协会制订的M27-A方案的液体微量稀释法行体外药物敏感试验,共鉴定出27株唑类耐药株(耐氟康唑和/或伊曲康唑和/或伏立康唑).27株耐药株提取基因组DNA后,对其Erg11基因行PCR扩增、测序并与Genebank中敏感株进行比对分析.结果:在27株唑类耐药株中共发现25处不同点突变,其中5处引起氨基酸替换,分别为D116E、E266D、H485T、V447I和V488I,27株均发生H485T突变,7株耐药株定生E266D突变,4株耐药株发生V488I突变,其中1株同时发生E266D和V4881突变,1株发生V4471突变.结论:分离自艾滋病患者的白念珠菌唑类耐药株中Erg11基因的突变热变区和有意义突变与分离自其他宿主的唑类耐药株的突变情况基本一致;分离自艾滋病患者的白念珠菌唑类耐药株Erg11基因突变并非唯一致耐药因素.     

同源重组细胞基因敲除与siRNA基因沉默的效果比较

本研究比较细胞系同源重组基因敲除(gene knockout)与siRNA基因沉默(gene silence)二种技术方法用于研究蛋白功能方面的效果差异。对鸡B淋巴细胞瘤来源的DT40细胞系,应用基因打靶技术分离出Sam68基因缺失的细胞株,并且利用稳定表达siRNA的质粒pSilencer-Sam68得到Sam68基因沉默的细胞株。与野生型细胞株相比,对这些细胞株进行Sam68的功能解析。结果表明:Sam68基因缺失细胞表现出明显的生长速度迟缓,通过细胞周期检测揭示这些细胞生长速度延迟是由于细胞周期中的G2/M期延长;但在Sam68基因沉默细胞中却没有看到这些变化。结论:针对活细胞中的蛋白功能研究,应用细胞系基因敲除技术比siRNA基因沉默技术能够得到更加清晰的实验结果。