单纯疱疹病毒Ⅱ型ICP22真核表达载体的构建及其对Vero细胞活性的影响

目的构建单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染细胞蛋白22(ICP22)真核表达载体p EGFP-C2/ICP22并研究其对非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞活性的影响。方法经双酶切实验和测序验证,以Xfect为介导将构建的真核表达载体p EGFP-ICP22转染至Vero细胞,并通过反转录PCR(RT-PCR)和绿色荧光检验其在细胞中的表达,最后以MTT法检测细胞活性。结果 48 h后观察,发现转染重组质粒组细胞经RT-PCR验证有目的基因的转录,并通过荧光显微镜观察到融合蛋白表达。而空白质粒组只检测到荧光蛋白但未检测到目的基因转录本,且对照组未检测到荧光蛋白表达。转染重组质粒的细胞相对活性值为(82.39±6.44)%。结论成功构建了p EGFP-ICP22真核表达载体,实现了其在Vero中的表达,融合蛋白GFP-ICP22明显降低了细胞活性。为进一步探讨HSV-ⅡICP22的功能和HSV-Ⅱ潜伏复发机制奠定了实验基础。     

HSV 2多功能蛋白ICP27真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达

目的构建单纯疱疹病毒2型（HSV 2） 多功能蛋白感染细胞多肽27（ICP27）真核表达载体pCDNA3.0 ICP27,并检测其在非洲绿猴肾细胞（Vero）中的表达。方法提取病毒株HSV 2333 DNA,用高保真DNA聚合酶对多功能蛋白ICP27基因进行高保真扩增,用双酶切连接至真核表达载体pCDNA3.0中。pCDNA3.0 ICP27经双酶切、测序验证,并通过脂质体介导质粒瞬时转染Vero 细胞,经RT PCR和Western blot检测ICP27蛋白的表达。结果pCDNA3.0 ICP27经双酶切可切出目的片段,测序结果经比对,与基因库中的序列完全一致。转染后经RT PCR 和Western blot检测,证实转染重组质粒组有ICP27蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到ICP27的表达。结论成功构建了HSV 2 多功能蛋白ICP27真核表达载体pCDNA3.0 ICP27,并能在Vero 细胞中表达。     

核仁素过表达对顺铂诱导人骨肉瘤细胞株SaOS-2增殖抑制和凋亡的影响

目的观察C23过表达对CDP诱导人骨肉瘤细胞株SaOS-2增殖抑制和凋亡的影响。方法先构建pRSET-C23重组质粒并将其导入SaOS-2细胞;再将细胞随机分为四组：对照组、单纯用CDP组、转染空载体后再用CDP组与转染C23重组质粒后再用CDP组;用MTT法检测各组SaOS-2细胞增殖率,用Western Blot和RT-PCR方法检测各组C23、Bcl-2与Bax蛋白和mRNA的表达情况;用DAPI染色方法和流式细胞术检测各组细胞凋亡核百分率、细胞凋亡率。结果 pRSET-C23重组质粒构建成功;转染C23重组质粒后再用CDP组的增殖率与单纯用CDP组比较,升高了约16%（P〈0.01）,C23与Bcl-2的蛋白和mRNA表达均增高,但Bax表达则降低（P〈0.01）;转染C23重组质粒后再用CDP组与单纯用CDP组比较,细胞凋亡核百分率、细胞凋亡率均降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 C23过表达能抑制CDP诱导的SaOS-2细胞增殖抑制和凋亡。     

单纯疱疹Ⅱ型microRNA-H3真核过表达载体的构建及对Hela细胞活性的影响

目的人宫颈癌细胞(Hela)中表达Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)编码的microRNA-H3(miR-H3),检测该mRNA对Hela细胞活性的影响。方法 PCR扩增microRNA-H3的前体序列,将其插入到pmRmcherry(cherry)载体中,并酶切测序同时验证;重组质粒转染Hela细胞,q PCR检测microRNA的相对表达水平,转染受体细胞,并用放线菌素D(Act D)诱导凋亡,MTT法、流式细胞术和Edu染色共同检测Hela细胞活性。结果双酶切、测序表明cherry/miR-H3重组质粒构建成功,q PCR检测miR-H3大量表达,MTT法、Edu染色和流式细胞术检测表明转染重组质粒cherry/miR-H3并经诱导凋亡组细胞的活性明显比空质粒转染组和未转染组细胞活性高,具有统计学意义,而与正常细胞对照组无显著差异。结论 cherry/miR-H3真核表达载体可在Hela细胞中高效表达,并具有抗Act D诱导的细胞凋亡作用。     

Livin靶向RNA干扰对人胃癌细胞SGC7901细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Livin靶向RNA干扰对SGC7901细胞株生物学特性的影响,探索胃癌基因治疗的新途径。方法设计和构建Livin特异性的siRNA真核表达载体,转染SGC7901细胞,应用RT-PCR分析LivinmRNA的表达情况,采用MTT法检测细胞的生长状况,通过流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。结果构建真核表达载体p-siRNA1并转染SGC7901细胞后,RT-PCR结果显示2条Livin siRNA真核表达质粒均能有效抑制Livin mRNA的转录表达,干扰组细胞与未转染组细胞比较,生长受到明显抑制,凋亡率明显增加。结论成功构建了Livin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人胃癌细胞Livin mRNA表达,并抑制胃癌细胞生长,促进其凋亡。     

Notch1基因沉默对滋养细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨Notch1基因沉默后对滋养细胞增殖与凋亡生物学功能的影响。方法:构建Notch1蛋白基因干扰质粒,体外培养人早孕期胎盘绒毛膜外滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞进行转染。应用实时荧光PCR计数检测转染后Notch1 mRNA相对表达水平,CCK-8检测细胞转染后活性情况,Western blotting检测Bcl-2凋亡蛋白家族表达情况。结果:同未转染组相比,空白质粒转染组与基因沉默组mRNA相对表达水平分别为0.97±0.03、0.31±0.10,基因沉默组mRNA表达与其它两组差异有统计学意义(P<0.05)。Notch1基因沉默组同空白质粒转染组相比细胞活性明显下降(P<0.05),同时Notch1基因沉默组抗凋亡蛋白Bcl-2表达较空白质粒转染组明显降低(P<0.05),而促凋亡蛋白Bax表达明显增加(P<0.05)。结论:Notch1基因可通过调节Bcl-2凋亡蛋白家族参与滋养细胞增殖与凋亡过程,是胎盘形成发展过程中的正向调节因子。     

全长型人Smac基因真核表达载体构建及表达

目的 构建全长型(full length,FL)人Smac基因(hSmac)真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中表达.方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人宫颈癌细胞株Hela中扩增到Smac CDs基因片段,构建重组真核表达载体peDNA3.1 -FL hSmae.PCR、酶切鉴定重组质粒正确后,通过脂质体介导将其和作为阴性对照的空载体pcDNA3.1 分别转染人肝癌细胞株(SMMC-7721).同时转染含EGFP的质粒pcDNA3.1 -EGFP.利用荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率.采用RT-PCR、western blot法检测外源基因Smac的表达.结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人Smac基因克隆成功.且鉴定证实真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac构建成功.流式细胞术检测到转染效率高达48%,荧光显微镜下也可见非常明亮的绿色荧光.无论是在mRNA水平还是蛋白水平上,转染后的细胞中外源基因Smac表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中明显表达,为研究Smac基因在细胞凋亡过程中的调控作用.以及探讨以Smac基因为基础的肿瘤基因治疗策略提代基础依据.     

丙型肝炎病毒F蛋白上调肝癌细胞HepG2中Bcl-2和Bax表达

目的研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因1b型F蛋白对HepG2细胞中Bcl-2、Bax表达的影响。方法应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增HCV 1b型的F基因,构建pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C真核表达载体,分别将pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C、pEGFP-C3(阴性对照)瞬时转染HepG2细胞,48h后抽细胞总蛋白质,蛋白质印迹法(Western blot)检测Bcl-2、Bax表达的变化。结果转染F基因的HepG2中Bcl-2表达水平略高于未转染的细胞,但Bax表达水平显著高于未转染的细胞。结论 HCV F蛋白具有调节原癌基因Bcl-2和抑癌基因Bax的特性,可能与肝癌的形成有关。     

丙型肝炎病毒F蛋白上调肝癌细胞HepG2中Bcl-2和Bax表达

目的 研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因1b型F蛋白对HepG2细胞中Bcl-2、Bax表达的影响.方法 应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增HCV 1b型的F基因,构建pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C真核表达载体,分别将pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C、pEGFP-C3(阴性对照)瞬时转染HepG2细胞,48h后抽细胞总蛋白质,蛋白质印迹法(Western blot)检测Bcl-2、Bax表达的变化.结果 转染F基因的HepG2中Bcl-2表达水平略高于未转染的细胞,但Bax表达水平显著高于未转染的细胞.结论 HCV F蛋白具有调节原癌基因Bcl-2和抑癌基因Bax的特性,可能与肝癌的形成有关.     

促凋亡因子Smac过表达增强胰腺癌Panc-1细胞化疗敏感性研究

目的探讨胞浆过表达促凋亡因子Sm ac对胰腺癌细胞Panc-1化疗敏感性的影响。方法应用RT-PCR获得Sm accDNA(不含线粒体定位序列),定向克隆入pEGFP-N1质粒载体中,经限制性酶切、PCR及测序鉴定。利用脂质体将pEGFP-N1/Sm ac重组体转染胰腺癌细胞株Panc-1,应用荧光显微镜检测Sm ac-EGFP绿色荧光融合蛋白表达;流式细胞仪测定顺铂、5-FU诱导的转染细胞凋亡率;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长抑制率。结果荧光显微镜下可见转染pEGFP-N1/Sm ac的细胞胞浆自发绿色荧光;在顺铂、5-FU作用下,N1/Sm ac转染组细胞凋亡率分别为(36.8±5.5)%、(47.6±6.9)%,明显高于未转染组(12.3±3.2)%、(19.2±4.7)%及空载体转染组(16.9±3.7)%、(22.5±5.8)%,其差异有统计学意义(P<0.01)。N1/Sm ac转染组细胞的生长抑制率亦明显高于未转染组及空载体转染组(P<0.01)。结论胞浆过表达Sm ac活性分子可明显促进顺铂、5-FU诱导的Panc-1细胞凋亡,增强其对化疗药物的敏感性,为探索基于凋亡的胰腺癌治疗新策略提供实验依据。     

巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）融合EGFP真核表达载体的构建及表达

目的 构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并鉴定其在小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞能否正确表达。方法 PCR扩增M-CSF基因，定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体，构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，脂质体介导将pEGFP-CSF转染人NH3T3细胞，以一步法RT-PCR检测其在NIH3T3细胞中的表达情况。结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白，RT-PCR检测结果显示RT～PCR扩增产物与M～CSF目的基因片段大小相符，确实源于重组质粒转录后的。nRNA。结论 真核表达重组体pEGFP-M-CSF的成功构建及在体外真核细胞中有效表达，为进一步研究M-CSF在真核细胞中的信号调控奠定了一定的实验基础。     

Bax和Bcl-2在恒河猴正常妊娠和药物流产胎盘组织中的表达研究

目的:Bax和Bcl-2是重要的凋亡调节因子,本研究主要探讨细胞凋亡与流产的关系。方 法:应用RT-PCR和原位杂交的方法检测恒河猴正常妊娠和药物流产胎盘、子宫中Bax和Bcl-2的 表达。结果:BaxmRNA在流产胎盘中的表达量明显高于正常妊娠胎盘,在胎盘绒毛滋养层细胞和基 底层蜕膜细胞均有明显表达。Bcl-2mRNA在流产胎盘中的表达量明显低于正常妊娠胎盘,表达模 式与Bax类似。结论:药物可能通过上调Bax和下调Bcl-2的表达,导致恒河猴胎盘组织和子宫基 底层凋亡细胞的数量增加,影响胎盘的正常结构和功能,从而增加了流产的危险性。     

沉默信息调节因子1小干扰RNA诱导前列腺癌细胞PC3细胞凋亡

摘要:目的　观察沉默信息调节因子1（SIRT1）小干扰RNA（siRNA）对前列腺癌细胞PC3细胞生长增殖、DNA合成、细胞凋亡和Bcl-2和Bax蛋白的表达变化,探讨SIRT1在前列腺癌发生中的可能机制。方法　体外培养PC3细胞,分空白对照组（mock组）,转染阴性对照组（scramble siRNA组）和SIRT1 siRNA转染组;Western blot检测PC3细胞中SIRT1的干涉效能;MTT法测定PC3细胞的增殖率;BrdU掺入法测定DNA合成;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测PC3细胞中细胞凋亡关键调控因子Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果　与对照组比较,SIRT1 siRNA组SIRT1蛋白表达降低（P＜0.01）,PC3细胞的增殖和DNA合成明显受抑制（P＜0.01）,细胞凋亡比例增加（P＜0.01）,Bcl-2蛋白表达减少,Bax的表达增加。结论　下调SIRT1的表达抑制细胞增殖和DNA合成,诱导前列腺癌PC3细胞发生凋亡,其机制可能与改变细胞凋亡关键调控因子Bcl-2和Bax的蛋白表达相关。     

石蒜碱诱导结肠癌HT-29 细胞凋亡机制研究

目的 探讨石蒜碱诱导结肠癌HT-29 细胞凋亡及机制。方法 不同浓度的石蒜碱处理体外结肠癌HT-29 细胞,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪和Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡;Real time PCR实验检测Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA水平;Western blot方法检测Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的水平。结果 48h时石蒜碱对HT-29 细胞IC50为8.878μmol/L;与对照组比较,1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L石蒜碱能诱导细胞凋亡(P<0.05),上调Caspase-3、Bax的mRNA和Caspase-3、Bax蛋白水平,下调Bcl-2的mRNA和Bcl-2蛋白水平,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 石蒜碱能通过调节Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达水平,抑制结肠癌HT-29 细胞生长,诱导细胞凋亡,具有明显的体内抗肿瘤作用。     

CD74小干扰RNA通过NF - κB途径诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的 观察CD74小干扰RNA（siRNA）对胃癌细胞BGC - 823细胞生长增殖、DNA合成、细胞凋亡的影响,通过检测NF - κB信号通路家族成员P65及细胞凋亡关键调控因子Bcl - 2和Bax的表达变化,探讨CD74在胃癌发生发展中的可能机制。方法 选取胃癌细胞BGC - 823进行体外培养,选取对数生长期的细胞进行后续实验。实验分成3组:空白对照组（mock组）,转染对照组（control siRNA组）和CD74 siRNA转染组。western blotting检测细胞中CD74 siRNA对胃癌细胞BGC - 823中CD74的干涉效能;MTT法测定不同分组胃癌细胞BGC - 823的增殖率;BrdU掺入法测定BGC - 823细胞的DNA合成;流式细胞术检测各组细胞的细胞凋亡情况;western blotting检测细胞中P65蛋白、Bcl - 2和Bax的蛋白表达。结果 与2组对照组比较,CD74 siRNA组CD74蛋白表达降低,BGC823细胞的增殖和DNA合成明显受抑制,细胞凋亡比例增加,P65蛋白和Bcl - 2蛋白表达减少,Bax的表达增加。结论 下调CD74的表达抑制胃癌细胞BGC - 823增殖和DNA合成,诱导胃癌BGC823细胞发生凋亡,其作用机制可能与抑制NF - κB家族成员P56的表达,进而改变细胞凋亡关键调控因子Bcl - 2和Bax的表达相关。