人舌鳞状细胞癌顺铂耐药细胞株CAL-27/DDP的建立及其生物学评价

目的: 建立人舌鳞状细胞癌(舌鳞癌)顺铂耐药细胞株CAL-27/DDP,探讨其顺铂耐药机制。方法: 采用顺铂浓度梯度法对人舌鳞癌CAL-27细胞株进行诱导,将细胞分为CAL-27组和CAL-27/DDP组。CAL-27组细胞株用普通培养液培养,CAL-27/DDP组细胞株用含有不同浓度顺铂的培养液培养,经过12个月的诱导形成生长良好的耐药细胞系株CAL-27/DDP。采用倒置显微镜观察细胞株形态表现;MTT法检测细胞株的半数抑制浓度(IC₅₀)和耐药指数(RI);流式细胞术检测细胞株的细胞周期;RT-PCR法检测细胞株中多药耐药基因(MDR1)mRNA的相对表达水平;Western blotting法检测细胞株P糖蛋白(P-gp)的相对表达水平。结果: CAL-27/DDP组细胞株在一段时间内能在普通培养液中稳定生长,并维持其形态和耐药性状。与CAL-27组细胞株比较,CAL-27/DDP细胞略增大,细胞中出现颗粒和"空泡"样变,胞浆丰富,倍增时间延长(P<0.01),RI为18.09±0.30。与CAL-27组比较,CAL-27/DDP组G₁期和G₂期细胞比例减少,S期细胞比例升高,CAL-27/DDP组细胞株中MDR1mRNA和P-gp相对表达水平升高(P<0.01)。结论: 本研究建立了人舌鳞癌顺铂耐药细胞株CAL-27/DDP,其耐药机制与CAL-27/DDP细胞株中MDR1和P-gp的表达水平上调有关联。     

抑制miR-23a表达增强卵巢癌顺铂敏感性的分子机制

目的分析抑制miR-23a表达后,耐药卵巢癌A2780细胞对化疗药物顺铂的敏感性变化及其分子机制。方法选择顺铂耐
药卵巢癌A2780细胞株为研究样本,并分为两组,其中对照组仅加入顺铂,实验组加入顺铂及antagomir-23a。应用MTT法检测
antagomir-23a抑制miR-23a并经顺铂处理后细胞增殖抑制率;应用流式细胞仪分析细胞周期分布情况;应用Hoechst33258染色
分析细胞凋亡形态学变化;应用Western blot法分析耐药糖蛋白P-gp的表达变化。结果抑制miR-23a并经顺铂处理后,细胞增
殖抑制率显著上升（P<0.01）,顺铂中效浓度（IC50）为17.89 μmol/L,比对照组IC50 110.18 μmol/L降低了83.76%（P<0.01）,细胞被
阻滞于G0/G1期且凋亡率增加（P<0.01）;Hoechst33258染色见细胞核浓缩、染色增强。Western blot检测提示细胞P-gp蛋白表
达随着顺铂浓度加大而逐渐减低（P<0.01）。结论抑制耐药卵巢癌A2780细胞内miR-23a表达后,细胞对顺铂的敏感性显著增
加,这可能miR-23a靶基因负性调控因素得以缓解,并由此引发P-gp蛋白表达受抑有关。
     

氯喹逆转人鼻咽癌细胞HNE1/DDP的耐药作用

目的探究氯喹对人鼻咽耐药细胞的逆转耐药作用及其机制。方法MTT检测不同浓度的顺铂（2, 4, 8, 16, 32 μmol·L-1）
以及不同浓度的氯喹（5, 10, 20, 40, 80 μmol·L-1）处理HNE1细胞,HNE1/DDP细胞48 h 对细胞增殖的影响;q-PCR方法检测5,
10 μmol·L-1 氯喹处理HNE1/DDP后的多药耐药基因MDR1 mRNA的表达;PI单染方法检测氯喹（10, 20 μmol·L-1）处理HNE1/
DDP后细胞凋亡率;采用Western blot 方法检测氯喹处理HNE1/DDP后的P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）的表达。结果MTT
结果显示,不同浓度的氯喹（5, 10, 20, 40, 80 μmol·L-1）对细胞具有明显的抑制作用,并且呈浓度依赖性;q-PCR结果表明,氯喹
作用细胞后能明显降低MDR1 mRNA水平;PI 结果显示,氯喹作用细胞后,细胞的凋亡率明显增加;通过western blot 实验表
明,氯喹能明显降低MDR1和P-gp 蛋白水平。结论氯喹能逆转人鼻咽癌细胞HNE1/DDP的耐药,其机制可能与下调MDR1
mRNA表达及抑制P-gp的功能与表达有关。
     

miR-130a对卵巢癌A2780细胞顺铂耐药性的影响及其机制的研究

目的 探讨miR-130a表达的改变对卵巢癌A2780细胞（包括顺铂敏感细胞株A2780s和耐药株A2780/DDP）顺铂耐药性的影响及其机制。方法 将A2780s、A2780/DDP细胞各分为4组,分别予以单纯脂质体处理、转染阴性对照小RNA、miR-130a模拟物(可使miR-130a表达增加)、miR-130a抑制物(降低miR-130a表达)处理,MTS法检测各组细胞增殖情况和对顺铂的耐药性,RT-PCR、Western blot 法检测未处理和处理后细胞多耐药基因1（MDR1）、抑癌基因（PTEN） mRNA和蛋白的表达。结果 A2780/DDP细胞MDR1 mRNA和MDR1的表达产物P-糖蛋白(P-gp）的表达高于A2780s细胞（PMDR1 mRNA和P-gp表达水平;下调miR-130a的表达,同样不影响细胞的增殖, 但增强其对顺铂的敏感性, 并可降低MDR1 mRNA和P-gp的表达,提高PTEN蛋白的表达。结论 miR-130a抑制物通过上调PTEN蛋白和下调P-gp的表达来逆转卵巢癌A2780细胞系对顺铂的耐药性。miR-130a有望成为耐药性卵巢癌基因治疗的新靶点。     

顺铂下调铜离子转运蛋白1诱导人食管鳞癌细胞EC109耐药

摘要：目的研究人食管鳞癌细胞顺铂耐药性产生的机制。方法MTT法检测顺铂对耐药细胞EC109/CDDP及其亲代细
胞EC109的细胞毒作用。电感耦合等离子体质谱检测细胞内顺铂的蓄积和Pt-DNA加合物的形成。Western blotting检
测人多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase, PARP）的剪切和铜离子转运蛋白1（copper transporter 1,
CTR1）的蛋白表达。结果顺铂耐药细胞株EC109/CDDP较其亲代细胞EC109对顺铂引起的细胞毒作用和凋亡敏感性
下降,细胞内顺铂蓄积和Pt-DNA加合物的形成减少,并且CTR1蛋白表达水平降低。结论顺铂通过降低细胞CTR1蛋白
表达抑制顺铂进入细胞,导致细胞耐药性的产生。     

Connexin43蛋白对耐顺铂睾丸癌I-10/DDP细胞自噬的抑制作用

目的探讨缝隙连接蛋白（Cx43）蛋白对耐顺铂睾丸癌I-10/DDP细胞自噬的作用。方法免疫印迹法检测Cx43蛋白在睾 丸癌I-10细胞与耐顺铂睾丸癌I-10/DDP细胞中的表达水平;实验分为转染试剂对照组（Mock 组）、阴性对照组（NC组）、过表达 组（mCx43 组）,过表达（mCx43）Cx43 基因后,通过免疫印迹法检测Cx43 蛋白确定转染效率,自噬相关蛋白LC3 和p62 水平。 mCherry-GFP-LC3B转染法和透射电镜分析Cx43基因过表达后耐顺铂睾丸癌I-10/DDP细胞自噬水平。结果与I-10细胞相 比,I-10/DDP细胞中Cx43的表达量明显降低（P<0.01）;过表达Cx43基因后,与NC组相比,mCx43组中自噬相关蛋白LC3-II表 达降低（P<0.01）,p62表达升高（P<0.05）。使用mCherry-GFP-LC3B转染法和透射电镜观察自噬水平,与NC组相比,mCx43组 中细胞自噬体数量降低。结论Cx43抑制耐顺铂睾丸癌I-10/DDP细胞自噬。     

人鼻咽癌顺铂耐药细胞株的建立及其生物学特性

目的建立人鼻咽癌顺铂耐药细胞株并探讨其生物学特性。方法采用药物大剂量冲击和逐渐增加剂量相结合的方法建立人鼻咽癌顺铂耐药细胞株CNE2/DDP,MTS法检测顺铂对CNE2和CNE2/DDP的半数抑制浓度(IC50)和耐药系数(RI),观察CNE2、CNE2/DDP细胞形态,绘制细胞生长曲线及计算细胞倍增时间,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况及Western blot法检测细胞MDR1表达水平。结果 MTS法检测DDP对CNE2的IC50为1.28μg/mL,CNE2/DDP的IC50为20.49μg/mL,RI达16。CNE2细胞形态饱满,长满时呈铺路石样紧密排列,CNE2/DDP细胞呈长梭形,CNE2/DDP较敏感细胞CNE2生长缓慢,倍增时间为39.0 h,流式细胞仪检测显示当DDP浓度大于1.0μg/mL时,CNE2的凋亡率明显高于CNE2/DDP细胞(P<0.05);进一步研究显示CNE2/DDP细胞中MDR1蛋白表达水平明显高于CNE2细胞。结论成功建立了稳定的人鼻咽癌顺铂耐药细胞株CNE2/DDP,且耐药性能显著,可作为深入研究鼻咽癌顺铂耐药机制较为理想的模型。     

腺病毒介导hCTR1转染用于治疗顺铂耐受宫颈癌的基础研究

目的 诱导培养对顺铂耐药的人宫颈癌细胞株,并进一步研究针对宫颈癌细胞耐药的机制和相应的治疗方法。 方法 采用浓度梯度递增法使用顺铂处理人宫颈癌细胞C-33A,诱导出顺铂耐药细胞株C-33A/cis后,通过Western blot检测铜离子转运蛋白（copper transporter 1,CTR1）的表达改变,使用顺铂耐药细胞株C-33A/cis建立肿瘤皮下荷瘤模型,使用转染有hCTR1基因的腺病毒注射液（ad-hCTR1）并联合顺铂给药,观测肿瘤体积的改变,并在最后一次注射10 d后处死小鼠,通过免疫组化方法检测肿瘤组织中CTR1的表达。 结果 浓度梯度递增法诱导出的耐药细胞株C-33A/cis较亲代细胞C-33A对顺铂引起的细胞毒性敏感性下降,顺铂的半致死剂量浓度（IC₅₀）由（1.86±0.08）μmol/L提升至（8.11±0.21）μmol/L。Western blot结果显示耐药细胞C-33A/cis中CTR1的表达降低。利用顺铂耐药细胞株C-33A/cis建立的皮下瘤模型,在给予ad-hCTR1后,肿瘤组织内可检测到CTR1表达增高;对荷瘤鼠给予腺病毒转染CTR1联合顺铂给药后,肿瘤体积增长受到抑制。 结论 腺病毒转染CTR1联合顺铂给药可能提高耐药性宫颈癌的治疗效果。     

两种人骨肉瘤 U2OS 细胞阿霉素耐药株的比较

目的研究不同方式建立的人骨肉瘤 U2OS 细胞阿霉素耐药株的生物学特性及其耐药机制.方法采用大剂量间隙作用、浓度梯度递增间隙作用建立 U2OS 阿霉素耐药株 U2OS/ADM1,U2OS/ADM2,光镜及透射电镜下观察细胞形态变化;MTT 法测定其耐药指数、药物敏感性,绘制生长曲线计算倍增时间;罗丹明外排实验检测 P-糖蛋白(P-gp)泵功能;RT-PCR 检测多药耐药基因1(MDR1)mRNA、多药耐药相关蛋白1(MRP1)mR-NA 的表达.结果 U2OS/ADM1,U2OS/ADM2的耐药指数分别为79.63和91.06,对紫杉醇、顺铂有交叉耐药;细胞倍增时间延长(P <0.01);耐药株细胞线粒体丰富,粗面内质网及游离核糖体增多;细胞内罗丹明蓄积量低于亲本细胞(P <0.01),两种耐药株之间无明显差异(P >0.05);MDR1mRNA,MRP1mRNA 表达均高于亲本细胞(P <0.05),MDR1mRNA 表达两种耐药株间无明显差异(P >0.05),U2OS/ADM1的 MRP1mRNA 表达低于U2OS /ADM2(P <0.05).结论两种耐药株均可产生 MDR,耐药机制可能与 MDR1,MRP1过表达有关;不同建立方式存在一定差异,浓度梯度递增间隙作用方式更容易产生耐药.     

靶向MDR1基因siRNA逆转HepG2/ADM细胞耐药性的研究

目的 采用RNA干扰技术逆转人类肝癌细胞系/阿霉素(human hepatocellular liver carcinoma cell line/adriamycin,HepG2/ADM)细胞中多耐药基因,探讨该基因能否有效地抑制多耐药基因(multidrug resistance gene,MDR1)及其编码的糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达,并检测对HepG2/ADM耐药表型的逆转效果.方法 采用药物大剂量冲击法建立HepG2/ADM耐药模型,构建靶向MDR1的小干扰RNA表达载体,并转染到HepG2/ADM细胞中,应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测基因转染前后MDR1 mRNA表达水平的变化,Western-blot检测各组细胞P-gp蛋白表达的变化,用噻唑蓝法检测各组细胞对阿霉素、顺铂、长春新碱和氟尿嘧啶等药物的敏感性.结果 HepG2/ADM细胞系不仅对阿霉素耐药,而且对其他化疗药也有抗性,呈现多药耐药特性;重组质粒鉴定结果表明针对MDR1的小干扰RNA表达载体成功构建;与对照组比较,转入细胞后MDR1 mRNA水平明显下降,P-gp蛋白表达明显降低;转入细胞后HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性明显提高,部分逆转其耐药性.结论 靶向MDR1的小干扰RNA可显著抑制HepG2/ADM细胞中MDR1基因和P-gp蛋白的表达,逆转P-gp介导的HepG2/ADM细胞的耐药性.     

下调Pannexin2通道能增强顺铂诱导睾丸癌（I-10）细胞凋亡

目的 探讨Pannexin2（Panx-2）蛋白在睾丸癌细胞中的表达水平以及干扰Panx-2表达对顺铂诱导睾丸癌（I-10）细胞凋亡的影响。方法 免疫印迹法Panx-2蛋白在睾丸癌细胞中的表达水平；以睾丸癌I-10细胞株为研究对象，实验分为转染试剂对照组（mork组）、阴性对照质粒组（NC组）、干扰Panx-2组（shRNA1质粒组和shRNA2质粒组），采用免疫印迹法验证Panx-2的表达；在转染细胞中添加16 μmol/L的顺铂诱导细胞死亡，通过MTT法分别检测细胞在24、48、72 h的存活率，集落克隆法检测细胞的集落形成能力；在顺铂（16 μmol/L）处理8 h后，采用AnnexinV/PI双染法检测细胞的早期凋亡；在顺铂（16 μmol/L）作用24 h后， 免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白caspase 3、Bcl-2和Bax的表达水平。结果 与I-10细胞和Tcam-2细胞相比，I-10/DDP细胞（P< 0.001）和Tcam-2/DDP细胞（P<0.01）中Panx-2的表达显著增加；干扰Panx-2基因后，免疫印迹结果显示，与NC组相比，shRNA1和shRNA2组中Panx-2的表达量下降（P<0.05）；MTT法显示shRNA1和shRNA2组细胞的存活率均低于NC组（P<0.001）；在含顺铂培养基的培养下，集落克隆法显示shRNA1和shRNA2组细胞的集落形成能力低于NC组（P<0.001）；AnnexinV/PI双染法显示shRNA1和shRNA2组的早期凋亡率（P<0.01）均低于NC组；免疫印迹结果显示，与NC组相比，shRNA1和shRNA2组中凋亡相关蛋白caspase 3表达升高（P<0.05），Bcl-2表达降低（P<0.01），Bax表达升高（P<0.05）。结论 下调Pannexin2通道能增强顺铂诱导睾丸癌（I-10）细胞凋亡。     

MDR1 and MDR3 Genes and Drug Resistance to Cisplatin of Ovarian Cancer Cells

To investigate the relationship between MDR1 and MDR3 gene and drug resistance to cisplatin of ovarian cancer cells. Two siRNAs (MDR1, MDR3) which specifically targeted MDR1 and MDR3 genes were transfered into A2780/DDP cells. Then double staining with Annexin- V-FITC/PI was used to detect cell apoptosis by the flow cytometry (FCM). A2780/DDP cell viability was determined by MTT. MDR1 and MDR3 mRNA were assessed by RT-PCR. Caspase-3 protein was detected by Western blotting. Transfection of MDR1 and MDR3 siRNA into A2780/DDP cells failed to reverse the drug-resistance of A2780/DDP cells to cisplatin (P>0.05). No significant differ- ence in the apoptosis efficiency was observed between the MDR1 and MDR3 siRNA, pSuppressor- Neo vector transfection cells and untreated cells (P>0.05). In the presence of cisplatin of different concentrations, the viability of A2780/DDP cells was not significantly decreased after the transfection. No changes in MDR1 and MDR3 mRNA were found in MDR1 and MDR3 siRNA-transfected A2780/DDP cells. As compared with pSuppressorNeo and untreated groups, no significant difference existed in the expression of MDR1 and MDR3 mRNA (P>0.05). The expression of caspase-3 protein in MDR1 and MDR3 siRNA transfected A2780/DDP cells was not significantly increased. It is con- cluded that multidrug resistance induced by cisplatin in ovarian carcinoma cell lines is not due to overexpression of MDR1 and MDR3 gene. The drug resistance of ovarian carcinoma cells to cisplatin is not mediated by P-glycoprotein.     

黄芩苷对白血病细胞耐药株逆转耐药效果及机制研究

目的:观察黄芩苷对白血病耐药株细胞的耐药逆转作用,并初步探讨其可能的机制。方法:MTT法检测阿霉素及黄芩苷对白血病亲本细胞及耐药株细胞的抑制率,通过计算阿霉素对耐药株细胞及亲本细胞的半数抑制浓度(IC50)评价耐药倍数,通过阿霉素与黄芩苷联用的IC50评价黄芩苷的逆转作用,流式细胞计数法检测黄芩苷作用后对耐药细胞内阿霉素药物蓄积的影响,RT-PCR检测黄芩苷对耐药细胞中多药耐药相关基因MDR1、MRP1以及LRP1表达的影响。结果:耐药细胞株的耐药倍数为17.384倍,黄芩苷10μg/ml和20μg/ml对白血病耐药株的逆转倍数分别为4.230和7.812,相对逆转率分别为0.81和0.93,黄芩苷作用后耐药株细胞内阿霉素蓄积明显增加,MDR1基因表达显著下降。结论:黄芩苷对白血病耐药细胞株具有显著的逆转作用,其机制可能与下调了细胞内的MDR1基因表达进而抑制P糖蛋白对阿霉素的泵出有关。     

miR-130a在卵巢癌顺铂耐药细胞株中的表达及其意义

目的分析miR-130a在卵巢癌顺铂耐药细胞株中的表达,探讨miR-130a与卵巢癌对顺铂耐药的关系。方法以浓度梯度递增法构建卵巢癌耐顺铂细胞株,MTT法对耐药细胞株进行鉴定并测定耐药指数,应用荧光实时定量PCR检测并分析各细胞株中miR-130a的表达。结果成功构建卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/CIS1、A2780/CIS2和SKOV3/CIS(P<0.05),其耐药指数分别为30.2、5.3和24.5。荧光实时定量PCR结果显示miR-130a在卵巢癌耐药细胞株中存在稳定的异常高表达(P<0.05),A2780/CIS1、A2780/CIS2以及SKOV3/CIS中miR-130a表达分别较亲本细胞平均上调30.51倍、4.87倍和24.43倍。各耐药细胞中miR-130a表达上调倍数接近于各自的顺铂耐药指数。结论 miR-130a表达的上调可能与卵巢癌细胞株对顺铂的耐药性密切相关。推测抑制miR-130a的表达有助于逆转卵巢癌顺铂耐药性,miR-130a有望成为逆转卵巢癌顺铂耐药性的潜在基因治疗靶点。     

MDR1 and MDR3 genes and drug resistance to cisplatin of ovarian cancer cells

Summary To investigate the relationship between MDR1 and MDR3 gene and drug resistance to cisplatin of ovarian cancer cells. Two siRNAs (MDR1, MDR3) which specifically targeted MDR1 and MDR3 genes were transfered into A2780/DDP cells. Then double staining with Annexin-V-FITC/PI was used to detect cell apoptosis by the flow cytometry (FCM). A2780/DDP cell viability was determined by MTT. MDR1 and MDR3 mRNA were assessed by RT-PCR. Caspase-3 protein was detected by Western blotting. Transfection of MDR1 and MDR3 siRNA into A2780/DDP cells failed to reverse the drug-resistance of A2780/DDP cells to cisplatin (P>0.05). No significant difference in the apoptosis efficiency was observed between the MDR1 and MDR3 siRNA, pSuppressorNeo vector transfection cells and untreated cells (P>0.05). In the presence of cisplatin of different concentrations, the viability of A2780/DDP cells was not significantly decreased after the transfection. No changes in MDR1 and MDR3 mRNA were found in MDR1 and MDR3 siRNA-transfected A2780/DDP cells. As compared with pSuppressorNeo and untreated groups, no significant difference existed in the expression of MDR1 and MDR3 mRNA (P>0.05). The expression of caspase-3 protein in MDR1 and MDR3 siRNA transfected A2780/DDP cells was not significantly increased. It is concluded that multidrug resistance induced by cisplatin in ovarian carcinoma cell lines is not due to overexpression of MDR1 and MDR3 gene. The drug resistance of ovarian carcinoma cells to cisplatin is not mediated by P-glycoprotein.     

化疗药物对甲状腺未分化癌耐药基因表达的影响

目的:评价阿霉素和顺铂化疗药物对甲状腺未分化癌耐药相关基因MDR1和MRP1表达的影响?方法:分别用阿霉素和顺铂诱导人甲状腺未分化癌耐药细胞HTh74/DOX和HTh74/DDP?利用荧光定量RT-PCR检测耐药细胞中MDR1和MRP1的表达情况,并观察MDR1和MRP1抑制剂联合阿霉素或顺铂对耐药细胞进行干预的疗效?结果:HTh74/DOX细胞与亲代相比高表达MDR1而MRP1基因上调不明显;HTh74/DDP细胞与亲代相比高表达MRP1基因而MDR1基因上调不明显,且HTh74/DOX对顺铂缺乏交叉耐药,HTh74/DDP对阿霉素缺乏交叉耐药?MDR1和MRP1抑制剂分别能部分恢复HTh74/DOX和HTh74/DDP对阿霉素和顺铂的敏感性?结论:不同化疗药物可能上调不同ABC跨膜转运蛋白耐药相关基因而导致甲状腺未分化癌细胞耐药性增强?临床可能通过检测各种ABC跨膜转运蛋白或基因的表达量来预测不同化疗药物的疗效,并选用适当ABC跨膜转运蛋白抑制剂联合化疗药物进行个体化治疗方案的制定?     

胃癌耐药细胞株耐药谱的体外实验

观察胃癌细胞与抗肿瘤药作用后对不同药物耐的耐受情况，方法：胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１在体外分别与长春新碱（ＶＣＲ），５氟尿嘧啶（５－Ｆｕ），阿霉素（ＡＤＭ）及氨甲喋呤（ＭＴＸ）作用，获得ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，ＳＧＣ７９０１／ＡＤＭ，ＳＧＣ７９０１／５－Ｆｕ及ＳＧＣ７９０１／ＭＴＸ４个耐药细胞株。体外细胞毒性实验观察它们对ＶＣＲ，ＡＤＭ，５－Ｆｕ，ＭＴＸ，顺铂（ＣＤＤＰ）以及丝裂霉素Ｃ（ＭＭＣ）的敏