亚砷酸钠对人正常肝细胞凋亡及Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白表达的影响

目的探讨亚砷酸钠对人正常肝(L-02)细胞凋亡及Bax、Bcl-2 m RNA和蛋白表达的影响。方法将L-02肝细胞分别暴露于含0(对照)、50、100、150μmol/L亚砷酸钠的培养基中暴露24 h。采用MTT法检测L-02肝细胞的存活率,采用流式细胞术检测L-02肝细胞凋亡率,采用RT-PCR的方法检测Bax、Bcl-2 m RNA相对表达情况,采用Westernblotting方法检测L-02肝细胞中Bax、Bcl-2蛋白的表达情况。结果与对照组相比,各浓度亚砷酸钠染毒组L-02细胞的存活率均较低,凋亡率均较高,差异均有统计学意义(P0.05);且随着亚砷酸钠染毒浓度的升高,L-02细胞的存活率呈下降趋势,而凋亡率上升趋势。与对照组相比,各浓度亚砷酸钠染毒组L-02细胞中Bcl-2、Bax m RNA和蛋白的表达水平均较高,100μmol/L亚砷酸钠染毒组Bcl-2 m RNA/Bax m RNA值也较高,而150μmol/L亚砷酸钠染毒组Bcl-2 m RNA/Bax m RNA值及50、150μmol/L亚砷酸钠染毒组Bcl-2蛋白/Bax蛋白值均较低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论亚砷酸钠可抑制L-02肝细胞的生长,诱导细胞凋亡的发生;其机制可能与Bcl-2家族的激活有关。     

c-jun末端激酶在亚砷酸钠致人胚胎肝细胞损伤中的表达

目的探讨亚砷酸钠染毒对人胚胎肝(L-02)细胞中c-jun末端激酶(JNK)的变化。方法将处于对数生长期的L-02细胞分别暴露于终浓度为0(对照)、50、100、150μmol/L的亚砷酸钠溶液中培养24 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长情况,采用流式细胞术检测染毒24 h时的细胞周期及细胞凋亡率;采用蛋白杂交(Western-blot)法检测JNK及p-JNK的蛋白表达水平。结果与对照组相比,各浓度亚砷酸钠染毒组L-02细胞的存活率及G0-G1期构成比均较低,JNK、p-JNK的蛋白表达水平和S期构成比及凋亡率均较高;而G2-M期构成比在50μmol/L亚砷酸钠染毒组较低,在100、150μmol/L亚砷酸钠染毒组均较高,差异均有统计学意义(P0.05)。且随着亚砷酸钠染毒浓度的升高,L-02细胞凋亡率及JNK和p-JNK蛋白的表达水平均呈上升趋势,细胞存活率呈下降趋势。结论亚砷酸钠诱导L-02细胞凋亡可能与JNK及p-JNK表达的增加有关。     

六价铬对L-02肝细胞中Caspase-3与Bcl-2表达影响

为探讨六价铬对L-02肝细胞中Caspase-3与Bcl-2表达的影响,将L-02肝细胞暴露于5、10、20 μmol/L重铬酸钾溶液,在Caspase-3特异性抑制剂氟甲基酮(Z-DEVD-FMK)与Bcl-2特异性抑制剂ABT-737存在的条件下分别检测Caspase-3以及Bcl-2 mRNA的表达水平以及Caspase-3的活力.结果显示Cr(Ⅵ)处理激活Caspase-3但抑制Bcl-2;Caspase-3抑制剂缓解了Bcl-2表达的下降,Bcl-2抑制剂使原本已被激活的Caspase-3表达进一步升高.提示本实验剂量的Cr(Ⅵ)可诱导L-02肝细胞发生细胞凋亡,且Bcl-2与Caspase-3之间存在负反馈调节作用.     

亚砷酸钠对L-02肝细胞的氧化损伤作用

[目的]探讨亚砷酸钠(NaAsO2)对体外培养的人肝细胞株(L-02)的氧化损伤作用. [方法]用不同浓度NaAsO2(50,100,150 μmol/L)染毒L-02肝细胞24 h,MTT法检测NaAsO2对L-02肝细胞生长的影响;流式细胞仪检测L-02肝细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;钼酸铵法测定过氧化氢酶(catalase,CAT)活性;单细胞凝胶电泳(single-cell gel electrophoresis,SCGE)法检测DNA损伤. [结果]NaAsO2作用L-02肝细胞24h后,50、100、150 μmol/L浓度NaAsO2组的L-02肝细胞存活率和CAT活性与对照组相比显著降低(P<0.01).且呈剂量-反应关系;100、150μmol/L浓度NaAsO2组ROS生成量显著增多(P<0.01);50 μmol/L的NaAsO2即可引起出现彗星现象的细胞数明显高于对照组,拖尾细胞阳性率明显升高(P<0.01),且呈剂量-反应关系. [结论]NaAsO2对L-02肝细胞的生长具有明显的抑制作用,可引起L-02肝细胞内ROS增多和CAT活性降低,引起细胞DNA损伤.     

无机砷对Chang肝细胞活性氧的诱导和核转录因子表达的影响

目的 研究亚砷酸钠(NaAsO2)对Chang肝细胞中活性氧(ROS)的诱导以及对核转录因子Nrf2的活化作用.方法 体外实验采用0～10μmol/L NaAsO2溶液对Chang肝细胞染毒2、6、12和24 h.分别用流式细胞仪和免疫印记实验(Westernblot)技术检测细胞内ROS含量和Nrf2蛋白的表达.结果 2.5lμmol/LNaAs02溶液染毒6h、5.0Ixmol/LNaAsO2 溶液染毒2、6、12、24 h的平均荧光强度的相对比值均高于对照组,差异有统计学意义(P(0.05或P＜0.01);且ROS的产生量随着NaAsO2溶液浓度的升高而增多.5.0 μmol/L NaAsO2溶液染毒12 h、5.0 μmol/L NaAsO2溶液染毒2、6、12 h的核转录因子Nrf2蛋白表达均强于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);且核转录因子Nrf2蛋白表达的活化具有时间相关性,即在NaAsO2溶液染毒12 h时核转录因子Nrf2蛋白表达的活化出现高峰,而后逐渐降低至正常水平.结论 无机砷能够诱导Chang肝细胞内ROS的生成和增强核转录因子NIf2蛋白的表达.     

CYP1A2基因沉默及其对三氯乙烯毒性影响

目的 构建细胞色素氧化酶1A2(CYP1A2)基因沉默载体,转染L02人正常肝细胞(简称“L02细胞”),建立CYP1A2沉默细胞株并观察其对三氯乙烯(TCE)毒性的影响.方法 设计合成短发卡RNA(shRNA),连接到pLKO.1-puro质粒中构建CYP1 A2 shRNA慢病毒表达载体,感染L02细胞.筛选CYP1A2沉默细胞株,采用荧光定量聚合酶链式反应和免疫印迹法鉴定.分别采用浓度为0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mmol/L的TCE(设为相应的染毒剂量组)对L02细胞和CYP1A2沉默细胞染毒12h,同时设置二甲基亚砜溶剂对照组(即0.00 mmoL/L染毒剂量组),观察凋亡基因[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9]和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)等基因表达的变化.结果 测序证明插入pLKO.1-puro载体的CYP1A2基因干扰序列与设计的shRNA 序列一致.CYP1A2沉默细胞的CYP1A2mRNA和CYP1A2蛋白相对表达水平分别较L02细胞下降75.9％和82.4％(P＜0.01).TCE染毒后,0.25 ～4.00 mmol/L 4个染毒剂量组CYP1A2沉默细胞Bcl-2表达水平均高于相应染毒剂量组L02细胞(P＜0.01);部分0.25 ～4.00 mmol/L染毒剂量组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和c-fos、c-myc k-ras、p53相对表达水平均低于相应染毒剂量组的L02细胞(P＜0.05或P＜0.01).结论 CYP1A2沉默降低TCE对L02细胞凋亡基因和癌基因的活化作用.     

邻苯二甲酸二乙基己酯在体外对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡Caspase通路的影响

目的通过对原代培养的大鼠卵巢颗粒细胞进行邻苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexylphthalate,DEHP)染毒,探讨DEHP在体外对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡通路Caspase-3和Caspase-9基因表达以及细胞凋亡的影响。方法分离和培养原代未成熟大鼠的卵巢颗粒细胞,用不同浓度的DEHP(0、10、50、100 nmol/L)染毒24 h。荧光定量PCR法检测颗粒细胞的Caspase-3和Caspase-9基因mRNA表达水平,Weastern blot检测颗粒细胞Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平,流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率。结果与对照组相比,各DEHP处理组卵巢颗粒细胞Caspase-3基因mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05),Caspase-9基因mRNA和蛋白表达水平也降低(P<0.05),同时细胞凋亡率增加(P<0.05),呈浓度依赖关系。结论 DEHP可通过激活Caspase通路而诱导大鼠卵巢颗粒细胞凋亡,进而影响卵巢功能。     

氧化应激在全氟辛烷磺酰基化合物诱导人胚胎肝细胞凋亡中的作用

目的探讨全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)致人胚胎肝(L-02)细胞凋亡的作用及其机制。方法将处于对数生长期的L-02细胞分别暴露于终浓度为0(对照)、50、100、150、200μmol/L的PFOS溶液培养24 h。采用MTT法检测细胞活性,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,并测定细胞线粒体内活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平及线粒体膜电位,采用q RT-PCR法检测凋亡相关基因caspase-3、caspase-9、bax、bcl-2 m RNA的表达水平。结果与对照组比较,150、200μmol/L PFOS染毒L-02细胞的存活率均降低,而100、150、200μmol/L PFOS染毒组L-02细胞的凋亡率均增加,差异均有统计学意义(P0.05);且随着PFOS染毒浓度的升高,L-02细胞的存活率呈下降趋势,而凋亡率呈上升趋势。与对照组比较,各浓度PFOS染毒组L-02细胞内ROS和MDA水平均增加,而各浓度PFOS染毒组L-02细胞内SOD水平和100、150、200μmol/L PFOS染毒组L-02细胞内GSH水平和线粒体膜电位均较低,差异均有统计学意义(P0.05);且随着PFOS染毒浓度的升高,L-02细胞内ROS和MDA水平均呈上升趋势,而SOD、GSH水平和线粒体膜电位均呈下降趋势。与对照组比较,各浓度PFOS染毒组L-02细胞中caspase-3、caspase-9、Bax m RNA的表达水平均较高,而bcl-2、bcl-2/bax值均较低,除50μmol/L PFOS染毒组caspase-9外,差异均有统计学意义(P0.05﹚。结论在本实验剂量下,PFOS暴露可引起L-02细胞凋亡,其机制与PFOS诱导的氧化损伤和线粒体凋亡途径有关。     

二甲基甲酰胺致人肝细胞凋亡及其对Bcl-2及Bax和Caspase-3表达的影响

目的 初步探讨二甲基甲酰胺(DMF)对正常成人肝细胞的致凋亡作用和对Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响.方法 以终浓度为0、50、100、150、200mmol/L的DMF作用于正常成人肝细胞12 h后,应用流式细胞术和western blotting法检测细胞凋亡率及Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的变化.结果 与阴性对照组比较,各DMF剂量组凋亡率明显上升,差异有统计学意义(P＜0.01).随着染毒剂量的增加,肝细胞凋亡率上升,呈现剂量-反应关系.且染毒后随着DMF剂量的增加,Bcl-2表达水平下降,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组比较,Bax 表达水平无明显变化,Bcl-2/Bax比值随着DMF剂量增加而下降,200mmol/L剂量组与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).在DMF150、200mmol/L剂量组可见到Caspase-3切割活化.结论 DMF可诱导肝细胞发生凋亡,其机制可能与Bcl-2/Bax比值表达下调、Caspase-3发生切割活化有关.     

牛磺酸对苯并(a)芘致L-02细胞损伤保护作用

目的 研究牛磺酸对苯并(a)芘(B(a)P)致人胚肝细胞(L-02细胞)染色体损伤的保护作用.方法 以L-02细胞为靶细胞,按完全随机设计分成5组:(1)空白对照组;(2)溶剂对照组;(3)B(a)P染毒组:设12.5,25,50μmol/L3个剂量染毒细胞;(4)牛磺酸组:设1.0,2.0,4.Ommol/L3个浓度,加入培养体系后继续培养24h;(5)牛磺酸预防组:L-02细胞先以3个不同浓度的牛磺酸预处理24h,再加入25μmol/L的B(a)P培养24h.各组均设3个平行样.收获细胞后用微核实验检测染色体损伤,计算微核率和核分裂指数.结果 牛磺酸单独作用于L-02细胞时,与空白对照组比较,中、高浓度牛磺酸诱导的微核率降低,核分裂指数增高,差异有统计学意义.从低到高3个剂量B(a)P单独染毒L-02细胞诱导的微核率为(34.67±2.52),(45.33±4.16),(60.00±7.21)%.核分裂指数分别为1.326±0.034,1.228±0.006,1.148±0.012,与溶剂对照组比较微核率升高,核分裂指数降低,差异有统计学意义,且两者均呈明显的剂量-反应关系.低、中、高浓度牛磺酸预防组诱导的微核率对应为(30.33±3.51),(25.67±1.53)和(23.00±1.00)%.均比单纯25μmol/LB(a)P染毒组诱导的微核率降低,差异有统计学意义.低、中、高浓度牛磺酸预防组对应的核分裂指数为1.455±0.011,1.474±0.015和1.1492±0.013,比单纯25μmol/L B(a)P染毒诱导的核分裂指数高,差异有统计学意义,且两者均呈剂量-反应关系.结论 B(a)P能诱导肝细胞染色体损伤,且存在明显的剂量-反应关系;牛磺酸预处理对B(a)P引起的肝细胞毒性具有明显保护作用.     

NaAsO2对L-02肝细胞氧化应激性损伤及SOD1、AUF1表达影响

目的 观察不同剂量亚砷酸钠（NaAsO2）对L-02肝细胞氧化应激性损伤作用及超氧化物歧化酶1（SOD1）、AU 碱基富集元件RNA 结合因子1（AUF1）表达影响。方法 用0、10、20、40μmol/L NaAsO2分别处理L-02肝细胞24小时，化学比色法检测谷胱甘肽巯基转移酶（GST）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）活力及总胆汁酸（TBA）含量和SOD1、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性；荧光探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯检测细胞内活性氧族（ROS）相对荧光密度；实时荧光定量PCR和Western Blotting分别检测SOD1和AUF1转录和蛋白表达。结果 （1）与对照组比较，20、40μmol/L NaAsO2组GST活性和TBA含量均升高（P<0.05）；10、20、40μmol/L NaAsO2组γ-GT活性也升高（P<0.05）。（2）与对照组比较，20、40 μmol/L NaAsO2组SOD1活性均下降（P<0.05）；GPx活性仅在10μmol/L升高（P<0.05）；细胞内ROS先降低后升高（P<0.05）。（3）与对照组比较，20和40μmol/L NaAsO2组AUF1和SOD1 mRNA表达均升高（P<0.05），AUF1蛋白表达先升高后降低（P<0.05）；10、20μmol/L NaAsO2组SOD1蛋白表达升高（P<0.05），但40μmol/L NaAsO2组SOD1蛋白表达有降低趋势。结论 NaAsO2对L-02肝细胞产生氧化应激性损伤，其机制可能是NaAsO2通过降低AUF1的蛋白表达降低，从转录后调控降低了SOD1 mRNA的稳定性而使其蛋白表达和酶活力降低。     

亚砷酸钠对L-02肝细胞氧化应激及PSMB5、SOD1表达的影响

目的 观察不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)对L - 02肝细胞氧化应激及20S蛋白酶体β5亚基（20S proteasome β5 subunit,PSMB5）、超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1,SOD1）mRNA和蛋白表达的影响。方法 用不同剂量的NaAs02分别处理L - O2肝细胞24 h,用比色法检测氧化应激指标超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ,SOD）、SOD1 、谷胱甘肽过氧化物(glutathione peroxidase,GSH - Px)活力、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量;实时荧光定量PCR 法及蛋白免疫印迹法分别检测PSMB5、SOD1的mRNA及蛋白表达情况。结果 （1）与对照组比较,随着砷染毒剂量的增加,细胞内的SOD活力逐渐降低,SOD1、GSH - Px活力、MDA含量均先上升后下降（P＜0.05）。（2）与对照组比较,各染砷组PSMB5 和SOD1 mRNA水平均逐渐上升（P＜0.05或P＜0.01）。（3）与对照组比较,各染砷组PSMB5蛋白表达均降低（P＜0.01）;而10、20 μmol／L NaAsO2组SOD1蛋白表达逐渐上升,40 μmol／LNaAsO2组SOD1蛋白表达降低（P＜0.05）。结论 NaAs02可能通过影响PSMB5的转录后表达使其蛋白表达降低,同时可降低SOD1蛋白表达及其酶活力导致氧化应激而损伤机体。     

脑源性神经营养因子对皮质酮诱导新生大鼠海马神经元凋亡的保护作用

目的 探讨脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)对皮质酮诱导新生大鼠海马神经元凋亡的保护作用。 方法 原代培养新生大鼠海马神经元,并分成对照组、皮质酮组、皮质酮+BDNF组,皮质酮造模浓度为100 μM,分别采用浓度为0.1、1、10、25、50、100 ng/ml的BDNF干预,造模及干预时间均为24 h。CCK8法测定细胞活力,分析BDNF的最佳作用浓度,流式细胞术和 Hoechst荧光染色检测细胞的凋亡情况,免疫印迹(Western-blotting)法检测细胞Caspase-3、Caspase-9的表达水平。 结果 与对照组比较,皮质酮组神经元凋亡率由(10.7±1.2)%上升为(33.9±3.5)%(t=18.707,P<0.01),胞体透亮,部分细胞核碎裂,凋亡特征明显,Caspase-3、Caspase-9表达显著上调(t₁=27.098,P₁＜0.01;t₂=24.311,P₂＜0.01);BDNF作用后,细胞活力显著上升,在浓度为1 ng/ml时与皮质酮组比较差异有统计学意义(t=3.562,P＜0.05),分析得出BDNF最佳浓度为48 ng/ml;BDNF(48 ng/ml)干预完成后,细胞凋亡率较皮质酮组下降至(18.7±2.1)%,差异有统计学意义(t=11.478,P＜0.01),细胞形态基本恢复正常,Caspase-3、Caspase-9表达明显下调(t₁=17.341,P₁=0.002;t₂=14.993,P₂=0.005)。 结论 BDNF能有效拮抗皮质酮诱导的海马神经元凋亡,保护神经元细胞。     

MG-132对溴氰菊酯致大鼠海马细胞凋亡的保护作用

目的 研究蛋白酶体抑制剂MG-132对拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯(deltamethfin,DM)致大鼠海马细胞凋亡的保护作用.方法 雄性Wistar大鼠40只,随机分为4组,每组10只.对照组(1 ml/kg橄榄油),DM组(12.5 mg/kg DM),MG-132+DM组(0.5 mg/kg MG-132处理2 h后再以DM 12.5mg/kg染毒),MG-132(0.5 mg/kg MG-132)组,以腹腔注射方式分别给予染毒处理.DM染毒24 h后大鼠断头取海马,流式细胞术检测细胞凋亡率.免疫印迹(Western bloting)法检测bcl-2蛋白的含量及酶标仪检测casptme-3活力.结果 MG-132+DM组海马细胞凋亡率(27.29%+2.41%)明显低于DM组(19.94%±2.07%),差异有统计学意义(P<0.05).DM组bcl-2蛋白表达的灰度值为0.43±0.06,MG-132+DM组bcl-2表达的灰度值为2.01±0.23,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01).DM组海马细胞cas-pase-3活力为5.26±0.43,MG-132+DM组为4.55±0.46,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在该实验条件下,MG-132对DM引起的大鼠海马细胞凋亡有一定保护作用,泛素-蛋白酶体途径可能参与DM诱发大鼠海马细胞凋亡的过程.     

双(对氯苯基)二氯乙烯与β-六氯化苯对大鼠睾丸支持细胞凋亡的影响

目的 探讨双(对氯苯基)二氯乙烯[1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene,p,p'-DDE]、β-六氯化苯(β-benzenehexachloride,β-BHC)及其联合作用对大鼠睾丸支持细胞凋亡半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)途径的影响及其作用机制.方法 以不同浓度的p,p'-DDE、β-BHC(分别为10、30、50 μmol/L)及其联合(10 μmol/L p,p'-DDE+10 μmol/L β-BHC,30 μmol/L p,p'-DDE+30 μmol/L β-BHC,50 μmoL/L p,p'-DDE+50 μmol/L β-BHC)处理大鼠睾丸支持细胞24 h,设Caspase-3抑制剂组(先用100 μmol/L Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO处理支持细胞2 h,再用50 μmol/L p,p'-DDE+50 μmol/L β-BHC联合处理),采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定支持细胞的活性,吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双重荧光染色测定支持细胞的凋亡率,RT-PCR法检测Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9 mRNA表达量的变化.结果 10、30、50、70 μmol/L p,p'-DDE组吸光度(A值)分别为0.498±0.039、0.481±0.065、0.397±0.032和0.286±0.049,相同浓度β-BHC组A值分别为0.518±0.103、0.490±0.060、0.454±0.054和0.302±0.030,10、30、50 μmol/L p,p'-DDE与β-BHC联合组A值分别为0.483±0.048、0.473±0.058和0.337±0.052,50 μmol/L浓度组与对照组比较,A值降低,差异有统计学意义(t值分别为4.599、2.716、6.537,P＜0.05).AO/EB双重荧光染色分析结果显示,10、30、50 μmol/L各染毒组的支持细胞凋亡率明显升高,与溶剂对照组(9.83±0.95)%、Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO组(15.60±2.74)%比较,p,p'-DDE处理组分别为(23.73±2.24)%、(30.03±2.84)%和(38.04±4.98)%,β-BHC处理组分别为(24.42±3.53)%、(30.64±1.06)%和(39.88±0.17)%,联合处理组分别为(37.08±1.71)%、(42.18±3.32)%和(41.25±3.36)%.逆转录(RT)-PCR结果表明,Caspase-3、Cagpase-8及Caspase-9 mRNA表达量随着p,p'-DDE、β-BHC及其联合浓度的增加而增加.结论 p,p'-DDE、β-BHC及其联合作用可通过激活启动Caspase-8和Caspage-9,进而激活下游效应Caspase-3引起支持细胞凋亡.     

石蒜碱诱导结肠癌HT-29 细胞凋亡机制研究

目的 探讨石蒜碱诱导结肠癌HT-29 细胞凋亡及机制。方法 不同浓度的石蒜碱处理体外结肠癌HT-29 细胞,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪和Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡;Real time PCR实验检测Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA水平;Western blot方法检测Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的水平。结果 48h时石蒜碱对HT-29 细胞IC50为8.878μmol/L;与对照组比较,1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L石蒜碱能诱导细胞凋亡(P<0.05),上调Caspase-3、Bax的mRNA和Caspase-3、Bax蛋白水平,下调Bcl-2的mRNA和Bcl-2蛋白水平,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 石蒜碱能通过调节Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达水平,抑制结肠癌HT-29 细胞生长,诱导细胞凋亡,具有明显的体内抗肿瘤作用。     

砷诱导L-02细胞的耐砷性及细胞内MDR1、GST-π基因的表达

[目的]观察砷诱导人胚肝（L-02）细胞耐砷性及细胞内耐砷性多药耐药基因1（MDR1）、谷胱甘肽-s-转移酶7【（GST-π）的表达水平。[方法]应用噻唑蓝（MTY）比色法检测浓度分别为0、1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mmol／L的亚砷酸钠（NaAs02）作用24h后,对L-02细胞生存率的影响。并选择细胞生存率在90％～95％时的NaAsO2浓度为诱导浓度对细胞进行培养,以不加砷诱导的L-02细胞为对照,两组细胞在相同条件下培养6周,利用MTY法每周观察细胞生存率并计算半致死浓度（LC50）来反映细胞对砷的耐受性改变;利用real-timePCR检测培养6周后的细胞内MDRl、GST．叮rmRNA的表达情况;免疫组化法（SABC法）检测细胞内P-糖蛋白（P-gp）、GST-x蛋白的表达情况。利用MTr法和石墨炉原子吸收光谱法检测浓度为10mmol／L的NaAsOz作用24h后细胞生存率和细胞内总砷浓度以观察两组细胞在再次大剂量急性砷中毒中的反应。[结果]经NaAsO：诱导6周后,诱导细胞LC50和生存率都明显高于正常细胞（P〈0．001）;诱导细胞MDR1、GST-1TmRNA的表达明显较正常细胞高（P〈0．001）;与对照组比较,诱导细胞P-gp、GST-π蛋白表达明显增高（P〈0．001）;在再次急性砷中毒试验中,诱导细胞生存率明显高于正常细胞（P〈0．001）,诱导细胞内总砷浓度较正常细胞低（P〈0．001）。[结论]L-02细胞具有可诱导的对砷的耐受现象,其耐砷性可能与MDR1、GST-π基因高表达有关。     

shRNA-聚束蛋白基因对人结肠癌细胞SW-480侵袭和凋亡影响的实验研究

目的探究shRNA-Fascin基因对人结肠癌细胞SW-480侵袭和凋亡影响。方法利用慢病毒转染技术,构建Fascin的shRNA干扰表达载体,RT-qPCR和Western blot等方法检测Fascin基因和凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达。Transwell试剂盒检测人结肠癌细胞的侵袭,以及AV-PI试剂盒检测人结肠癌细胞的凋亡。结果shRNA-Fascin载体慢病毒转染效率为95%以上。实验组SW-480中Caspase-3和Caspase-9的mRNA的相对表达量明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组SW-480中Caspase-3和Caspase-9的蛋白相对表达水平明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组SW-480细胞侵袭能力明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组SW-480细胞的凋亡率明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论shRNA-Fascin可以明显的抑制人结肠癌细胞SW-480的侵袭,促进人结肠癌细胞SW-480的凋亡。     

姜黄素对H2O2诱导A549细胞氧化损伤的保护作用及机制研究

目的 探究姜黄素对H2O2诱导A549细胞氧化损伤的保护作用及其作用机制。方法 使用不同浓度的H2O2对A549细胞进行不同时长的刺激,使用CCK-8法筛选A549细胞存活率约为50%时的H2O2浓度及刺激时间作为建模条件;通过Hoechst 33258染色及Western blot对模型进行验证;实验分为模型组（Model）、VC组（VC）和姜黄素组（CCM）;采用流式细胞术对细胞凋亡情况进行检测,采用Western blot法对凋亡及氧化应激信号通路相关蛋白进行检测。结果 CCK-8实验结果显示,采用600μmol/L的H2O2对A549细胞进行24h刺激,其存活率为56.45±5.33%,Hoechst 33258染色及Western blot结果证实了模型的可靠性。流式细胞术结果显示,VC组和CCM组细胞的凋亡率与Model组相比均降低（P＜0.05,P＜0.01）,且CCM组降低更加明显（P＜0.01）。Western blot结果显示,与Model组相比,VC组和CCM组Bax、Caspase-3和Keap1表达降低,Bcl-2和Nrf2表达升高,且CCM组较VC组改变更加明显,差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论 姜黄素对H2O2诱导的A549细胞急性损伤具有保护作用,可能与其激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路,抑制细胞凋亡有关。     

利用蛋白质组学技术研究三氯乙烯刺激肝细胞后蛋白质差异表达

目的应用双向电泳及串联质谱技术，研究不同剂量三氯乙烯（TCE）诱导L-02肝细胞蛋白质表达谱的差异。方法L-02肝细胞分别用不同剂量TCE和溶剂对照（二甲亚砜）处理后，提取细胞总蛋白，双向凝胶电泳分离蛋白质组成分，银染显色，经ImageMaster 2D Platinum 5．0软件分组分析比较四组图谱，并对差异蛋白斑点进行基质辅助激光解吸／电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF-MS）分析鉴定。结果得出差异较明显的蛋白质斑点15个，不同剂量TCE刺激后表达分别上调、下调或消失，提示TCE可引起肝细胞蛋白表达发生改变。通过质谱鉴定和IPI human数据库检索，鉴定了其中9个TCE诱导L02肝细胞相关的蛋白质。结论这些结果为深入研究TCE毒作用相关的蛋白质及TCE毒作用的分子标志物提供依据，并为阐明TCE毒作用的分子机制提供线索。